肿瘤单克隆抗体的制备

1、人源化单克隆抗体人源化单克隆抗体 人源化单克隆抗体是什 么？ 分类方法：分类方法： 人源化抗体就是指抗体人源化抗体就是指抗体 的可变区的可变区部分（即部分（即Vh和和Vl区）或抗体区）或抗体 所有所有全部由人类抗体基因所编码。人全部由人类抗体基因所编码。人 源化抗体可以大大减少异源抗体对人源化抗体可以大大减少异源抗体对人 类机体造成的免疫副反应人源化抗体类机体造成的免疫副反应人源化抗体 包括嵌合抗体、移植抗体和全人源化包括嵌合抗体、移植抗体和全人源化 抗体等几类。抗体等几类。 基因工程抗体基因工程抗体 目的：保留抗体的抗原结合能力、易于大目的：保留抗体的抗原结合能力、易于大 规模生产、减小鼠源

2、性成分，增加人源化，规模生产、减小鼠源性成分，增加人源化， 可用于临床。可用于临床。 基本原理：借助于基因工程手段，将编码基本原理：借助于基因工程手段，将编码 Ab的重轻链可变区基因重组到真核或原核的重轻链可变区基因重组到真核或原核 表达载体上并进行表达。表达载体上并进行表达。 国外市场情况：国外市场情况： 单克隆抗体，90年代后期上市以来，经过 多年的开发，终于在某些疾病的治疗上取 得突破。抗体进入临床研究，其中16个已 进入市场，2002年销售额达29亿美元，预 计2005年将达近90亿美元。 根据商业通讯公司预测，2002年全球治疗 与诊断用抗体市场为73亿美元，预计将以 每年16.6%

3、的平均速度增长，到2007年可达 到157亿美元。2001年诊断用抗体市场为 4.41亿美元。 人源化单克隆抗体的临床应用人源化单克隆抗体的临床应用 在肿瘤治疗方面的应用在肿瘤治疗方面的应用 在器官移植中的应用在器官移植中的应用 在自身免疫性疾病方面的应用在自身免疫性疾病方面的应用 未来发展方向未来发展方向 目前，抗体人源化方法还在不断发展和晚 上，目标是提高抗体亲和力、降低抗体异 原性，同时兼顾抗体的免疫活化作用。另 外，针对不同的异源抗体。选择合适的人 源化途径构建更适合于临床应用的人源化 抗体，将为新药的开发和一些顽固的治疗 开辟新的途径。 恒定区人源恒定区人源 化化 可变区人源可变区人

4、源 化化 利用抗体库技利用抗体库技 术获得完全人术获得完全人 源序列源序列 发展发展 嵌合抗体嵌合抗体 选择或剪切效选择或剪切效 应基因应基因 减少了减少了HAMS CDR移植Ab 1 1、模板替换、模板替换 2 2、表面重塑、表面重塑 3 3、补偿变换、补偿变换 4 4、定位保留、定位保留 全人源化抗体全人源化抗体 恒定区人源化-鼠/人嵌合抗体 （chimeric antibody） 表达产物嵌合抗体的纯化 以A 蛋白包被的小珠通过吸附和解吸过 程来纯化抗体, 这种A 蛋白可牢固地结合于免 疫球蛋白重链Fc 段第二和第三恒定区。 并非所有免疫球蛋白对A 蛋白的亲和力都 相同 在纯化抗体前,

5、必须采用商品化的抗Fc 段 同种型免疫学试剂先行测定其重链所属的类 型, 如抗体属于对A 蛋白亲和力弱的一类( 如 人的IgG3) , 就必须使用其他方法。 嵌合抗体检测 Western 印迹法是检测抗体的常用方法。此 种技术是把电泳分离的蛋白组分从凝胶转移至 一种固相支持体, 并以针对特定的氨基酸序列的 特异性试剂检测之。对于嵌合抗体来说, 通常使 用的探针为抗体。 完全人源性单克隆抗体 1，筛肿瘤特异性抗原： （1）利用T细胞筛内源性抗原 （2）利用Hu-PBL-SciD小鼠筛抗体结合抗原 , 2，抗体制备及构建抗体库技术： （1）合成抗体库技术及小鼠转基因技术 （2）核糖体展示技术 （3

6、）噬菌体抗体库技术 3，筛选技术及表达 （1）亲和筛选（immobilized panning) （2）捕获法(capture panning ) （3）完整细胞淘洗(whole cell panning ) 筛选肿瘤抗原 1，利用T细胞筛选抗原 Pre-T细胞 混合培养以诱导CTL CTL细胞 肿瘤细胞 杀伤与否 CDNA文库 转染的细胞 2，SCID小鼠筛选抗原 SCID小鼠 肿瘤细胞 构建HU-PBL-SCID小鼠 能否免疫应答 淋巴细胞 B淋巴细胞 肿瘤细胞CDNA文库 免疫抗原 转染表达MHC I类的靶细胞 特异抗体制备及 1，合成抗体库及小鼠转基因技术 （一）合成抗体( Synth

7、eticantibody library)。 1，在对人或鼠抗体序列和主体结构进行分析的基础上, 合成 多条VH和VL基因, 用来替代所有的抗体类别和结构, 组成多个 总抗体库。 2，转基因小鼠的鼠抗体生成基因被相应的人基因取代，利 用肿瘤抗原如EGFR 免疫含有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠 可制备高亲和力和特异性的抗体。 特异抗体制备 1，合成抗体库及转基因技术 （二）转基因技术 特异抗体制备及筛选 2,核糖体展示技术 核糖体展示 的基本过程： （1）构建核糖体展示的 D N A模板 ，依次体外转 录、 体外 翻译成“mRNA-核糖体-蛋白质” 复合物。 （2）抗原固相亲和筛选或者肿瘤细胞为

8、固相细胞筛选技术。 然后洗脱，核糖体解离 ， 释放 mR N A。后者经 过纯 化后 用 作RT-PCR的模板 ， 重新引入核糖体展示的各种必需元件 ， 进行新 一轮的核糖体展示。 （3）最后得到纯化的特异性抗体mRNA。 （4）利用转基因或者克隆技术表达抗体。 特异抗体制备及筛选 筛选技术 人源单抗表达系统 （1）大肠杆菌中表达 （2）酵母中表达 （3）动物细胞（昆虫细胞或哺乳细胞株） （4）植物细胞 。 完全人源性单克隆抗体制备与应用 合成合成抗体库技术抗体库技术 抗体库构建 抗体制备与筛选 肿瘤疫苗 筛肿瘤抗原 综合构建 核糖体展示技术核糖体展示技术 噬菌体抗体库噬菌体抗体库 利用利用T

9、细胞筛细胞筛 内源性抗原内源性抗原 利用利用Hu-PBL- SciD小鼠筛抗小鼠筛抗 体结合抗原体结合抗原 亲和层析亲和层析 免疫沉淀免疫沉淀 单克隆抗体药物继重组蛋白之后，引领了第二次生物制药产品 高潮。 癌症结肠癌 乳腺癌 B细胞 淋巴瘤 小细胞肺癌等 免疫性疾病类风湿关节炎 强直性脊柱 炎 银屑病 Crohn氏病等 感染性疾病菌血症 病毒性感染 呼吸 道融合病毒感染等 人源化抗体药物 特异性强 毒性低 半衰期长 临床效果明显 等 抗体亲和力成熟问题 、 全人源杂交瘤细胞分泌抗体的稳定 性问题、抗体大规模生产问题、治疗费用昂贵等 Humira 作为全球第一个全人源化抗体于2002年上市. 缓解结构性损伤的中至重度类风湿性关节炎(RA)成 年患者的体征与症状。 Zenapax 特异性人源化IL-2受体抗体，可特异性抑制 T细胞介导的移植免疫反应。作为第一个人源化单 抗于1997年投放市场。 利妥昔与CD20特异结合，继而导致B细胞溶解， 不影响原B细胞情况下，通过诱导其凋亡，达到 杀死淋巴瘤的目的。 通用名商品名公司 2010年销售 额（亿美元） 美国专利 到期时间 欧洲及其他国 家专利到期时 间 依那西普恩利(Enbrel)安进61.720122014 利妥昔单抗美罗华(Rituxan)罗氏50.420182