发酵法生产辅酶Q10研究进展及发酵设备的技术优化

1、发酵法生产辅酶Qio研究进展及发酵设备的技术优化1概述辅酶Qio是一种脂溶性的醌类化合物，化学名称为2,3-二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯基-1,4-二苯醌，别名癸烯醌、泛醌，分子式为C59H90O4,分子量为863.36,在室温下呈橙黄色结晶，无臭无味。其结构式见图10CHQcunCH.CH3(CH2 (JI C 0图1辅腮Qm结构武辅酶Qio的生理功能与其两种生化作用密切相关：一是其具有的抗氧化能力， 二是其在电子传递链上的角色，传递电子与质子，促进生成ATP。辅酶Qio还原态的、异戊二烯单体全为反式的结构比氧化态、异戊二烯单体全为顺式结构具有更高的活性和理化作用。2辅酶Qio的主要功能

2、研究进展2.1辅酶Qio在生物体细胞呼吸和能量代谢中的作用辅酶Qio在生物体中能提供或移去氧，生物体中能量代谢主要在线粒体中进 行，其产生的能量占人体总能量的95%，而辅酶Qio存在于线粒体内膜上，生物 氧化过程中电子传递必须与辅酶 Qio反应，是线粒体呼吸链限速反应的关键性物 质，辅酶Qio同时是线粒体氧化磷酸化反应中几种重要酶的辅助成分，又能阻止ATP合成代谢所需物质的减少；辅酶Qio是代谢激活剂，激活细胞呼吸，因此， 辅酶Qio在细胞能量生成，增强生物体活力方面可作为一种潜在的功能性药物或 保健食品添加剂。2.2辅酶Qio在增强人体免疫力和抗肿瘤方面的研究进展2.2.1抗种瘤药物通过测定

3、癌症及AIDS病人体内辅酶Qio浓度发现，与正常人相比其含量较 低，i994年Lockood，等研究了各种各样癌症病人包括乳房癌、前列腺癌、胰癌 和结肠癌等病人，对其体内辅酶 Qio缺乏发生率进行研究，对32位已转移至腋 窝淋巴结的乳房癌病人，经服用辅酶Qio9Omg/a并结合服用一定剂量的抗氧化剂 如Vc、Ve、炉胡萝卜素、硒、co-3、co-6不饱和脂肪酸，经一年试验，病人均未 发生肿瘤转移，其中 6 病例其肿瘤发生部分消退 .2.2.2增强免疫力1970年,首先报道了老鼠服用了辅酶 Qio能提高机体免疫细胞杀死细菌的活 力，并提高抗体反应 ;辅酶 Q1O 能增加白细胞的数量， 增加胸腺活

4、力， 激发免疫球 蛋白和抗体数量增加.1985年Folkers,等研究了获得性免疫缺陷症(AIDS)病人， 其血清中显示出较低的辅酶 Q10浓度，同时在临床上对8位成年病人经60mg/d 辅酶Q10治疗，一个月后，血清IgG含量明显提高因此辅酶Q10作为机体非特异 性免疫比强剂在抗肿瘤提高机体免疫力等方面可作为一种较好的治疗药物。2.3辅酶Qio清除自由基和抗权化功能辅酶Q10能阻止脂和蛋白质的过氧化，清除自由基。辅酶 Q10通过氧化还原 性结构的变换， 能加强细胞内膜抵抗外界氧化因子的损害， 在生物体某些部位其 作用效果与Ve相类似，而在阻止低密度脂氧化方面比 Ve、胡萝卜素及蕃茄红素 更有

5、效。辅酶Q10又是Ve增效剂，其活力再生类似于Vc的作用，是惟一的一种 天然存在的，在人体中能再生 (转化成活性形式 )的脂溶性抗氧化剂。Yokoyama K等研究了辅酶Q10对老鼠中过氧化自由基形成的影响，结果发 现经过辅酶Q10处理(每小时80mg/kg)过的老鼠其体内过氧化自由基的含量比对 照组明显降低，并由研究得出这种试剂可能保护组织中由于局部缺血而引起的伤 害，这一点与阻止组织中自由基的形成相一致；辅酶Q10还具有阻止生物体组织氧化性破坏，保护生物膜结构完整性的作用。由于辅酶Q10具有自由基清除剂和抗氧化功能，因此在人体抗衰老、保健美 容等方面具有重要的应用价值。2.4 辅酶 Q 1

6、 0在治疗心血管疾病方面的作用国际上已有日本、美国、意大利及瑞士等许多国家对辅酶Q10在心脏疾病治疗中的作用开展大量研究， 并提出其安全、 有效性的一致结论。 1970年， Folkers 首先发现充血性心力衰弱(CHF)病人中心肌内的辅酶 Q10含量降低，并提出了治 疗CHF的基本理论；在CHF病人中，心肌组织中辅酶 Q10含量要低于正常人群的 33%，缺乏程度与症状严重性有关， 与传统药物治疗心脏疾病相比较， 每天吸 入辅酶Qio在100mg/d体重，分2次服用，连续服用2个月，2/3病人心脏功能 得到明显改善。对于心脏疾病外科手术治疗后，服用辅酶Qio在比未用辅酶Qio的病人能够大大缩短

7、恢复时间；另外，辅酶 Qio能降低血液粘度，改善心脏病人 局部缺血性疾病；补充辅酶 Qio可使CHF病人外周淋巴细胞膜磷脂损伤减轻， 随之明显改善患者的心功能， 这一点可能跟促进细胞氧化磷酸化， 改善心肌能量 代谢，直接的抗氧化作用及膜稳定作用等以达到保护、 修复线粒体膜磷脂损伤作 用有关，从而能保护心肌改善心功能，由于辅酶 Qio促进能量代谢形成ATP,满 足 CHF 病人提高心脏收缩力需要足够的能量，从而增强心脏血的输出量.因此，辅酶Qio在治疗心脏病人特别是 CHF病人中能延缓心衰的发展，降低病死率， 延长病人寿命和提高患者生命质量；由于辅酶Qio改进心肌代谢，可治疗由冠状动脉窄化所造成

8、的胸腔痛，加强心脏跳动之功能；辅酶Qio还能增强心脏对缺氧 的忍耐力，有望开发作为特殊用途的保健药剂；在高血压疾病治疗中，辅酶 Qio 可降低血管收缩压及舒张压力。2.5辅酶Qio在其它方面中的应用研究进展生物体的多种疾病表征跟辅酶 Qio缺乏有关，如肌肉营养不良、肾疾病、牙 周病甚至男性不育等，辅酶 Qio 可作为这些疾病的治疗药物或辅助药物；辅酶 Qio 因影响人体利用碳水化合物代谢途径和降低血糖，因此在治疗糖尿病方面可 能有效；因辅酶Qio是线粒体内脂和碳水化合物代谢的必要物质，由此转化产生ATP 或细胞能量， 对于肥胖患者来说， 将人体中过多脂肪转化成能量， 可适当减 轻体重；辅酶Qi

9、o还能改善血脂，不影响血清电解质、肾功能。辅酶Qio在阻止和治疗细胞氧化有关的各种生理性紊乱病症， 起到抗氧化性质及在线粒体氧化磷 酸化中的重要作用。近年来，辅酶 Qio在治疗十二指肠溃疡、病毒性肝炎及促进 胰腺功能与分泌有显著效果；医学保健方面的专家主张辅酶 Qio作为一种较好的 辅助药剂在临床上加以扩大使用。正常成人日需要辅酶 Qio量宜在iom/d，在食物中鱼类、鱼油类和动物脏器 等分布较多；服用辅酶Qio不良反应较少，极少数病人可能出现如腹泻、恶心、 上腹不适或食欲减退等症状，其副反应机理有待进一步研究，服用辅酶Qio时当 剂量超过ioomg/d时，宜分开服用，含脂饮食期间服用辅酶 Q

10、io效果较好3 辅酶 Q10 的生产工艺研究进展目前，辅酶 Q10 的制备方法主要有 3 种：提取分离法、化学合成法、生物 合成法。3.1 提取分离法提取分离法主要从动物肝脏、 心肌等和植物含油种籽或嫩芽、 嫩叶中提取。 据文献报道，经醇碱皂化法从猪心渣和牛心肌渣中提取辅酶Qio，测定含量分别为75mg/kg和73.3mg/kg。大豆油中辅酶 Qio含量较高，每千克豆油平均含有 89.65 mg辅酶Qio。提取法是现代生物工程中较为传统的生产方法，它的生产成本较高，原料也不易得到，一些研究者正在探索废弃材料再利用提取辅酶Q10，以降低制备成本。3.2 化学合成法辅酶Qio化学合成法可分为全化学

11、合成法和半化学合成法2种。全化学合成法是指不以来自烟草等的茄尼醇为原料， 完全通过化学方法获得辅酶 Qio侧链 的合成方法。 该方法原料价廉易得， 产物区域选择性和立体选择性高， 但是侧链 的构建需要多次耦合，总收率低，难以实现工业化。 半化学合成法主要有侧链 直接引入法和侧链延长法， 该方法均需要以天然茄尼醇为关键原料合成辅酶 Qio，由于精品及纯品茄尼醇的价格十分昂贵，造成化学合成辅酶 Qio成本高昂，同时具有合成步骤多、 副产品多、 手性物质分离困难等缺点， 因此，化学合成法 在工业生产中受到一定限制。3.3 生物合成法生物合成法是利用微生物细胞、 植物细胞或动物细胞的生命活动而获得人

12、们所需物质的技术过程。目前，辅酶Qio的生物合成方法包括利用植物细胞培养和微生物细胞发酵两种方式。 植物细胞培养主要是以烟草组织为材料，通过 愈伤诱导、悬浮培养，产生生长速度快、辅酶Qio含量高的烟草悬浮培养细胞。国内从事辅酶Qio植物细胞培养的单位只有少数几家，也都处于初步研究阶段，还没有进入中试和工业化生产。 i977 年，日本首次实现了微生物发酵法工业化 生产辅酶Qio。应用于产辅酶Qio的主要菌种有光合细菌、土壤杆菌、红假胞菌、 裂殖酵母等，表i列出国内研究单位辅酶Qio主要菌种。该方法具有原料廉价丰 富，产物分离过程相对简单， 不存在手性问题等优点， 近年来国内已有部分企业采用该方法

13、生产，并申请了相关专利。目前我国多家企业参与开发和发酵生产，其中厦门金达威集团、神舟生物已经投入工业化生产，所生产的辅酶Qio产品已 经占据市场相当大的份额。表1国内开发辅酶 Q10主要菌种单位发酵水平mg/L菌株备注-H-r f - MA52.4放射型根瘤菌 WSH26017L发酵罐江南大学中国药科大学i56.2酵母菌HY-055L发酵罐流加补糖南京理工10.8热带假丝酵母C-1摇瓶培养浙江工业大学ii.2季也蒙假丝酵母摇瓶培养96.88鞘氨醇菌ZUTE03摇瓶培养第三军医大学20.365光合细菌MT1131摇瓶培养厦门金达威集团2000类球红细菌工业化生产神舟生物有限公司800类球红细菌S

14、henzhou6工业化生产沈阳农业大学48.44葡萄汁酵母摇瓶培养4发酵培养基对辅酶Qio发酵的影响4.1碳、氮源对辅酶Qio发酵的影响碳、氮源是微生物生长所需的重要营养因子，其中碳源是构成微生物细胞的骨架，为各种代谢提供能量；氮源提供微生物其它细胞结构的原材料。不同种类 的蛋白质，其氨基酸的种类和含量具有一定的差异，培养基中部分氨基酸的浓度对其产物具有很大的影响，不同的微生物对碳、氮源的需求也不一样。实验证明， 最佳碳源为蔗糖，其次为糖蜜和葡萄糖；最佳氮源为玉米浆，其次为酵母膏，蛋 白胨较差些。4.2生长因子和无机盐对辅酶Qio发酵的影响不同的生长因子对产物形成的影响具有一定的差异，如氨基酸

15、、核酸碱基、 维生素和天然氮化物在不同菌种中影响大小不同。潘春梅等研究了几种促进剂对放射型根瘤菌细胞生长及其辅酶Qio发酵的影响，结果表明：Vbi对辅酶Qio的合成起明显促进作用，当 Vbi添加量为10mg/L，乙酸钠2g/L，花生油2g/L 时，辅酶Qio产量达到50.7mg/L,比对照组分别提高 33%。一些金属离子也能 提高辅酶Qio的产量，袁静等研究表明适当浓度的 Co2+、Fe2+、Mg2+等对辅酶Qio 的合成具有一定的促进作用，Mg2+是辅酶Qio合成过程中的关键酶的辅基，F0 起着电子传递的作用。5发酵条件对辅酶 Qio发酵的影响5.1溶氧对辅酶Qio发酵的影响据文献报道，通气

16、量是辅酶 Q10 发酵的一个重要影响因素，大多数的辅酶 Qio发酵都为有氧发酵。对于某些菌体而言，较高的溶氧有利于辅酶 Qio的合成， 有些菌种低氧有利于辅酶 Q10 的合成。发酵的不同时期溶氧对辅酶Q10 的合成具有不同的影响， 前期菌体的快速生长， 溶氧应高些， 在细胞稳定期后， 应控制 为低氧，有利于辅酶Qio的合成。5.2 pH对辅酶Qio发酵的影响pH 是微生物发酵代谢活动中一个重要的综合指标， 是发酵中一个重要的参 考参数。 pH 对菌体的生长和代谢产物的积累有很大的影响。在生产中通过检测 和控制适当的生产pH,可以促进菌体合成辅酶 Qio。在实际生产发酵中调节 pH 具有以下几个

17、手段：（1）用碳酸钙作为缓冲剂；（2）用氨水来调节pH； （3）控 制补糖的速率。5.3温度对辅酶Qio发酵的影响温度对辅酶Qio的积累具有一定的影响，主要体现在两个方面：（1）温度既 影响菌体的生长，同时也对辅酶 Qio的生物合成具有影响，比如影响代谢途径的 方向。（2）温度影响发酵液的粘稠度，影响溶解氧的传递和基质的溶解。6辅酶Qio分离纯化由于辅酶Qio易氧化，因此在分离提取过程中要避免辅酶 Qio被氧化破坏。 比如在碱性条件下， 要加抗氧化剂焦性没食了酸。 目前采用的提纯方法为皂化分 离法和溶剂提取分离方法。6.i 醇碱皂化提取分离将制备好的发酵菌体移入圆底烧瓶内， 加入一定比例的焦性

18、没食子酸， 搅拌 均匀， 再加入一定量的氢氧化钠乙醇溶液搅拌， 此时菌体成黑色糊状， 再加入 正己烷进行回流提取， 迅速冷却至室温。 用石油醚多次萃取， 萃取液要用水洗至 中性，再以无水硫酸钠除去水分，其目的是使CoQio与烃类溶剂更好地混溶，以利于后续处理。浓缩至小体积，用硅胶吸附柱层析， 先以石油醚洗涤，除去杂质， 再以乙醚石油醚混合液洗脱， 减压蒸馏洗脱液， 得黄色油状物为无水乙醇结品， 得橙黄色桔晶即为辅酶 CoQ10 。乙醇存在时，长时间皂化会导致 CoQ10 环上的 甲氧基与乙醇的乙氧基换位，生成单或双乙氧基的衍生物，这些杂质在CoQ10产品中无法检出，为了避免这些杂质的生成，可以

19、使用 KOH 代替 NaOH 和甲醇 皂化。6.2 碱皂化法提取分离将制备好的发酵菌体移入圆底烧瓶内， 加入一定量的氢氧化钠， 加热回流， 迅速冷却，用石油醚、 乙醚或乙烷与异丙醇的混合液萃取。 然后水洗、冷析除杂、 硅胶柱层析，收集含 CoQ10 的溶液，再经浓缩，无水乙醇结品，就可得到 CoQ10 的结晶。6.3 烃类溶剂从干燥或冷冻干燥的材料中提取分离 直接用石油醚、烷、正己烷、或正庚烷提取 CoQ10 会更完全，但必须多次反 复提取或振荡几个小时，目这种方法要保证实验材料绝对干燥和破碎得足够细， 使溶剂易于渗透到材料中。 如果冷冻干燥材料己经冰冻， 则有可能在室温下的敞 开体系中吸收水

20、分，从而影响提取效率，此时需要事先加入0.5%1%甲醇到石油醚等烃类溶剂中， 后续处理同上。 此法与皂化后再提取的方法相比， 所得到的 提取物的量要少些，但它的优点是不会破坏 CoQ10。7 分析鉴定7.1 可见分光光度法根据在碱性条件下，氰基乙酸乙酯可取代 CoQ10 分子上的甲氧基产生蓝色 的原理，取少量试样和 CoQ10 标准品，分别加无水乙醇、 氰基乙酸乙酯和氢氧化 钾试液，摇匀，见有显蓝色反应时，于 620nm 波长处测定吸光度，绘制 CoQ10 的标准曲线，最后计算样品中 CoQ10 的含量。7.2 紫外分光光度法根据CoQio在275nm波长处有稳定的吸光度的特点，取 CoQi。

21、标准样溶于 无水乙醇，在 275nm 波长处测定其吸光度，制作 CoQ10 的标准曲线，再根据样 品的吸光度计算CoQio的含量。样品的紫外吸收曲线与标准品的曲线大体一致， 但由于在提纯 CoQ10 时，反复使用有机溶剂， 以及细胞内一些杂质的溶出， 故观 察到的样品紫外吸收曲线在 275nm 波长处会有一些偏离，还有一些小的杂峰， 因此用这种方法测定 CoQ10 的含量会带来一些误差。 此时，可以通过薄层层析对 粗提取液进一步提纯处理并结合紫外检测来测定 CoQ10 的含量。7.3高效液相色谱（HPLC ）分析测定将样品的粗提取液进行薄层层析等方法进一步提纯以后， 再进行高效液相色 谱分析，可以鉴定提纯效果。此时采用 HPLC 检测会发现杂质种类很少， 对 CoQ10 的测定没有干扰。 为了进一步证实， 还可以通过改变检测波长， 在另一波长下对 标准品与样品进行 HPLC 检测。同时还可以根据 CoQ10 的还原态时没有吸收峰这 一原理， 加一定量的硼氢化钠于待测样品中， 若发现刚才检测的吸收峰消失， 则 可进一步证实是CoQio，最后通过计算吸收峰的面积得出 CoQio的含量。8发酵设备的技术改进8.1 磁性搅拌使用磁性搅拌是最近发酵罐的主要技术进步之一， 这种新的改进避免了主要 由轴封及搅拌轴周围空隙所引起的染