湿态三角褐指藻UTEX 640中大规模提取十二碳五烯酸(EPA)的研究

1、e. molina grima, a. robles medina*, a. gimnez gimnez & m. j. ibnez gonzlez湿态三角褐指藻湿态三角褐指藻utex 640中大规模中大规模提取十二碳五烯酸提取十二碳五烯酸(epa)的研究的研究组长：葛鹏鹏组长：葛鹏鹏文献：帖航文献：帖航翻译：张轩昂，刘岩，张强利翻译：张轩昂，刘岩，张强利ppt：贾冬冬：贾冬冬主讲：李正浩主讲：李正浩epa即全顺式即全顺式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸是一种多不饱和脂二十碳五烯酸是一种多不饱和脂肪酸，属于肪酸，属于-3族多烯长链脂肪酸，无色，无味，常温下以液态形族多烯长链脂肪酸，无色

2、，无味，常温下以液态形式存在，易溶于有机溶剂。具有重要的生物学功能，在预防和治式存在，易溶于有机溶剂。具有重要的生物学功能，在预防和治疗人类的心脑血管疾病、抗肿瘤、抑制肥胖、抗炎症等方面具有疗人类的心脑血管疾病、抗肿瘤、抑制肥胖、抗炎症等方面具有重要的作用。重要的作用。三角褐指藻常见的形态有卵形，梭形和三出放射形，这三种形态三角褐指藻常见的形态有卵形，梭形和三出放射形，这三种形态在不同的生长环境下可以相互转变。三角褐指藻的生长条件：在不同的生长环境下可以相互转变。三角褐指藻的生长条件：（1）三角褐指藻对盐度的适应范围很广）三角褐指藻对盐度的适应范围很广0.9-9.2%，最适盐度为，最适盐度为2

3、.5-3.2%。（。（2）最适温度为）最适温度为10-20。（。（3）适应的光照强度为）适应的光照强度为1000-8000lx。（。（4）在）在ph值值7-10的环境下均能繁殖生长。的环境下均能繁殖生长。 采用下列三个步骤从三角褐指藻中提取多不饱和脂肪酸（采用下列三个步骤从三角褐指藻中提取多不饱和脂肪酸（epa,20：5n-3）：从湿态藻泥中直接皂化并提取脂肪酸，多不饱和脂肪酸（）：从湿态藻泥中直接皂化并提取脂肪酸，多不饱和脂肪酸（pufa）的浓缩，高效液相色谱分离的浓缩，高效液相色谱分离epa。湿态藻泥的直接皂化使用。湿态藻泥的直接皂化使用koh乙醇乙醇（96%，v:v）溶液（）溶液（1h，

4、60），可以提取纯度为），可以提取纯度为91%的的epa。多不。多不饱和脂肪酸使用尿素饱和脂肪酸使用尿素甲醇溶液进行包埋，尿素与脂肪酸的比例为甲醇溶液进行包埋，尿素与脂肪酸的比例为4:1，28结晶，浓缩率可达到结晶，浓缩率可达到1.5（55.2/36.3），），epa的回收率为的回收率为79%。通。通过液相色谱纯化的过液相色谱纯化的epa纯度可达到纯度可达到95.8%，使用反相色谱柱（，使用反相色谱柱（c18，内，内径径4.7cm x 30cm），流动相为甲醇），流动相为甲醇水（水（1%，ach）80:20w/w，高，高效液相色谱可回收上样液中效液相色谱可回收上样液中97%的的epa。通过这三

5、个下游过程可回收三。通过这三个下游过程可回收三角褐指藻中角褐指藻中70%的的epa。最后，对。最后，对epa的投产进行了投资预算，一次高的投产进行了投资预算，一次高效液相色谱上样效液相色谱上样635mg的多不饱和脂肪酸可以纯化出的多不饱和脂肪酸可以纯化出326mg高度纯化高度纯化的的epa（2.46gd-1）。）。 -3家族的多不饱和脂肪酸家族的多不饱和脂肪酸epa（20:5n-3）具有重要的生物学功能，在预防和治疗人）具有重要的生物学功能，在预防和治疗人类的心脑血管疾病、抗肿瘤、抑制肥胖、抗炎症等方面具有重要的作用，因此类的心脑血管疾病、抗肿瘤、抑制肥胖、抗炎症等方面具有重要的作用，因此ep

6、a越来越越来越受到人们的关注。受到人们的关注。 制药和临床应用需要大量的高纯度多不饱和脂肪酸，但是目前，生产的高纯度的营养制药和临床应用需要大量的高纯度多不饱和脂肪酸，但是目前，生产的高纯度的营养价值高不饱和脂肪酸还不能满足临床应用，这严重阻碍了价值高不饱和脂肪酸还不能满足临床应用，这严重阻碍了-3系类的多不饱和脂肪酸在预系类的多不饱和脂肪酸在预防和治疗疾病中实验考查。因此，快速可靠的不饱和脂肪酸提纯方法被迫切的需求。防和治疗疾病中实验考查。因此，快速可靠的不饱和脂肪酸提纯方法被迫切的需求。 许多的微澡中富含多种多不饱和脂肪酸。他们商业化生产脂肪酸与鱼甘油做脂肪酸的许多的微澡中富含多种多不饱和

7、脂肪酸。他们商业化生产脂肪酸与鱼甘油做脂肪酸的来源相比的优势在于，藻类可以利用一个低价值的可控的生产过程来提高细胞内具有生物来源相比的优势在于，藻类可以利用一个低价值的可控的生产过程来提高细胞内具有生物活性脂肪酸的含量。三角褐指藻因为它生长迅速，所以它是活性脂肪酸的含量。三角褐指藻因为它生长迅速，所以它是epa的理想来源。户外管道式的理想来源。户外管道式光合反应器每天可生产光合反应器每天可生产epa47.8 mgd- ll- l。还有一个额外的优势是。还有一个额外的优势是 二十二碳六烯酸和花二十二碳六烯酸和花生四烯酸含量少，甚至可以忽略不计，这个重要的优势可以简化生四烯酸含量少，甚至可以忽略不

8、计，这个重要的优势可以简化epa回收的过程。回收的过程。 有关于从微澡中提取有关于从微澡中提取epa的研究，发表的很少。的研究，发表的很少。cohen和和cohen (1991)从紫球藻中获取从紫球藻中获取epa的用了五个步骤：脂质提取；糖脂与磷脂的分离，糖脂类部分的甲酯化；尿素包埋法的用了五个步骤：脂质提取；糖脂与磷脂的分离，糖脂类部分的甲酯化；尿素包埋法吸附甲基酯脂肪酸；常压反相色谱法分离。吸附甲基酯脂肪酸；常压反相色谱法分离。cohen等人用其相似的一种办法从蓝绿螺旋藻等人用其相似的一种办法从蓝绿螺旋藻中提取出了纯度为中提取出了纯度为90%-亚麻酸。亚麻酸。 本文作者以前开发了一种从海洋

9、等鞭金藻和三角褐藻中三步分离高纯度提取本文作者以前开发了一种从海洋等鞭金藻和三角褐藻中三步分离高纯度提取epa的方法。的方法。三步分别是（三步分别是（1）从直接皂化的冻干生物质中提取脂肪酸；（）从直接皂化的冻干生物质中提取脂肪酸；（2）尿素包埋法分离多不饱和）尿素包埋法分离多不饱和脂肪酸；（脂肪酸；（3）通过高效液相色谱法半制备分离多不饱和脂肪酸。这文研究的是用三步分离）通过高效液相色谱法半制备分离多不饱和脂肪酸。这文研究的是用三步分离法从三角褐指藻中提取法从三角褐指藻中提取epa，另外，本文试图研究了扩大利用高效液相色谱法制备，另外，本文试图研究了扩大利用高效液相色谱法制备epa的的产量。产

10、量。使用户外管道式光合反应器使用户外管道式光合反应器(200l）培养三角褐指藻（稀释率为）培养三角褐指藻（稀释率为0.04h-1），），收获时收获时4000rmp，-18离心。藻泥中含有离心。藻泥中含有20.91.3的干藻粉，平均总脂的干藻粉，平均总脂肪酸含量为肪酸含量为9.4。480g藻泥（藻泥（100g干藻粉）干藻粉）+160gkoh+96乙醇（乙醇：干藻粉乙醇（乙醇：干藻粉=1495mlg-1）氮气保护氮气保护 60搅拌浸提搅拌浸提1h以破碎细胞以破碎细胞 过滤，滤渣用过滤，滤渣用2l乙醇乙醇（96%）洗涤两次）洗涤两次 上清上清+2l水，用水，用4l正己烷分五次萃正己烷分五次萃取去除不

11、可皂化物质（有机相）取去除不可皂化物质（有机相）加加2l正己烷分八次萃取回正己烷分八次萃取回收游离脂肪酸收游离脂肪酸 hcl（1:1）将水相）将水相ph调至调至1.0 ethanol/dry和ethanol/wet换算参照bligh 和dyers 实验方案 将将25g游离脂肪酸加到热的脲素甲醇溶液（游离脂肪酸加到热的脲素甲醇溶液（ 65-70 ，100g脲素，脲素，267ml甲醇）中，在甲醇）中，在65-70下搅拌溶解直至清澈，所得溶液下搅拌溶解直至清澈，所得溶液28过夜结晶，过夜结晶，过滤除去结晶。过滤除去结晶。色谱柱：色谱柱：半制备：半制备：beckman ultrasphere rp色谱

12、柱（填料色谱柱（填料c18，5m，孔径，孔径 8nm，柱内径，柱内径1 cm x 25 cm） 制备级：制备级：waters bondapak rp色谱柱（填料色谱柱（填料c18，37-55m，孔径，孔径 12.5nm，柱内径，柱内径4.7 cm x 30 cm） 仪器：仪器：waters hplc 3000液相色谱仪液相色谱仪 （milton roy 3000光电二级管阵列检测器光电二级管阵列检测器 ）洗脱液：等度洗脱，甲醇洗脱液：等度洗脱，甲醇水（水（1%ach）80:20w/w 。所有试剂均为色谱级，水用所有试剂均为色谱级，水用 millin-q系统纯化，其他溶剂用系统纯化，其他溶剂用0

13、.2m微孔滤膜过滤，使用前进行除气微孔滤膜过滤，使用前进行除气 。流速：半制备流速：半制备30ml/min 制备级制备级60ml/min其他：甲醇其他：甲醇水溶液分配比先于脂肪酸在真空蒸发室中进行分析，洗脱出的组分与水溶液分配比先于脂肪酸在真空蒸发室中进行分析，洗脱出的组分与 sigma公司的标准品进行紫外光谱对照，以防止由于降解产生的共轭双键。公司的标准品进行紫外光谱对照，以防止由于降解产生的共轭双键。分别对藻种、皂化萃取出的液体、尿素包埋的结晶和高分别对藻种、皂化萃取出的液体、尿素包埋的结晶和高效液相色谱得到的馏分进行气相色谱分析，确定脂肪酸效液相色谱得到的馏分进行气相色谱分析，确定脂肪酸

14、的纯度和产率。进行气相色谱分析前，先将脂肪酸甲酯的纯度和产率。进行气相色谱分析前，先将脂肪酸甲酯化。下列的脂肪酸需要被考虑到脂肪酸产率的计算中：化。下列的脂肪酸需要被考虑到脂肪酸产率的计算中：14:0，16:0，16:1n-7，16:2n-4，16:3n-4，16:4n-1，18:0，18:1n-7，18:1n-9，18:2n-6，18:3n-3，18:4n-3，22:0，20:4n-6，20:4n-3，20:5n-3，24:0 和和22:6n-3。半制备高效液相色谱半制备高效液相色谱的馏分分析的馏分分析制备高效液相色谱的馏制备高效液相色谱的馏分分析分分析纯化出的纯化出的epa与与epa标准品

15、进行紫外光谱标准品进行紫外光谱对照，检测是否发生对照，检测是否发生降解降解 epa sigma patternepa fraction 本文的目标之一是提供一种从三角褐指藻中分离高本文的目标之一是提供一种从三角褐指藻中分离高纯度纯度epa的下游技术，来试图扩大商业化生产的下游技术，来试图扩大商业化生产epa的产的产量。目前，本文的数据足以证明本研究方案可以用于如量。目前，本文的数据足以证明本研究方案可以用于如此复杂的生产系统中。如果使用相同的设设备，每天的此复杂的生产系统中。如果使用相同的设设备，每天的epa产量可达到产量可达到2.46克。以表克。以表6的数据为依据，从三角的数据为依据，从三角褐指藻中每提取褐指藻中每提取1克克epa，每天的花费预算为，每天的花费预算为188美金，美金，比从鱼肝油中提取比从鱼肝油中提取epa便宜两倍，即使鱼甘油的价格已便宜两倍，即使鱼甘油的价格已经很便宜。需要指出的是，如果生产的规模超出了实验经很便宜。需要指出的是，如果生产的规模超出了实验中设定的生产规模，