细胞生物学实验教案

1、目录第一部分：普通光学显微镜原理与使用 .1附实验 普通生物显微镜的使用及动植物细胞观察 .6第二部分：特殊显微镜原理与使用 .8附：BX51荧光显微镜的使用 .17第三部分显微标本制作技术.20附实验 人血涂片的制作 29附实验 石蜡切片技术31附实验 冷冻切片技术 34第四部分 数码显微摄影技术 36第五部分 细胞器的分离39第六部分 电子显微镜原理与使用41第七部分 超薄切片技术47附实验 电子显微镜样品制备与观察 56第八部分 扫描电子显微镜原理结构及样品制备技术 6065第一部分：普通光学显微镜原理与使用主要内容1. 显微镜的发展2. 显微镜的光学原理3. 显微镜的几个基本概念4.

2、显微镜的结构5. 显微镜的使用6. 显微镜的维护要知道的几个重要的分辨率l 人眼：0.2mm/250mml 光学显微镜：0.2uml 电子显微镜：0.2nm1 显微镜的发明1.1 人眼：人眼观察物体的能力是有限的。一般的情况下，在25cm的明视距离内，人眼只能分辨相距0.1-0.2mm的两个物体。也就是说，当两个物体相距不到0.1mm的时候，人眼就会把它们看成是一个物体了。这个极限便称为人眼的分辨本领。人眼视锥细胞直径为4微米，对应的视角约为30秒，这个角度就是视角的极限。一般要能清晰的分辨两个点，视角须在1分以上。高1米的物体距眼睛3400米时，视角为1分。 1.2 放大镜：约在四百年前眼镜

3、片工匠们开始磨制放大镜。当时的放大镜的放大倍数只有35x 1.3 显微镜： 1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者造出类似显微镜的放大仪器。 16731677年期间，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜 19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。 1850年出现了偏光显微术； 1893年出现了干涉显微术； 1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术， 2 显微镜的光学原理2.1折射和折射率 光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则发生折射现象，这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的。2.2凸透镜的五种成象规律(1) 当物体位于透

4、镜物方二倍焦距以外时，则在象方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实象； (2) 当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在象方二倍焦距上形成同样大小的倒立实象； (3) 当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则在象方二倍焦距以外形成放大的倒立实象； (4) 当物体位于透镜物方焦点上时，则象方不能成象； (5) 当物体位于透镜物方焦点以内时，则象方也无象的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚象。2.3显微镜的成像原理 显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察。只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而已。 物体位于物镜前方，离开物镜的距离大于

5、物镜的焦距，但小于两倍物镜焦距。所以，它经物镜以后，必然形成一个倒立的放大的实像AB。 AB靠近F2的位置上。再经目镜放大为虚像AB后供眼睛观察。目镜的作用与放大镜一样。所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。 3 显微镜的几个基本概念3.1 光源：能发射光波的物体。 可见光频率范围：7.51014 - 3.91014 Hz。 真空中对应的波长范围：390nm 760nm 相应光色：紫、蓝、青、绿、黄、橙、红3.2 分辨率(鉴别距离)：显微镜能分辨的最小距离，用D表示。显微镜的鉴别距离越小，分辨率越高。 D=0.61/ nsin a/2 D：分辨率

6、 :光波的波长 N:介质折射率 :物镜孔径角3.3 孔径角：由标本上一点发出的进入物镜最边缘光线L和进入物镜中心光线OA之间的夹角a称为孔径角。3.4 数值孔径：令NA = nsin a/2, 叫物镜的数值孔径。 数值孔径与显微镜的分辨率有密切关系，l越短，NA越大，分辨率越高。3.5 放大率 在显微镜下所看到的物像和实际物体之间的大小比例叫显微镜的放大率或放大倍数。显微镜下物像的放大主要由物镜、镜筒长度、目镜所决定。适合的放大倍数决定于物镜的数值孔径，一船应为数值孔径的5001000倍。3.6 像差3.7 焦点深度 在显微镜的光轴上有一段距离范围内物体被看得清晰。超出这段距离的物体就模糊不清

7、。这段距离位于显微镜焦点的上下很小的范围之内。这段距离的上下限叫焦点深度。3.8 视场数 目镜中观察到的物像的一定范围叫视野。 显微镜的总放大率小的时候所能看到的标本的范围大，而总放大率愈大所能看到的标本的局部愈小。所以说视野与显微镜的总放大率成反比。 在同一总放大率的条件下视野也可有大小差别。这种差别决定于目镜的某些性能。首先目镜的视场光栏的直径是最主要的条件。视场光栏的直径叫目镜的视场数值3.9 工作距离 工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。 在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大。 数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。提高显微镜分辨率的方法：（1）增大物

8、镜的数值孔径在物镜和盖玻片之间充以n 较大的油，如香柏油n =1.52,不仅使n 增大，而且孔径角a 也增大。（2）用短波长的光照射如紫外光显微镜，电子显微镜。4 显微镜的结构 4.1 物镜 物镜(objective)是光学显微镜成像系统中决定其分辨率或叫分辨本领的最关键部件。 (1)消色差物镜(achromat) 色差校正使可见光中红光和蓝光聚焦于一点，而黄绿光则聚焦于另一点。能够消除光谱中红光和蓝光所形成的色差。这种物镜与目镜配用时可达到消色差物镜所要求的光学性能。 (2)复消色差物镜(apochromat) 是性能最高的物镜。能消除可视光中黄、红、蓝即包括几乎所有谱线在成像过程中所造成的

9、色差。 (3)平象物镜 它们所成的影象基本上是平的，象场弯曲很小，不会发生视野中心与边缘不能同时准焦的现象，因此对目视观察及显微摄影都极为方便。平象物镜由于将弯曲的影象展平，在同样放大倍数下它成的影象比用一般物镜要大点。在平象物镜的金属外框上，刻有Flanach、planapo、plan等字样。 (4)相差物镜 相差物镜(Phasencontrast objective)的一个透镜片上喷涂着一层环状金属膜板叫相位板。相位板是相差显微镜的关键部件。它和相差显微镜的聚光镜上的的环状光栏相配合使用。有关位相板涂料的性质和作用原理在以后详述。 外壳上刻有Ph标记 4.2 目镜 目镜的作用是把物镜放大的

10、实象再放大一级，并把物象映入观察者的眼中，实质上目镜就是一个放大镜。显微镜的分辨率能力是由物镜的数值孔径所决定的，而目镜只是起放大作用。对于物镜不能分辨出的结构，目镜放的再大，也仍然不能分辨出。显微镜下观察到的标本大小：标本的视场直径 = 目镜视场数 / 物镜倍率例: 10X目镜视场数为22 物镜为40X 视场直径 = 22 40 = 0.55 mm4.3 聚光镜 聚光镜装在载物台的下方。小型的显微镜往往无聚光镜，在使用数值孔径0.40以上的物镜时，则必须具有聚光镜。聚光镜不仅可以弥补光量的不足和适当改变从光源射来的光的性质，而且将光线聚焦于被检物体上，以得到最好的照明效果。 聚光镜光栏 所谓

11、光栏，从广义的角度可指一切限制入射光束截面的框孔都可认为光栏。 聚光镜光栏作用 （1）改变聚光镜的数值孔径以便与物镜的数值孔径相匹配，可调整图象的分辨率和反差。 （2）辅助调整亮度。5 光学显微镜的使用（1） 实验时要把显微镜放在座前桌面上稍偏左的位置，镜座应距桌沿 67 cm左右。（2） 打开光源开关，调节光强到合适大小。（3） 转动物镜转换器，使低倍镜头正对载物台上的通光孔。（4） 将所要观察的玻片放在载物台上，使玻片中被观察的部分位于通光孔的正中央。（5） 先用低倍镜观察（4X）。观察之前，先转动粗动调焦手轮，使载物台上升，物镜逐渐接近玻片。需要注意，不能使物镜触及玻片，然后，通过目镜观

12、察，并转动粗调焦手轮，使载物台慢慢下降，直到看清物像。如果像偏离视野，可慢慢调节载物台移动手柄。（6） 瞳距调节：左右推拉目镜，使两目镜距离与自己两眼距离相等。（7） 屈光度调节（8） 高倍物镜观察：把物像中需要放大观察的部分移至视野中央。将高倍物镜转入光路（一般具有正常功能的显微镜，低倍物镜和高倍物镜基本齐焦，在用低倍物镜观察清晰时，换高倍物镜应可以见到物像，但物像不一定很清晰），微动调焦手轮进行调节。（9） 根据需要调节孔径光阑的大小或聚光器的高低，使光线符合要求（一般将低倍物镜换成高倍物镜观察时，视野要稍变暗一些，所以需要调节光线强弱）。（10） 观察完毕，应先将物镜镜头从通光孔处移开，

13、并检查物镜是否沾水沾油，检查处理完毕后即可装箱。6 光学显微镜的维护 （1） 显微镜要轻拿轻放。（2） 严禁将表面有水的载片放到显微镜上。（3） 从低倍转入高倍应能看到图象，否则需转入低倍另行调节、查找原因。（4） 每次使用完毕后将将光源亮度调至最低。（5） 临时不用显微镜只需将光源亮度调至最低而无需关闭。忌频繁开关显微镜电源。（6） 镜头脏污只能用专用工具经专门程序清洗。（7） 使用完毕等灯箱冷却后罩上防尘罩或放入箱内，并存于干燥无尘处。注意（1） 塑料表面勿用乙醇乙醚混合液擦洗。（2） 严禁用干擦镜纸擦拭镜头。（3） 物镜严禁拆卸并防止振动。（4） 打开电源前应思考题（1） 在使用高倍镜时

14、，如果把标本片放反了，将会出观什么问题？为什么？（2） 在低倍镜调节焦距时。当视野中出现了能随标本片移动而移动的颗粒或斑纹。是否只要调节推进器将标本对准物镜中央，就一定能观察到标本的物像?为什么? 高倍镜呢？（3） 你如何分析判断视野中所见到的污物点是在目镜上? （4） 用显微镜观察标本,为什么定要从低倍镜到高倍镜再到油镜的顺序进行? （5） 在低倍镜下已看到物像。在转换高倍镜时却直接转换不过来，试分析可能有哪些原因? 附实验 普通生物显微镜的使用及动植物细胞观察一、实验目的 1 掌握普通生物显微镜的使用与维护方法； 2 了解各种动植物细胞的形态、结构、特点。二、实验原理三、实验材料 各种动植

15、物玻片标本四、实验方法 1 将显微镜从显微镜柜中轻轻拿出，右手拿镜臂，左手托住底座。把显微镜放在座前桌面上稍偏左的位置，镜座应距桌沿 67 cm左右。 2 先检查显微镜的电源开关是否关闭，亮度调整电位器是否调至最小。 3 将电源插头插入插座，打开光源开关，调节光强到合适大小。 4 转动物镜转换器，使低倍镜头正对载物台上的通光孔。 5 将所要观察的玻片标本放在载物台上，使玻片中被观察的部分位于通光孔的正中央。6 先用低倍镜观察（4X）。观察之前，先转动粗动调焦手轮，使载物台上升，物镜逐渐接近玻片标本。需要注意，不能使物镜触及玻片标本，然后，通过目镜观察，并转动粗调焦手轮，使载物台慢慢下降，直到看

16、清物像。 7 如果像偏离视野，可慢慢调节载物台移动手柄使要观察的部位位于视野中心。 8 瞳距调节：左右推拉目镜，使两目镜距离与自己两眼距离相等。 9 屈光度调节 10 高倍物镜观察：把物像中需要放大观察的部分移至视野中央。将高倍物镜转入光路（一般具有正常功能的显微镜，低倍物镜和高倍物镜基本齐焦，在用低倍物镜观察清晰时，换高倍物镜应可以见到物像，但物像不一定很清晰），微动调焦手轮进行调节。11 根据需要调节孔径光阑的大小或聚光器的高低，使光线符合要求（一般将低倍物镜换成高倍物镜观察时，视野要稍变暗一些，所以需要调节光线强弱）。12 继续观察：低倍物镜转入光路，换标本。13 观察完毕，应先将物镜镜

17、头（或高倍镜头）从通光孔处移开，并检查物镜是否沾水沾油，检查处理完毕后即可装箱。五、实验要求 1 练习将两眼视野重合； 2 保持两眼同时睁开； 3 注意屈光度调整； 4 注意聚光镜与聚光镜光栏的调整。第二部分：特殊生物显微镜的原理与使用主要内容l 暗视野显微镜：微粒外观（细菌记数等）l 相差显微镜：活细胞标本（细胞培养、膜片钳等）l 偏光显微镜：双折射物质（晶体检测）l 微分干涉显微镜（DIC）：活细胞等（细胞培养，显微操作等）l 荧光显微镜：物质鉴定（抗体、抗原、荧光原位杂交等）l 激光共焦扫描显微镜：1 暗视野显微镜l 根据丁达尔效应原理设计的一种在黑色背景条件下观察被检物体的显微镜l 观

18、察到明场看不到的极其微小的物体l 最高分辨率可达0.004微米1.1 原理 丁达尔现象：在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这就是微粒发光。 暗视野显微镜就是利用微粒发光原理设计的。1.2 结构特点 使用中央遮光板或暗视野聚光器（常用的是抛物面聚光器），使光源的中央光束被阻挡。不能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。1.3成像特点及优缺点 在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像，并非物体本身，所以只能看到物体的存在

19、和运动，不能辨清物体的细微结构。但被检物体为非均质时，并大于12波长，则各级衍射光线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。 一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨0.004um以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最大的分辨力为0.2um)所不具有的特性，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。1.4 应用：微小粒子、细菌形态、细菌记数，透明标本观察等。1.5 暗场显微镜的要求（1）要求载玻片和盖玻片必须无疵痕和灰尘（2）物镜前透镜必须清洁无尘（3）载玻片和盖玻片厚度必须绝对符合要求1.6暗场观察方式调节(1)换上暗场聚光镜（干燥系或油浸系）并在聚光镜透镜上表面滴上镜头

20、油。向上缓慢调升聚光镜，使镜头油与载玻片底面相接触后。(2)将视场光阑适当缩小，用10X物镜找到被检物体，同时在视场中看到视场光圈的轮廓象。上下缓慢调整聚光镜，使视场光圈像清晰可见。(3)视场光圈如不在视野中央，可利用聚光镜外侧两个调节螺丝进行调整，再将其开大到相应位置。2 相差显微镜2.1 原理l 光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位(指在某一时间上光的波动所能达到的位置)的不同。l 当光通过物体时，如波长和振幅发生变化，人们的眼睛才能观察到，这就是普通显微镜下能够观察到染色标本的道理。而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部微细结构的折射率和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变

21、化，仅相位有变化(相应发生的差异即相位差)，而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。l 相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相位差变成振幅差(明暗差)，同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。因此可用以观察活细胞或未染色标本。2.2结构特点 l 相差显微镜与普通显微镜的主要不同之处是：用环状光阑代替可变光阑，用带相位板的物镜(通常标有PH的标记)代替普通物镜，并带有一个合轴调节用的望远镜。l 环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。l 相位板安装在物镜的后焦面处，相板装有吸收光线的吸收膜

22、和推迟相位的相位膜。它除能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使亮度发生变化的作用。l 调轴望远镜是用来进行合铀调节的。相差显微镜在使用时，聚光镜下面环状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上，必需调节光阑的亮环和相板的环状圈重合（共轭重合），才能发挥相差显微镜的效能。否则直射光或衍射光的光路紊乱，应被吸收的光不能吸收，该推迟相位的光波不能推迟，就失去了相差显微镜的作用。2.3使用方法（1）相差装置的调换安装 卸下普通显微镜使用的聚光器，将环状光阑装在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面，它可吸收红色和蓝色光，使波长范围小的单色光线进行照明，并有吸热作用，能使相差观察获得良好的效果。再从转换

23、器上旋下普通物镜，换上相差物镜。 （2）调焦 打开光源，旋转集光器转盘，将“0”对准标示孔，使普通聚光器部分进入光路。先使用低倍相差物镜，按普通显微镜操作方法进行对光和调焦。 旋转环状光阑，使光阑的直径和孔宽与所使用的相差物镜相适应，如相差物镜为40X时应用40X标示孔的光阑。（3）合铀调整 拔出目镜，插入合铀望远镜，一边从望远镜向内观察，并用左手固定其外筒；一边用右手转动望远镜内筒使其上升，当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的暗环，此时可将望远镜固定住。再升降集光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与暗环一致，然后左右前后调节环状光阑聚光器上的调节钮，使两环完全重合。 （4）观察 换回目镜，按

24、常规要领进行观察。在更换不同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹配的环状光阑。2.4用途 用于观察组织培养中活细胞形态结构。活细胞无色透明，一般光镜下不易分辨细胞轮廓及其结构，组织培养研究常用的是倒置相差显微镜。3 偏光显微镜l 依据波动光学原理观察和精密测定标本细节,或透明物体改变光束的物理参数,以此判别物质结构的一种显微镜l 分辨率可达0.04微米l 将普通光改变为偏振光进行镜检,以鉴别某一物质具有单折射性(各向同性)或双折射性(各向异性)3.1、偏振光与自然光3.1.1横波的偏振性光矢量的振动方向总与光的传播方向垂直，在垂直于光传播方向的平面内,可有不同的振动方向。3.1.2线偏振光-光

25、矢量只在某一固定的方向上振动。3.1.3自然光 普通光源发出的光,在垂直于传播方向的平面上,所有可能方向的光矢量E 的振幅都相等。3.2 起偏和检偏 起偏：使自然光（或非线偏振光）变成线偏振光的过程。检偏：检查入射光的偏振性的过程。双折射现象：一束光射入各向异性晶体后有两束折射光的现象。尼科耳棱镜。 在生物样品中，肌肉纤维、骨骼和牙齿等具有各向异性，淀粉粒、染色体和纺锤体等具有双折射性，因此被用于组织细胞的化学研究。寻常光线(o光):遵守折射定律。对于晶体一切方向都具有相同的折射率，且在入射面内传播。非常光线(e光):不遵守折射定律。它的折射率随方向而变化，并且不一定在入射面内传播 。o光和e

26、光都是线偏振光,且振动方向相互垂直二向色性：某些晶体（电气石、硫酸金鸡钠碱晶体等）对光振动有强烈的选择性吸收能力，这种性质称为二向色性。如电气石晶体对自然光的某一振动方向上的光振动几乎完全吸收，而垂直于该方向的光振动只稍微减弱后通过。旋光现象：线偏振光通过某些透明介质后，它的光振动方向将绕着光的传播方向旋转某一角度j 的现象，称为旋光现象。这种介质称为旋光物质。如石英、糖、酒石酸钾钠等。3.3用途用于研究组织晶体物质及纤维等的光学性质.4 微分干涉相差显微镜（DIC）l 无色透明活体标本的细微结构l 图象呈浮雕状的立体感l 观察效果更加逼真4.1 原理 通过特制的棱镜将偏振光分解相互垂直，强度

27、相等的光束，光束载极近的两点（小于显微镜的分辨率）上通过被检物体，从而在相位上略有差别，使图象呈现出立体三维感觉。4.2 特点可以使被检物体产生三维立体感觉观察效果更直观无须特殊物镜，与荧光观察配合更好可以调节背景和物体的颜色变化而达到理想的效果。5 荧光显微镜5.1 原理l 荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。 l 荧光显微镜的基

28、本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。l 什么是荧光：物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。l 显微镜荧光利用光源激发光化荧光l 荧光的种类：自发荧光（固有荧光）二次荧光l 荧光的性质： 吸收光，必需有激发光源 荧光波长激发波长（损失热能） 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率5.2 荧光显微镜的种类： 透射式（现在的荧光显微镜主要是落射式） 落射式5.3荧光显微镜主要部件落射式吸

29、收滤色镜激发滤色镜分色镜汞灯l 汞灯光源激发分色吸收l 激发滤色镜l 分色镜l 吸收滤色镜l 荧光光源: 一般采用超高压汞灯(50W一200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。l 每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免干扰荧光和损伤眼睛。二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光

30、色彩。两种滤光片必须选择配合使用。5.4 使用方法 打开灯源，卤素灯和超高压汞灯，高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点，且在预热期间勿关闭。选择滤色片组合放置标本，寻找观察点，调焦。关闭卤素灯，此时可观察到样品发出的荧光。观察结束关闭高压汞灯。高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经10分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。5.5 用途 观察标本中的自发荧光物质或以荧光素染色或标记的细胞和结构。 （1） 标本中的荧光物质在紫外线激发下产生各种颜色的荧光，借以研究该荧光物质在细胞和组织内的分布。组织中的自发性荧光物质如神经细胞和心肌细胞等内的脂褐素呈棕黄色荧光，肝贮脂细胞和视网膜色素上皮细胞内

31、的维生素A呈绿色荧光，某些神经内分泌细胞和神经纤维内的单胺类物质（儿茶酚胺、5羟色胺、组胺等）在甲醛作用下呈不同颜色的荧光，组织内含有的奎宁、四环素等药物也呈现一定的荧光。（2） 细胞内的某些成分可与荧光素结合而显荧光，如溴化乙锭与吖啶橙可与DNA综合，进行细胞内DNA含量测定。 （3） 荧光显微镜更广泛用于免疫细胞化学研究，即以异硫氰酸或罗丹明等荧光素标记抗体（一抗或二抗），用该标记抗体直接或间接地与细胞内的相应抗原结合，以检测该抗原的存在与分布。5.6附：荧光显微镜的应用实例 用荧光显微镜观察口腔上皮细胞的线粒体和细胞核荧光探针： Hoechst33342是一种亲脂性物质，可跨膜进入活细胞

32、，与DNA特异性结合，它主要结合在富含AT区域的DNA小沟部分。结合DNA后荧光大大增强，最大激发光波长约为350nm, 最大发射光波长约为461nm。可用于活细胞观察，不需要对细胞作固定及透化处理。 罗丹明123是一种亲脂性阳离子荧光探针，也能穿过活细胞的膜。能特异的标记上线粒体。它的最大激发光波长约507nm，最大吸收光波长约为529nm。可用蓝光激发，被标记的线粒体发出绿色荧光。仪器、材料和试剂仪器：荧光显微镜，37温箱，微量移液器材料：口腔粘膜上皮细胞，载玻片，盖片，牙签，滤纸条试剂：PBS(pH 7.4) Ho.33342 （10g/mL，溶于PBS) 罗丹明123 （10g/mL，

33、溶于PBS)实验 步骤（1）在2张载玻片上分别滴加一滴PBS溶液。（2）用牙签刮取口腔上皮细胞，分别涂于2张载玻片上（牙签在液滴中搅匀）。（3）在涂细胞处分别滴加10g/mL的Hoechst.33342或10g/mL的罗丹明123一滴。（4）盖片室温暗处孵育1020分钟。（5）荧光观察。6 激光扫描共焦显微镜技术6.1工作原理：激光扫描显微镜是建立在光学显微镜及各种扫描显微镜基础上的一种新型的扫描成象系统。利用聚焦的激光束在样品表面扫描，同时利用光电检测器件接收样品反射光（或透射光），样品结构的变化使反射光（或透射光）强度改变，因而使光电检测器的输出电流改变，经信号处理，同步显示在计算机屏幕上

34、。 6.2激光扫描共焦显微镜与传统显微镜的区别（1）抑制图像的模糊，获得清晰的图像。（2） 具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片。（3） 增加侧向分辨率。（4）由于点对点扫描去除了杂散光的影响。（5）对切片厚度无特殊要求 样品的最大厚度: 取决于物镜的NA、物镜的工作距离、激光的穿透力、样品的透明度、Z轴的最大移动范围(166mm、Z-wide)。 样品的最小光切厚度: 取决于物镜的NA、针孔大小、 Z轴的最小移动步距（40nm）、 Z轴的分辨率（0.35 mm）。 6.3激光扫描共焦显微镜的设计特点:（1）点照明，激光光源。（2）具有照明小孔和探测小孔。（3）照明小孔和探测小孔共轭(共

35、焦), 共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面。（4）具有扫描系统 逐点扫描成像。（5）无损伤、连续光学切片，显微“CT”。（6）真正的三维重组。（7）具有多个（四个） 荧光通道，可同时探测多个被标记物 。6.4激光共聚焦显微镜的基本功能三大功能：采集图象、荧光信号定性和定位、定量测定荧光强度。6.4.1采集和处理图象 分荧光图象和光镜图象，只有荧光图象才是真正的共焦图象。 激光扫描共聚焦显微镜的成像特点： （1）保持样品的完整性（光切片）。 （2）采集多重（波长）荧光分解及合成图象。 （3）采集的荧光图象比普通荧光显微镜的质量好。 （4）可只选择感兴趣的区域和深度进行扫描。 （5）获

36、取三维重建图象。 （6）获取透射光及反射光图象。6.4.2 荧光分子的定性和定位 激光扫描共聚焦显微镜所观察到的样品的荧光可分为三类：样品内源性已知荧光；通过外加已知荧光标记物获得荧光；样品内源性或外源性的未知荧光。 定性：鉴别并分离出各待测物质的特异的荧光信号使之成像。 定位：确定这些荧光信号在样品中的位置，分为： （1）单荧光定位 样品染色单一，过程简单，干扰少，可在蓝绿红任一波长范围内选用单荧光探针(图示蛋白分布在细胞膜的荧光图象)（2）多重荧光标记共定位（3）荧光和透射光共定位 6.4.3定量测定 主要项目包括： （1）图象中任意区域的荧光强度。 （2）荧光强度随时间、空间及波长的变化

37、曲线和数据。 （3）图象内的几何参数，包括面积、厚度、空间距离、体积等。 分：动态测量和静态测量 7 作业l 制作低倍镜和高倍镜观察用的中央遮光板。l 为什么说倒置、相差显微镜是观察培养活细胞的最有效显微镜? l 荧光显微镜的两种滤光片各起什么作用? 附：BX51荧光显微镜的使用使用人员须知1.BX51荧光显微镜是日元贷款项目购买的大型仪器，使用者需经管理人员同意后方可使用，并按照要求认真填写大型仪器使用记录。2.开始使用前先填写使用记录中的开始时间，并签名（务必先填写）。需用荧光观察的，同时记录荧光电源上的时间累计起始数值。3.荧光光源使用请先阅读荧光观察部分。4.保证载玻片清洁，上下不能含

38、水或其他液体。5.严格按照操作规程进行操作。6.使用完毕后将物品整理好，补充使用记录，冷却10min后盖好防尘罩。7.违反规定者，初次停用1周，第二次停用1个月，第三次违反不得再使用本仪器。透射光明场观察步骤（各部分位置见附图）1.检查光强调节钮是否在最小位置2.打开电源开关3.选择光路目镜镜座部分（只进行观察拉杆全部推入，观察和照相拉杆放至中央，只进行照相全部拉出）分光镜组件部分转到5（BF）检偏器（拉出光路） 聚光镜部分（多功能转盘转至BF，起偏器拉出光路）4.将4X物镜转入光路（注意：只能通过图中8进行转换，勿接触镜头）5.放样品于载物台上6.调焦7.调节光强8.转入10X物镜9.调焦1

39、0.调节瞳间距11.调节屈光度（短时间使用可不调）12.调节孔径光阑（参考数值4X物镜0.1，10X物镜0.3，20X物镜0.5，40X物镜0.6）13.转入所需物镜（必须在10X物镜看清标本情况下方可转入更高倍物镜）14.调焦（若看不到标本请转入10X物镜重新进行，禁止在高倍看不到标本情况下盲目调焦）15.调节光强16.开始观察附图：荧光显微镜各部分位置图诺马斯基微分干涉衬（DIC）观察步骤 DIC用于未染色标本观察，图像有较强的立体感1.检查光强调节钮是否在最小位置2.打开电源开关3.选择光路目镜镜座部分（只进行观察拉杆全部推入，观察和照相拉杆放至中央，只进行照相全部拉出）分光镜组件部分转

40、到5（BF）检偏器（推入光路） 聚光镜部分（多功能转盘转至与物镜放大倍数相应位置，起偏器推入光路）4.将4X物镜转入光路（注意：只能通过图中8进行转换，勿接触镜头）5.放样品于载物台上6.调焦7.调节光强8.转入10X物镜9.调焦10.调节瞳间距11.调节屈光度12.调节孔径光阑（参考数值4X物镜0.1，10X物镜0.3，20X物镜0.5，40X物镜0.6）13.转入所需物镜（必须在10X物镜看清标本情况下方可转入更高倍物镜）14.将多功能聚光器转到与所用物镜倍数相适应位置15.调焦（若看不到标本请转入10X物镜重新进行，禁止在高倍看不到标本情况下盲目调焦）16.调节光强17.稍稍转动检偏器旋

41、钮，使图像效果最佳（一般无需调节）18.开始观察反射荧光观察步骤注：荧光所用光源为高压汞灯，一只汞灯价格约2500元，寿命约200-300小时，且不能频繁开关，最好集中观察。1.打开荧光电源组件主开关（注意：荧光电源打开后约5-10min达到稳定；一旦启动，15min内不能关闭；关闭后要再次启动，至少等汞灯完全冷却，约需10min）2.按照透射光明场观察步骤找到要观察的部位3.关闭显微镜部分电源开关（不是荧光电源开关）4.打开光闸5.选择激发模块（根据所需激发光波长选择与之匹配的激发模块1-4）6.调节荧光光路视场光阑（要求不高时可不调节）7.调节荧光光路孔径光阑（要求不高时可不调节）8.选择

42、所需ND滤光片（若荧光过强或荧光易衰减可选择使用，见附录1）9.转入所需物镜（必须在10X物镜看清标本情况下方可转入更高倍物镜）10.调焦（若看不到标本请转入10X物镜重新进行，禁止在高倍看不到标本情况下盲目调焦）11.开始观察第三部分 显微标本制作技术一、实验原理 显微标本的制作技术是组织学，胚胎学，生理学及细胞学等学科研究观察细胞、组织的生理、病理形态变化的一种主要方法。大多数的生物材料，在自然状态下是不适合显微观察的，也无法看到其内部结构。因为材料较厚，光线不易透过，以致不易看清其结构，另外细胞内的各个结构，由于其折射率相差很小，即使光线可透过，也难以辩明。但在经过固定，脱水，透明，包埋

43、等手续后就可把材料切成较薄的片子，再用不同的染色方法就可以显示不同细胞组织的形态及其中某些化学成份含量的变化，就可以在显微镜下清楚的看到其中不同的区域组分状态，切片也便于保存，所以是教学和科研中常用的方法。二、实验方法 生物显微制片有许多不同的方法，一般可分为非切片法与切片法两大类： 非切片法有涂片、铺片、压片、磨片、整装片等。 切片法又包括石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法等。 显微制片技术虽是生物学中很基本的操作技术，但由于生物材料的个体差异，化学试剂的多样性，因此操作技术相当细致而复杂，方法也很多，每一步骤的失误都可导致整体的失败，因此需要耐心细致，不断总结经验，才能得到较好的结果。

44、1非切片法 即不用切片机，不经切片手续而制成切片的方法，根据材料性质的不同，有不同的处理方法，该类方法操作简单快捷，其中铺片法，封藏法可使原有组织结构不被破坏，涂片法，压片法弥补了用包埋，切片法所不可能观察清楚的不足，因此是显微标本制备的中常用的手段。 1.1 涂片法 主要用于血液、精液、尿液、痰液、微生物等不能切片成薄片的液态颗粒性材料，可在载玻片上涂成单层细胞，再经固定，脱水，染色等手段制成永久标本。1.2 铺片法 主要用于动、植物组织的表皮层观察，可活体取待观察动、植物组织，用尖镊子撕去一层表皮，迅速平铺在载玻片上。 如: 洋葱表皮细胞的铺片制备。1.3 压片法 一些较幼嫩，柔软的材料可

45、将其置载玻片上，用小解剖刀将其分散，加染料一滴，再盖上盖玻片，用拇指垂直用力挤压，使组织散成一薄片，再进行观察，如植物根尖观察染色体，花粉粒观察发育阶段等。1.4 离析法 该方法是利用化学试剂使组织的细胞间质溶解，使细胞能分散成单个个体。经染色，脱水，透明即可观察其个体形态，适用于肌肉，叶片，茎等部位。1.5 磨片(Ground section) 用于很坚硬的组织，如骨和牙。2 、切片法 切片法是必须依靠手或切片机将组织切成薄片来进行观察的方法，为了能清晰地观察到动、植物的组织结构及细胞形态，必须先经过一系列步骤将组织内渗入某些支持物质，使组织变硬以利于切成薄片，根据所用支持剂的种类不同，可分

46、为徒手切片法，石蜡切片法，火棉胶切法，冰冻切片法等类型，切成薄片后还需要去蜡，染色，脱水，透明等步骤，将其制成永久标本。 下边以石蜡切片为例，介绍显微标本的制备方法。2.1 取材 根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要求新鲜、准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、干枯。 所采集材料应立即放入固定剂，并编号，注明采集时间、地点、名称、组织部位，所取组织块要大小适当，即要能说明问题，又要考虑固定剂的穿透能力。 一般组织学取材稍大，细胞学取材稍小，植物组织取材稍小，动物组织取材要稍大。2.1.1动物的麻醉和杀死 从活的动物体上采取材料不象采集植物材料那么容易，因为在不施加麻醉的情况下，有的动物会收缩

47、(如蚯蚓、水蛭)，有的会骚动(如蛙、鼠)，使我们无法下手。但制片所需的材料又要求越新鲜越好，尤其是细胞学方面的研究对材料的新鲜程度要求更严。因此，要割取生活着的动物组织，在一般情况下，就要对动物施行麻醉，然后再割取材料加以固定。但是，所用的麻醉药品，必须以不影响细胞结构为原则。 若是一般的组织学制片，要求不太严格的话则可将动物先杀死然后速取其组织进行固定。蛙、蟾蜍、鼠等较小的动物，可用断头法杀死，即用普通剪刀剪断颈部。较大的动物，如大竺鼠、免、猫等可用木槌猛击头后部，使其昏倒，或用50m1的注射器从耳静脉向心脏注入空气，使动物发生急性空气栓塞痉挛而死。 上述动物若需麻醉后取材，则可用脱脂棉球蘸

48、氯仿或乙醚、置于动物的鼻尖部，令其吸入麻醉。大动物(狗、猴等)应用氨基甲酸乙酯作静脉注射麻醉剂量一般为每kg动物体重用1 g。麻醉后的动物也需放血后进行取材固定。 昆虫等小动物可投入充满氯仿或乙醚蒸气的大口瓶中，令其麻醉。若要杀死，可将其投入含氰化钾的毒瓶中。 2.1.2动物组织块的切割 割取动物组织块时，需注意以下几点： 第一，要考虑所取的材料应包括各脏器的重要结构或全部结构，如消化管就应包括粘膜、粘膜下层、肌层和外膜四层结构。若所取的器官太大，不易全部制片时，则可切取能代表该器官的部分材料，如狗的肾脏，可切取包括皮质、髓质和肾盂的一部分为材料。 第二，应注意切割方向如在管状器官(肠等)取材

49、时，一般是取其横切面制片，但要观察小肠的环行皱壁时，就应取其纵切面制片。 第三，组织块必须切得小而薄。细胞学制片的组织块不能超过2mm，一般组织块的大小以0.5*0.5*0.2cm为宜，柔软组织不易切小,可先取稍大的组织块固定2 - 3h。等组织稍硬后再切成薄的小块继续固定。2.2固定 割取组织块后，应立即进行固定。 固定是制片极为关键的一个步骤，制片质量的优劣。除与材料的新鲜程度有关外，还取决于最初的固定是否适当和完全。 2.2.1固定的意义 新鲜的组织被割取后,由于细胞内酶的作用和细菌的繁殖，可引起组织的自溶和腐败。因此，割取组织块后，应立即采用一 种方法将组织尽可能保持原有的形态结构，且

50、有利于保存和适于制片的操作，这一步骤称为固定。固定的目的和作用在于：防止组织自溶和腐败；使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀保存下来从而保存细胞的各种组成成分使其保持与生活时相近似的形态和结构；因沉淀及凝固的关系，使细胞内不同的成分产生不同的折光率，造成光学上的差别使原来在生活情况下看不清楚的结构变得清晰易见，且有的固定剂还有助染作用(如醋酸、苦味酸)，从而使细胞各部易于染色；固定剂还兼有硬化作用，使柔软组织硬化而不易变形，有利于操作。 2.2.2固定的方法 固定有物理方法和化学方法两种。 物理方法固定有干燥、高热和低温骡冷等。例如，血液涂片就是干燥固定；细菌涂片可用加热法固定；许多组织化

51、学反应的制片是以低温骡冷固定作冰冻切片的。 化学方法固定就是用化学试剂配制成固定液使之固定。 2.2.3固定液的选择 固定液的种类很多。可分为两大类：简单固定液和混合固定液。 简单固定液又称单纯固定液，就是用一种化学试剂作为固定液，如乙醇、甲醛溶液、冰醋酸等,它们只是对细胞的某种成分固定得较好；不能将细胞所有的成分都保存下来。如升汞固定蛋白质、冰醋酸固定核蛋白、无水乙醇可固定糖原等，单纯固定液是有局限性的。 混合固定液就是用几种化学药品，按一定的比例混合配制而成的，由于各种药品的优缺点互相弥补，因此可产生较好的效果。2.2.4常用的固定液福尔马林醋酸酒精混合固定液（FAA液） 是植物制片技术中

52、较为良好的固定液和保存液。除单细胞和丝状藻类外，均可用此液固定也通用于昆虫和甲壳类的固定。 FAA液配方： 福尔马林 5m1 冰醋酸 5m1 50或70酒精 90m1Bouin氏液 是常用的良好固定液，广泛应用于一般动物组织、昆虫组织、无脊椎动物的卵和幼虫，以及胚胎学材料的固定。也适用于裸子植物的雌配子体和被子植物的胚囊的固定。 Bouin氏液配方： 苦味酸饱和水溶液 75份 福尔马林 25份 冰醋酸 5份 此液穿透迅速而均匀，使组织收缩少，不使组织变硬变脆，着色良好。一般动物组织固定1224h，小块组织数小时即可。固定后直接入70酒精中洗去黄色，但留一点黄色对染色并无妨碍。植物材料的固定时间

53、为1248h。2.2.5固定的注意事项 (1)固定的材料越新鲜越好。因此，采集或割取后须立即投入预先准备好的固定液中进行固定，切勿耽误。 (2)材料大小以直径不超过5mm为宜，材料与固定液的比例为 1:20。 (3)根据材料的性质和制片的目的选择固定液。 (4)所固定的植物材料，若表面有毛茸或其它不易穿透的物质，则可用含有酒精的固定液固定。 (5)含有气泡的材料投入团定液后，材料不会下沉，故须将气泡抽出使材料下沉。最简易的抽气方法是将材料和固定液一并例入10ml的注射器中，抽动几次。也小用抽气装置进行抽气。 (6)固定时，要防止材料变形。 (7)外有被膜，而内部站构又极易松散的器官，应将整个器官投入固定液22h后，再将其修成小块材料继续则定。(8)含行粘液、污物或血液的材料需用生理盐水洗净