基因工程菌发酵及相关技术交流

1、基因工程菌发酵及相关技术交流 ！长期以来，生物、化学、医学、发酵工程等等相关专业出身的技术人员，无论是那一种，在学校所 处。比如规模小，控制更精确，产物易失活等。工程菌的发酵由于没有一个通用方案，可能全国各家实验室、研究所、高校所用的发酵条件千差万 开这个题目的目的就是想让大家在基因工程菌发酵方面有一个平台，说说所犯的一些错误，讲讲实欢迎大家把自己在基因工程菌构建及发酵过程中所遇到的一些问基因工程菌涉及的东西很多，目前应用比较多的有原核表达系统（大肠杆菌和枯草杆菌）以及真核个人观点：基因工程药物的发酵生产也许是目前和微生物技术方 关于中国基因工程药物一、中国基因工程药物产业化发展历史新中国成立

2、近 50 年来，医药工业的发展已达到相当的规模，医药企业在 4000 家以上，其中约三分 不断增加，一个以生物高新技术为主的产业，日益发展壮大，并逐步成为一个独立的新型产业，有改革开放以来，我国政府一直把医药生物技术产业作为重点建设行业来发展，早在“七五”就 mRNA反转录成DNA构建质粒pBV867转化到大肠杆菌N6405株中表达成功。经过多年的中试研 rHUIL2 等，在其表达量上有所突破，构建的工程菌均具有产业化生产价值，为我国基因工程制从“七五”末期到“八五”中期我国研究基因工程药物以仿制为主，如rHUIFN a 2b、HGH进入 90 年代以来是我国生物技术产业蓬勃发展的时期。这一阶

3、段表现为：1 仿制产品已步入工业化生产阶段，如 HGH rHUIFNa 2b、EPO等。2重复研制产品也将进入试生产，如 rHUIFNa 2a rHUIL 2等。3重复引进产品不断涌入，如 G- SCF GM CSF EPO rHUIFNa 2b等。4基因治疗 基因诊断和人类基因组计划也在这时期同时启动。二 中国基因工程药物产业化发展现状 据不完整的统计全国称为生物技术公司的企业有 200多家，真正涉及基因工程技术的不足 10物试生产或正式生产文号的约 30家。这些企业主要分布在一些经济发达的省 市和经济开发就研究人员而言，我国生物技术经近十几年的发展，已经有一个初具规模和一定竞争力的研究我国

4、基因工程药物产业化的品种从无到有，已发展到 12种之多，见附表 1 表 2。它们是 rH已经进入临床阶段或尚在上游研制中的有 Insulin 新型 IL2 EGF rSAK rHUIL6 rH关于基因工程菌发酵的问题 若有不妥之处，请大家多指正！利用基因重组技术构建的生物工程菌的发酵工艺不同于传统的发酵工艺 ，就其选用的生物 胞本身蛋白的污染，外源基因的高水平表达，不仅涉及宿主，载体和克隆基因三者之间的相互关系，而 对影响外源基因表达的因素进行分析，探索出一套适于外源基因高效表达的发酵工艺。基因工程菌发酵问题中最重要的两个问题是菌体的高密度发酵和诱导条件的确定。菌株的高 性，它们之间的结合点就

5、是诱导条件的确定。另外，不同的发酵条件，工程菌的代谢途径也许不一和大家分享2篇文献，关于基因工程菌发酵过程中的不稳定性研究：从基因工程菌（细胞）的生长动力学模型入手，阐述了导致基因工程菌不稳定的原因及不稳定性的表基因工程菌发酵过程中的不稳定性研究.CAJ（293.7k）第二篇：关于基因工程菌发酵实验中培养基优化的数学模型对重组人丫-干扰素的发酵培养基组分进行了数值研究.采用逐步回归技术并应用统计软件 SAS对基因工程菌发酵实验中培养基优化的数学模型.CAJ（104.87k）基因工程菌的发酵与传统发酵有相关性又有独特性。许多东西是 大家可以通过这个平台，介绍自己的基因工程发酵工作学习中的体会教训

6、、以及具体从事过何种基 具体工艺的交流按大家志愿吧。A&Asmile.gif/imgA&Asmile.gif/img我介绍一下我的工作学习（与基因工程菌相关的）：1. 使用 NBS 发酵罐（20L 80L ）、B.Braun （5L 75L）、镇江（5L）;2. 主要发酵菌为：E.coli BL21 、E.coli DH5a、Pichia Pastoris 。目标产物是：蛋白或质粒;3. 高密度发酵高表达。基因工程药物的生产系统1 原核表达体系大肠杆菌是当前采用最多的原核表达体系，运用大肠杆菌表达载体符合下述标准：含大肠杆 体正确衔接表达产物的分离、纯化。大肠杆菌表达体系中尚有一些不足之处：由

7、于缺乏转录后加工机制，只能表达克隆的cDN性尚需进行复杂的复性处理很难表达大量的可溶性蛋白。2 真核表达体系与原核表达体系比较，真核表达体系如酵母、昆虫、哺乳类动物细胞表达体系显示了较大优势 葡聚糖介导转染、电穿孔法、脂质体转染及显微注射。我在做毕赤酵母转化的时候，载体的连接效率非常低，pPIC9K共享一些我喜欢的基因工程发酵相关的文献entation Using a BioFlo 110 Benchtop Fermentor.rar(276.41k)共享一些我喜欢的基因工程发酵相关的文献Ferme ntati on Basics - E.coli.pdf (82.0k)好贴！大家继续讨论，谢

8、谢!CHO细胞发酵资料Culture Using a BioFlo 110 Benchtop Bioreactor.pdf (135.25k)谁有基因工程菌所用无机盐的范围，抗生素发酵中可以找到相应xiaoxiao_ww wrote:另外，大家发现基因工程菌发酵的接种量对收获和菌体及表达量影响大吗?我也想知道！谢谢啊！ ！文献所述发酵罐培养时的接种量的大范围是4%-10%。在发酵罐罐中培养基成分不一样，代谢产物积累量较大。低于4%的接种量，会对培养时间有所延长。A&Asmile.gif/img谢谢！我是做芽抱杆菌分泌表达系统的To spore :我是做芽抱杆菌分泌表达系统的。我对芽抱系统挺感兴

9、趣的，能否介绍一下基因工程芽抱菌的构建发酵纯化能 谢谢。发酵基础。Fun dame ntals of Ferme ntati on .pdf(65.89k)Scali ng-Up from Spinn ers, T-Flasks %26 Shakers A versatie bioreactor for mammalia n and microbial cells.pdf (135.94k)skyboy wrote: 我介绍一下我的工作学习（与基因工程菌相关的）：1. 使用 NBS 发酵罐（ 20L 80L ）、 B.Braun （5L 75L ）、镇江（ 5L）；2. 主要发酵菌为： E.c

10、oli BL21 、E.coli DH5a 、Pichia Pastoris 。目标产物是：蛋白或质粒；3. 高密度发酵高表达。与摇瓶比，罐单个细胞表达水平较低，尽管单位体积表达水平高于摇瓶的，如何解决这个问题？敬正好有篇文章与大家分享。基因工程大肠杆菌发酵的研究 .pdf摘要：基因工程菌的发酵工艺研究在生物高技术产业化的发展中具有重要的意义。研究结果表明， E.coli 各种不同类型的表达启动子的工程菌，也适用于野生菌株疫苗等的生产，将对我国基因工关键词 基因工程菌,高密度发酵,人干扰素a 22b ,鲑鱼降钙素，鱼生长激素，K88K99基因工程疫 作者：巫爱珍 . 孙玉昆 .刊名：生物工程学

11、报讨论：含PL启动子的E. coli工程菌的表达及温度敏感株活菌疫苗的生产。要求细菌在较低的温 度, 二是快速升温诱导 , 要同时解决这二个问题是较困难的 , 目前不少基因工程研究室或生产厂对于 积越大（5001000L）,其表达效率愈低，并大大增加了抽提分离表达产物的工作量、设备投资、运 能源、废物废水处理量少 , 符合发展现代化生产的要求。对于不需温度诱导表达，在30 C发酵的工程菌或野生菌应用我们的工艺技术发酵，当发酵持续6 .E. coli 的不同工程菌或野生菌具有不同的特性 , 在发酵过程中我们随之对发酵条件作了相应的改应用新型的发酵设备及电脑监控来测定发酵过程的碳源、氮源消耗、产酸

12、量、产酸种类、pH、溶氧20min 即增殖一代 , 要将上述这些参数变化规律反馈于控制菌体在发酵过程中的快速增殖 , 尚难在发基因工程菌的发酵是在传统发酵基础上建立起来的 , 但它却不是以传统发酵模式加现代化设备的简skyboy wrote： To spore ： 我是做芽孢杆菌分泌表达系统的。我对芽孢系统挺感兴趣的，能否介绍一下基因工程芽孢菌的构建发酵纯化能 谢谢。我以前做过芽孢杆菌表达系统的专题讨论：/bbs/viewthread.php?tid=480比较详细，欢迎继续讨论！ ！与摇瓶比，罐单个细胞表达水平较低，尽管单位体积表达水平高于摇瓶的，如何

13、解决这个问题？敬1. 摇瓶培养与发酵罐培养，就从单个细胞而言不应该会低的多。正常培养应该是差不多的。当高表达的主代种子库建立后，实际上对于这株菌的表达量来说就已经定下来了。其实我们优 摇瓶培养在培养时间上要比罐上时间短的多，摇瓶一般在对数期中期就可以诱导，从单个细胞2. 我们在说表达量时往往不从单个细胞角度出发，而用单位体积表达量或单位菌量（ g）表达量来原核蛋白表达及纯化FAQ1、怎样提高E.coli中6 His标签蛋白的表达水平？6 x His标签蛋白的表达水平低原因可能为：目标蛋白有毒或不稳定，或者是细 情况下，有必要检查和修改表达序列。改变培养基和宿主菌也可能会有所帮助。外源性蛋白的表

14、达会使宿主菌生长迟缓。高速的转录、翻译重组蛋白所需要的代谢消耗，导致宿主 宿主菌生长的影响，在无诱导的时候的基础转录水平越低越好，并且诱导前的细菌传代数要控制在 应当避免过夜培养起始菌。先从新鲜的培养基上挑选单克隆，少量培养后，2000倍稀释大量培养含有疏水基团的重组蛋白往往对宿主菌有毒性。因此，除非有特殊的意义，应当去有些蛋白，尤其是小于10KDa的蛋白在E. coli中不稳定，可能很快被细菌中的蛋 融合蛋白；如果是纯化过程中蛋白易降解，则可以在纯化试剂中加入甘油以及蛋白酶抑制剂，并且2、如何在E. coli中表达高度毒性的蛋白？在E. coli中表达高度毒性的蛋白往往是很困难的。毒性基因表

15、达泄漏会杀死 生长。因此，要表达高毒性的蛋白，需要更高水平的lac抑制蛋白。推荐同时使用 QIAGEN公蛋白。这样协同作用，可以使诱导前的表达降低到最小的水平，因而提高成功表达毒性蛋白的可能3、如何提高E. coli中可溶性蛋白的表达量？在E. coli中表达的真核细胞蛋白往往形成不可溶的包含体。原因可能包括疏水 QIAexpress纯化系统的一个优点就在于包含体中带有 6 x His标签的蛋白可以在变性剂作用下生尽管如此，很多研究者还是发现纯化过程中的复性比较困难。另一个方法是调整表 化。如果需要更多的可溶性蛋白，诱导后降低培养温度会有所帮助。培养温度常常直接影响蛋白表 降低到0.0005m

16、M使表达水平降低90%上。并且，改变宿主菌也可能有效，因为某些菌比其它菌 蛋白所需的金属协同因子，则有必要测试不同的添加物。需要注意的是一些二价的阳离子会影响蛋4、如何在使用Ni-NTA纯化蛋白过程中去除富含组氨酸的杂蛋白？在结合试剂与洗脱试剂中加入20mM勺咪唑（即使在变性条件下），可以抑制杂蛋过量使用 Ni-NTA 也会导致非特异性的结合。因此，对应于预期的表达蛋白量来确 很多杂蛋白可能是由于非特异的离子作用引起的，因此纯化过程中确保在试剂中加杂蛋白也可能与标签蛋白结合。加入b-ME（到20mM可以解离杂蛋白与6 His标签蛋白间形成的杂蛋白与6 His标签蛋白的非特异性结合也可能是通过疏

17、水作用产生。在洗脱液 索。杂蛋白也可能是截断的标签蛋白。这样的杂蛋白可以用 Western Blot 技术很容易5、Ni-NTA 是否能用于纯化含有内部 His 标签的蛋白？是的。Ni-NTA可以与His标签结合，无论标签位于蛋白的 N端、C端或是内部。需6、是否可以把 His 标签从表达蛋白上切割掉？是的。QIAGEN提供一种载体，称为pQE-30 Xa,与pQE-30相似，但在His标签与7、哪一种抗 His 抗体最灵敏？Penta His 和 Tetra His 抗体可以与含有 6 His 标签的蛋白结合，无论标签附近 此，为了得到最佳的结果，建议在实验的开始平行比较这些抗体。QIAGE

18、N此提供一种试剂盒A也发篇文章基因工程菌高密度发酵工艺研究进展 来源：工业微生物基因工程菌高密度发酵工艺研究进展 摘 要 阐述了基因工程菌高密度发酵工艺的几个主要影响因素 , 包括重组菌构建、培养条件、生长抑 响。关键词:高密度发酵。 分批补料。 生长抑制因子 重组DNA技术和大规模培养技术的有机结合，使得原来无法大量获得的天然蛋白质能够规模生产 生抑制 , 使细胞密度达到较高水平 1,2 。大肠杆菌高密度培养工艺广泛地应用于重组蛋白的生产 ,这主要是由于大肠杆菌的遗传学和生理学 抑制物的形成 , 提供良好的生长条件是必要的。1 重组大肠杆菌构建的几个影响因素1.1 宿主菌的选择不同的大肠杆菌

19、菌株在培养条件和外源基因表达能力上存在很大差别。现在普遍应用的大肠杆菌E 达产物的形成在大肠杆菌体内有三条路径 :第一,形成稳定的天然构象 ,可溶且有活性 ,不易被降解。 对表达产物的积累以及下游分离纯化都有至关重要的作用。1.2 质粒载体重组大肠杆菌中构建的质粒载体对外源基因的表达也产生了很大影响。常用的基因表达载体有pE 质粒载体的拷贝数和稳定性不仅受宿主菌生理状况及生长环境的影响 , 而且还取决于自身的遗传特 以下两种情况八&Asmile_sad.gif/img1）分离不稳定性。 结构不稳定性。另外环境条件也会影响质粒的拷贝数，如葡萄糖、NH 4+等响，结果表明当温度在3339C、pH为

20、6.47.2、DO为40%-80%寸质粒没有丢失现象 。2 培养条件2.1 营养源高密度发酵要获得高生物量和高浓度表达产物 , 需投入几倍于生物量的基质以满足细菌迅速生长繁 萄糖（Glu ）因细菌利用快且价廉易得，已被广泛用作重组菌高密度发酵的限制性基质。一般G1 的高密度和外源蛋白的高表达。NO 3-、胰蛋白胨（Tr ）、酵母提取物（Ye ）作为氮源有利于细胞 O 3-的最佳比例为32 : 11。有些营养物质在高密度培养过程中可以控制细胞的死亡率,曾有报道另外还有实验数据表明 , 在培养基中加入重组蛋白表达的前体氨基酸和一些能量物质有利于蛋白 GSH的产量分别比不添加这两种物质提高24%5

21、1.4倍9 。 2.2 控制条件2.2.1 接种量 接种量大小的控制对很多细胞培养和代谢物积累都起到重要作用 10 。接种量 时间短,自溶也较快,所以接种量一般选择在 4%以下11 。2.2.2 溶氧浓度 溶氧浓度是高密度发酵过程中影响菌体生长的重要因素之一。大肠杆菌的生氧量大 , 一般通过增大搅拌转速和增加空气流量以增加溶氧量。随着发酵时间的延长 , 菌体密度迅速 匀,易使微生物氧中毒。在菌体中克隆具有提高氧传递能力的透明颤藻蛋白（VHB ）12。培养基2.2.3 pH值稳定的pH值是使菌体保持最佳生长状态的必要条件。由于外界的pH值变化胞释放的CO 2溶解于发酵液内与H 2O作用生成的碳酸

22、也会导致发酵液pH值的降低。在高密度 菌体生长和产物合成过程中，常用于控制pH的酸碱有HC1 , NaOH和氨水等，其中氨水常被使2.2.4 温度 培养温度是影响细菌生长和调控细胞代谢的重要因素。较高的温度有利于细菌的 突然升高细胞内就会生成某些热激蛋白 ,以适应变化的环境 ,外源蛋白相对量降低 ,给后续的纯化造 阶段, 分别维持不同的培养温度。但也会因为升温而引起质粒的丢失 , 而减少重组蛋白量。2.2.5 诱导剂及诱导时间控制乳糖基因（lac ）及其衍生的启动子被广泛地应用于重组蛋白产。已有人用乳糖代替异丙基B D硫代半乳糖苷（IPTG ）做为诱导剂14或者以一定比例混高。当浓度超过一定限

23、度时 , 就会影响菌体代谢及蛋白表达水平。诱导时间的选择也是影响外2.2.6 补料控制 重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键在于补料策略 , 即采用合理的营养流加方 除了补料技术的影响外 , 补料培养基成分及补料时间的选择对外源基因的表达也是至关重要的。如3 生长抑制因子3.1 乙酸的积累以Glu为碳源的大肠杆菌的生长，常伴随着乙酸的分泌，进而影响细胞生长长的抑制因子 17 。 乙酸的产生与细胞中的电子传递链和三羧酸循环有关。目前国外已有研究3.2 CO2的积累高密度发酵过程中，细菌代谢产物CO 2的积累也会抑制外源蛋白的表达I源,进行高密度培养，这样可以消除CO的抑制作用。4 发展与展望 随着发

24、酵控制手段的进一步发展 ,临控技术的掌握 ,发酵装置在线检测或控制物除去发酵液中有害物质 , 从而实现工程菌的高密度发酵。 基因工程菌高密度发酵技术是基因工程技术生产应用的基础 , 其产品在化工、食品、环保、医药等 作工艺,降低工业成本 ,最终使目标产物生产的规模化和产业化得以实现。第一次发这么长的文章，嘿嘿以前老板让给小弟弟小妹妹们做一个关于基因工程菌高密度发酵的报告，很是惭愧，其实我也是一八&Asmile_sad.gif/img八&Asmile_sad.gif/img八&Asmile_sad.gif/img 本科时学那点微生物及其发酵的只是基本上已经给扔了，遗憾的是本科时没有好好学学A&Asmile_cry.gif/imgA&Asmile_cry.gif/imgA&Asmile_cry.gif/imgA&Asmile_cry.gif/img不过我会努力的，努力向各位战友哥哥战友姐姐战友妹妹战友弟弟学习，哥哥姐姐弟弟妹妹要多多A&Akiss_smile.gif/imgA&Akiss_smile.gif/imgA&Akiss_smile