分子生物学第四次

1、分子生物学第四次 DNADNA复制的特点复制的特点： 1.DNA 半保留复制半保留复制 4. 多为双向等速复制多为双向等速复制 分子生物学第四次 (1).线性线性DNA复制的方式复制的方式 多数为双向复制，多个起始位点，复制叉处有眼状结构， 称为复制眼。 分子生物学第四次 线性DNA复制子末端复制 3.在某种蛋白的介入下，在真正的末端复 制 端RNA引物切除后的填补 分子生物学第四次 端粒结构端粒结构 3 3 5 5 3 3 5 5 端粒结构端粒结构 端粒酶是含端粒酶是含RNARNA的逆转录酶的逆转录酶 端粒酶与细胞老化有关端粒酶与细胞老化有关 端粒（端粒（telomerestelomeres

2、） ：是真核细胞染色体末：是真核细胞染色体末 端所特有的结构，有许多串（端所特有的结构，有许多串（10001000串或更多）串或更多） 短的重复序列组成，通常短的重复序列组成，通常3 3末端链是富含末端链是富含G G的的 短序列。短序列。 端粒酶端粒酶: :含有含有RNARNA和蛋白质（起和蛋白质（起DNADNA聚合酶的聚合酶的 作用）两种组分，作用）两种组分，RNARNA分子约分子约150b150b，含有与重，含有与重 复端粒结构互补的一个片断，可作为端粒链合复端粒结构互补的一个片断，可作为端粒链合 成的模板。成的模板。 分子生物学第四次 分子生物学第四次 (2).环状环状DNA复制方式复制

3、方式 A.复制 分子生物学第四次 B. 滚环复制也叫复制 分子生物学第四次 C. 置换式置换式 （Displacement form ）又称）又称 D 环复环复 制制 两条链的合成两条链的合成 高度不对称高度不对称,一条链一条链 迅速合成出互补链迅速合成出互补链, 另一条则形成游离另一条则形成游离 的单链环的单链环(D-环环) 线粒体和叶绿体线粒体和叶绿体 DNA的复制方式的复制方式 分子生物学第四次 DNA DNA 复制的调控复制的调控 原核生物的调控，原核生物的调控，DNADNA链的延伸速度恒定，链的延伸速度恒定， 复制叉的数量决定细胞生长和增值速度。复制叉的数量决定细胞生长和增值速度。

4、ColEI ColEI 质粒质粒DNA DNA 的复制调控的复制调控 DNADNA编码两个负调控因子，编码两个负调控因子，Rop Rop 蛋白和反义蛋白和反义RNARNA DNADNA复制方向复制方向 起始点起始点 RNARNA前体前体 100 200 300 400 500 600-500 -400 -300 -200 -100 RNA1Rop基因基因 Rop蛋白蛋白63个个aa RnaseH 分子生物学第四次 真核细胞真核细胞DNA DNA 的复制调控的复制调控 真核细胞的生活周期分为真核细胞的生活周期分为4 4个时期个时期G G1 1复复 制预备期、制预备期、S S复制期、复制期、G G

5、2 2有丝分裂准备有丝分裂准备 期、期、M M有丝分裂期有丝分裂期 真核生物复制有真核生物复制有3 3个水平的调控个水平的调控 细胞生活周期水平调控， 决定细胞停留在G1期还是 进入S S期 染色体水平，决定不同染色体或同一染色体不同部 位的复制子按一定顺序起始复制 复制子水平调控，决定复制的起始与否 M G1 G2 S 分子生物学第四次 聚合酶链式反应聚合酶链式反应PCRPCR 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction，PCRPCR）是体外酶促）是体外酶促 合成特异合成特异DNADNA片段的一种方法，

6、为最常用的分子生物学技术片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术 典型的典型的PCRPCR由（由（1 1）高温变性）高温变性 （2 2）引物与模板退火；）引物与模板退火； （3 3）引物沿模板延伸）引物沿模板延伸 三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNADNA得以迅速得以迅速 扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNADNA置高温下（通常为置高温下（通常为93-93- 9494）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适 的复性温度下分别与目

7、的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物 在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNADNA聚合酶聚合酶 （TaqTaq酶）在酶）在7272将单核苷酸从引物的将单核苷酸从引物的33端开始掺入，以目的基因端开始掺入，以目的基因 为模板从为模板从5353方向延伸方向延伸 PCRPCR能在（能在（pgpg）水平起始）水平起始DNADNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微混合物中的目的基因扩增达到纳克、微 克、毫克级的特异性克、毫克级的特异性DNADNA片段。因此，片段。因此，PCRPCR技术

8、一经问世就被迅速而技术一经问世就被迅速而 广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离 克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建。克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建。 分子生物学第四次 课后复习题：课后复习题： DNADNA半保留复制半保留复制 DNA DNA 的半不连续复制的半不连续复制 复制子复制子 复制叉复制叉 如果细菌环状染色体的复制是双向的，并且从固定的复如果细菌环状染色体的复制是双向的，并且从固定的复 制起点开始，每个复制叉以制起点开始，每个复制叉以16um/min16um/min的速

9、度移动，细菌的速度移动，细菌 染色体长染色体长1280um,1280um,完成整个染色体复制需要多少时间？当完成整个染色体复制需要多少时间？当 细菌在营养丰富的培养基每细菌在营养丰富的培养基每20min 20min 分裂一次，也就是说分裂一次，也就是说 第一轮复制尚未完成就开始第二轮复制，此时染色体有第一轮复制尚未完成就开始第二轮复制，此时染色体有 几个复制叉？几个复制叉？ 分子生物学第四次 DNADNA损伤的后果损伤的后果 信号传导异常信号传导异常 老化老化肿瘤肿瘤疾病疾病 异常增生和代谢异常增生和代谢生理功能紊乱生理功能紊乱 细胞死亡细胞死亡 细胞增殖减少细胞增殖减少基因表达异常基因表达异

10、常基因组不稳定基因组不稳定 分子生物学第四次 五、五、DNA DNA 的修复的修复 DNA 修复系统修复系统功能功能 错配修复错配修复恢复错配恢复错配 碱基切除修复碱基切除修复切除突变的碱基切除突变的碱基 核苷酸切除修复核苷酸切除修复修复被破坏的修复被破坏的DNA DNA 直接修复直接修复 修复嘧啶二体或甲基化修复嘧啶二体或甲基化 DNA 大肠杆菌中大肠杆菌中DNADNA的修复系统的修复系统 分子生物学第四次 大肠杆菌 DNA 甲基化位点 新合成的DNA Mis-paired bases 分子生物学第四次 错配修复 分子生物学第四次 紫外线可引起紫外线可引起DNADNA的交联的交联, DNA,

11、 DNA与蛋白质的交联与蛋白质的交联。 分子生物学第四次 DNADNA紫外线损伤的光复合酶直接修复紫外线损伤的光复合酶直接修复 分子生物学第四次 3.碱基切除修复碱基切除修复 指切除和替换由内源性化学物作用产生 的DNA碱基损伤, 是切除修复的一种。 受损碱基移除是由多个酶来完成的。 主要针对DNA单链断裂和小的碱基改变 及氧化性损伤。 分子生物学第四次 缺失碱基位点缺失碱基位点 DNA糖苷水解酶 分子生物学第四次 Base Excision Repair 分子生物学第四次 4.核苷酸切除修复核苷酸切除修复 体内识别体内识别 DNA DNA 损伤最多的修复通路损伤最多的修复通路 主要修复扭曲双

12、螺旋结构的主要修复扭曲双螺旋结构的 DNA DNA 损伤损伤 修复时切除含有损伤碱基的那一段修复时切除含有损伤碱基的那一段 DNA DNA 。 分子生物学第四次 分子生物学第四次 分子生物学第四次 核苷酸切除修复核苷酸切除修复 ( (基因组修复基因组修复人人) ) 分子生物学第四次 是复制后的修复 DNA链的损伤并未除去 一直只存在母链上！若干 代后相当于被稀释。 胸腺嘧啶胸腺嘧啶 二聚体二聚体 分子生物学第四次 为DNA的损伤所诱导，而产生缺乏校对功 能的DNA聚合酶，它能在DNA损伤部位进 行复制而避免了死亡，可是却带来了高的 突变率（所以会有所以会有2 2种结果：修复或变异（进化）种结果

13、：修复或变异（进化） ， 这属于倾向差错的修复。 分子生物学第四次 1、反向重复序列与二级结构、反向重复序列与二级结构 反向重复序列（反向重复序列（inverted repeatitive sequence or inverted inverted repeatitive sequence or inverted repeats IRrepeats IR）又称回文序列（廻文）：指两段同样的核苷酸序列同）又称回文序列（廻文）：指两段同样的核苷酸序列同 时存在于一个分子中，但具有相反的方向时存在于一个分子中，但具有相反的方向. . 有时也有不完全相同的情况有时也有不完全相同的情况 RNARNA和和

14、DNADNA中都可能存在中都可能存在 此外还可有此外还可有directed repeatitive sequence -directed repeatitive sequence -正向重复序列正向重复序列 一些一些DNA序列的不寻常结构序列的不寻常结构 分子生物学第四次 C 分子生物学第四次 反向重复序列间间隔较短或无间隔反向重复序列间间隔较短或无间隔 反向重复序列间间隔较长反向重复序列间间隔较长 分子生物学第四次 * * 较短的回文序列可能是作为一种信号较短的回文序列可能是作为一种信号 如：如：限制性内切酶的识别位点限制性内切酶的识别位点 一些调控蛋白的识别位点一些调控蛋白的识别位点 例如

15、限制性内切酶例如限制性内切酶 EcoREcoR的识别位点的识别位点 5 5GAATTCGAATTC3 3 3 3CTTAAGCTTAAG5 5 分子生物学第四次 六、转六、转 座座 基因组是相对稳定的，基因组中的序列 通常处于恒定的位置。因此，我们可以 通过构建遗传图谱(genetic map)来鉴定 已知基因的基因座。 在分子水平上，每个个体基因组之间的 差异主要由重组引起，但转座元件 （transposable element）或转座子 （transposons）的存在也可以造成基因 组的改变。 分子生物学第四次 转座子 (transposon 或 transposable element

16、)是基因组内相对独立的、可移动 序列，它们不必借用噬菌体或质粒的形式 就可以从基因组的一个部位直接转移到另 一个部位，这个过程称为转座 （transposition） 转座子每次移动时携带着转座必需的基因 一起在基因组内跃迁，所以转座子又称跳 跃基因（jumping gene） 分子生物学第四次 转座元件首先是由Barbara McClintock 于40年代在玉米的遗传学研究中发现的， 她称之为控制元件（controlling element），因为它不仅能够在基因组内 转移，而且还能够改变基因的活性并引 起功能的改变。 现在认为转座子存在于地球上所有的生 物。 分子生物学第四次 分子生物学

17、第四次 2 特点：特点： 转座子是基因组的正常组成成分，不以独立的转座子是基因组的正常组成成分，不以独立的 形式存在（如噬菌体或质粒形式存在（如噬菌体或质粒DNA）。）。 不必借助同源序列就可移动的不必借助同源序列就可移动的DNA片段，即转座片段，即转座 作作 用与供体和受体之间的序列无关。用与供体和受体之间的序列无关。 原核生物和真核生物均有转座子。原核生物和真核生物均有转座子。 转座序列可沿染色体移动，甚至在不同染色体转座序列可沿染色体移动，甚至在不同染色体 间跳间跳 跃。跃。 转座以很低的频率发生，而且转座子的插入是转座以很低的频率发生，而且转座子的插入是 随机的随机的， 分子生物学第四

18、次 3 种类与特征种类与特征 （ 分子生物学第四次 A 插入序列插入序列 最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的 正常组分，是一个自主的单位，每种正常组分，是一个自主的单位，每种IS均编码自身均编码自身 转座所需的蛋白质。转座所需的蛋白质。 命名：命名： IS编号（鉴定类型）编号（鉴定类型） 长度长度 7002000bp 分子生物学第四次 每种每种IS元件具有不同序列，但有共同的组织形式元件具有不同序列，但有共同的组织形式 分子生物学第四次 分子生物学第四次 B 复合转座子复合转座子 表示法：通常以表示法：通常以Tn和后面加上数码表示，和后面加上数码表

19、示， 如如Tn903。 结构结构: a. 除有转座酶基因外还有其它表型基因，除有转座酶基因外还有其它表型基因， 如：抗药基因，使宿主具表性效应。如：抗药基因，使宿主具表性效应。 b. 两侧有重复序列。两侧有重复序列。 c. 有的转座子的重复顺序就是有的转座子的重复顺序就是IS。 功能：和功能：和 IS 一样可以从一个位点转座到另一个位点。一样可以从一个位点转座到另一个位点。 分子生物学第四次 Tn1681 大肠杆菌热稳大肠杆菌热稳 定毒素定毒素I 基因基因 552 bp IRIRIRIR 复合转座子结构示意图复合转座子结构示意图 IS1IS1 分子生物学第四次 a) TnA family l

20、具有具有IR、转座酶基因、转座酶基因、 调节基因（解离酶）、调节基因（解离酶）、 抗抗生素基因抗抗生素基因 2.5 kb 20 kb Tn3 IR TnpA TnpR AmpR IR 38bp 38bp 转座酶转座酶 regulator - 内酰胺酶内酰胺酶 两种类型两种类型 分子生物学第四次 b）两端重复序列为）两端重复序列为ISIS的复合转座子的复合转座子 e.g. IS插入到功能基因两端，可能形成复合转座因子插入到功能基因两端，可能形成复合转座因子 分子生物学第四次 IS ISIS IS L IS R 臂臂 中心区中心区 臂臂 transposition 分子生物学第四次 当两个当两个I

21、S组件相组件相 同时，其中任一个都同时，其中任一个都 可行使转座功能可行使转座功能 两侧的两侧的IS既可以是既可以是 IR，又可以是，又可以是DR状态状态 （IR多）多） 分子生物学第四次 4. 转座发生的机制 转座子插入到一个新的部位的通常步骤 是：在靶DNA上制造一个交错的切口，然 后转座子与突出的单链末端相连接，并 填充切口。 交错末端的产生和填充解释了在插入部 位产生靶DNA正向重复的原因。链的切口 之间的交错决定了正向重复的长度。 分子生物学第四次 分子生物学第四次 1）复制型转座模式（）复制型转座模式（replicative transposition） 分子生物学第四次 复制型转

22、座复制型转座 复制型转座 分子生物学第四次 分子生物学第四次 转座元件作为一个物理实体直接由一个 部位转移到另一个部位。 分子生物学第四次 分子生物学第四次 除了引起在新部位序列插入的简单分子除了引起在新部位序列插入的简单分子 间转座之外，转座子还能促进其他类型间转座之外，转座子还能促进其他类型 的的DNADNA重排。重排。 任何一对正向重复序列之间的重组会导任何一对正向重复序列之间的重组会导 致它们的序列的缺失；而一对反向重复致它们的序列的缺失；而一对反向重复 序列之间的交互重组可能使重复序列之序列之间的交互重组可能使重复序列之 间的序列被倒位，而重复序列本身被保间的序列被倒位，而重复序列本

23、身被保 留。留。 分子生物学第四次 分子生物学第四次 分子生物学第四次 玉米中的控制因子包括：玉米中的控制因子包括： 自主型因子，具有自主剪接和转座的功能自主型因子，具有自主剪接和转座的功能 非自主性因子非自主性因子 ，单独存在时很稳定，只当基因，单独存在时很稳定，只当基因 组中存在与非自主性因子同家族的自主性因子时组中存在与非自主性因子同家族的自主性因子时 才具备转座功能。同一家族的自主性因子能为非才具备转座功能。同一家族的自主性因子能为非 自主性因子提供转座酶。自主性因子提供转座酶。 分子生物学第四次 玉米中转座子的特点玉米中转座子的特点 玉米转座子具有典型的玉米转座子具有典型的ISIS特

24、征，转座子两翼有特征，转座子两翼有 两个倒转重复序列，在靶两个倒转重复序列，在靶DNADNA插入位点有两个短插入位点有两个短 的正向重复序列。的正向重复序列。 在在Ac-Ds体系中：体系中： Ac转座子的两翼有转座子的两翼有11bp的倒转重复序列，的倒转重复序列， 在靶在靶DNA位点复制形成位点复制形成8bp正向重复正向重复 Ds 是是Ac 转座子的缺失体，但两端转座序转座子的缺失体，但两端转座序 列特征完整，如果细胞内有相应的转座酶列特征完整，如果细胞内有相应的转座酶 活性活性Ds 就能恢复转座性能就能恢复转座性能 分子生物学第四次 玉米转座因子对胚乳颜色的影响 分子生物学第四次 果蝇中的转座子果蝇中的转座子 诱发果蝇不育的诱发果蝇不育的P P转座子，几乎所有的杂种不育都由转座子，几乎所有的杂种不育都由P P 转座子插入基因组转座子插入基因组W W位点引起的位点引起的 P: P: 两翼有两翼有31bp31bp倒置重复，靶倒置重复，靶DNADNA产生产生8bp8bp的重复序列的重复序列 体细胞内体细胞内 内含子内含子3 3不被切除不被切除 卵细胞内卵细胞内 内含子内含子3 3被切除被切除 转座酶转座酶 分子生物学第四次 有 P 因 子转 座 P 品系 (PP) 雄性染色体 雌性染色体 P 细