生物技术在食品分析检测上的应用

1、生物技术在食品分析检测上的应用第一节 生物传感器与食品安全检测 1.生物传感器的基本概念生物传感器的基本概念 生物传感器通常是指由一种生物传感器通常是指由一种生物敏感部件生物敏感部件和和转转化器化器紧密结合，对紧密结合，对特定种类化学物质或生物活性物特定种类化学物质或生物活性物质质具有选择性和可逆响应的分析装置。具有选择性和可逆响应的分析装置。 它是发展生物技术必不可少的一种先进的检测它是发展生物技术必不可少的一种先进的检测与监控方法，也是对食品质量在分子水平上进行快与监控方法，也是对食品质量在分子水平上进行快速和微量分析的方法。速和微量分析的方法。. .生物传感器工作原理生物传感器工作原理

2、待测物质经扩散作用进入待测物质经扩散作用进入固定生物膜固定生物膜敏感层，经分子识别敏感层，经分子识别而发生而发生生物学作用生物学作用，产，产生的生的信息信息如光、热、音等被相应的如光、热、音等被相应的信号转换信号转换器器变为可定量和处理的电信号，再经二次仪变为可定量和处理的电信号，再经二次仪表放大并输出，以电极测定其电流值或电压表放大并输出，以电极测定其电流值或电压值，从而换算出被测物质的值，从而换算出被测物质的量或浓度。量或浓度。 将将化学变化化学变化转变成电信号转变成电信号 如酶传感器,酶催化特定底物发生反应,从而使特定生成物的量有所增减。 用能把这类物质的量的改变转换为电信号的用能把这类

3、物质的量的改变转换为电信号的装置和固定化酶耦合装置和固定化酶耦合, ,即组成酶传感器即组成酶传感器, ,常用转换装常用转换装置有氧电极、过氧化氢。置有氧电极、过氧化氢。 将将热变化热变化转换成电信号转换成电信号 固定化的生物材料与相应的被测物作用时常伴有热的变化。例如大多数酶反应的热焓变化量在例如大多数酶反应的热焓变化量在25-25-100kJ/mol100kJ/mol的范围的范围. .这类生物传感器的工作原理这类生物传感器的工作原理是把反应的热效应借热敏电阻转换为阻值的变是把反应的热效应借热敏电阻转换为阻值的变化化, ,后者通过有放大器的电桥输入到记录仪中。后者通过有放大器的电桥输入到记录仪

4、中。 将将光信号光信号转变为电信号转变为电信号 例如，过氧化氢酶，能催化过氧化氢例如，过氧化氢酶，能催化过氧化氢/ /鲁米诺鲁米诺体系发光，因此如设法将过氧化氢酶膜附着在光纤体系发光，因此如设法将过氧化氢酶膜附着在光纤或光敏二极管的前端，再和光电流测定装置相连，或光敏二极管的前端，再和光电流测定装置相连，即可测定过氧化氢含量。即可测定过氧化氢含量。 还有很多细菌能与特定底物发生反应，产生还有很多细菌能与特定底物发生反应，产生荧光，也可以用这种方法测定底物浓度。荧光，也可以用这种方法测定底物浓度。上述三类传感器原理的共同点上述三类传感器原理的共同点： 都是将分子识别元件中的生物敏感都是将分子识别

5、元件中的生物敏感物质与待测物发生化学反应，将反应后所物质与待测物发生化学反应，将反应后所产生的化学或物理变化再通过信号转换器产生的化学或物理变化再通过信号转换器转变为电信号进行测量，这种方式统称为转变为电信号进行测量，这种方式统称为间接测量方式。间接测量方式。 直接产生电信号方式直接产生电信号方式这种方式可以使酶反应伴随的电子转这种方式可以使酶反应伴随的电子转移、微生物细胞的氧化直接移、微生物细胞的氧化直接( (或通过或通过电子电子递体递体的作用的作用) )在电极表面上发生。根据所在电极表面上发生。根据所得的电流量即可得底物浓度。得的电流量即可得底物浓度。. .生物传感器发展历程生物传感器发展

6、历程开端于开端于 20 20 世纪世纪 60 60 年代。年代。1962 1962 年克拉克等人报道了用葡萄糖氧化酶与氧年克拉克等人报道了用葡萄糖氧化酶与氧电极组合检测葡萄糖的结果电极组合检测葡萄糖的结果 , ,可认为是最早提出可认为是最早提出了生物传感器了生物传感器( (酶传感器酶传感器) )的原理。的原理。19671967年年UpdikeUpdike等人实现了酶的固定化技术等人实现了酶的固定化技术 , ,研制研制成功酶电极成功酶电极 , ,这被认为是世界上第一个生物传感这被认为是世界上第一个生物传感器。器。 2020世纪世纪7070年代中期后年代中期后, ,生物传感器技术的成功主生物传感器

7、技术的成功主要集中在对生物活性物质的探索、活性物质的固要集中在对生物活性物质的探索、活性物质的固定化技术、生物电信息的转换以及生物传感器等定化技术、生物电信息的转换以及生物传感器等研究研究 , ,并获得了较快的进展并获得了较快的进展 。19771977年年,钤木周一等发表了关于对生化需氧量钤木周一等发表了关于对生化需氧量(BOD)(BOD)进行快速测定的微生物传感器的报告进行快速测定的微生物传感器的报告 , , 正正式提出了对生物传感器的命名。式提出了对生物传感器的命名。 生物传感器分类根据传感器输出信号的产生方式根据传感器输出信号的产生方式, ,可分为生物亲可分为生物亲合型生物传感器、代谢型

8、或催化型生物传感器合型生物传感器、代谢型或催化型生物传感器; ;根据生物传感器的信号转换器根据生物传感器的信号转换器可分为电化学生可分为电化学生物传感器、半导体生物传感器、测热型生物传物传感器、半导体生物传感器、测热型生物传感器、测光型生物传感器、测声型生物传感器感器、测光型生物传感器、测声型生物传感器等等根据生物传感器中生物分子识别元件上的敏感根据生物传感器中生物分子识别元件上的敏感材料材料可分为酶传感器、微生物传感器、免疫传可分为酶传感器、微生物传感器、免疫传感器、组织传感器、基因传感器、细胞及细胞感器、组织传感器、基因传感器、细胞及细胞器传感器。器传感器。 每一类名称又都包含许多种具体的

9、生物传感器每一类名称又都包含许多种具体的生物传感器例如，酶电极类例如，酶电极类: :根据所用酶的不同就有几十种，如根据所用酶的不同就有几十种，如葡萄糖电极、尿素电极、尿酸电极、胆固醇电极、葡萄糖电极、尿素电极、尿酸电极、胆固醇电极、乳酸电极、丙酮酸电极等等乳酸电极、丙酮酸电极等等葡萄糖电极也并非只有一种，有用葡萄糖电极也并非只有一种，有用pHpH电极或碘离子电极或碘离子电极作为转换器的电位型葡萄糖电极，有用氧电极电极作为转换器的电位型葡萄糖电极，有用氧电极或过氧化氢电极作为转换器的电流型葡萄糖电极或过氧化氢电极作为转换器的电流型葡萄糖电极等实际上还可再细分。等实际上还可再细分。 生物亲合型传感

10、器生物亲合型传感器 被测物质与分子识别元件上的敏感物质具被测物质与分子识别元件上的敏感物质具有有生物亲合作用生物亲合作用，即二者能，即二者能特异地特异地相结合，同时相结合，同时引起敏感材料的分子结构和引起敏感材料的分子结构和/ /或固定介质发生变或固定介质发生变化。例如：电荷、温度、光学性质等的变化。反化。例如：电荷、温度、光学性质等的变化。反应式可表示为：应式可表示为： S S（底物）（底物）+ R+ R（受体）（受体） = SR= SR 代谢型传感器代谢型传感器 底物（被测物）与分子识别元件上的敏感底物（被测物）与分子识别元件上的敏感物质相物质相作用并生成产物作用并生成产物，信号转换器将，

11、信号转换器将底物的消底物的消耗或产物的增加转变为输出信号耗或产物的增加转变为输出信号，这类传感器称，这类传感器称为代谢型传感器，其反应形式可表示为为代谢型传感器，其反应形式可表示为 S S（底物）（底物）R R（受体）（受体）= SR P= SR P（生成物）（生成物） 生物传感器生物传感器优点：优点：由于具有较高的选择性由于具有较高的选择性，因此不需对被测，因此不需对被测组分进行分离，即不用对样品进行预处理。组分进行分离，即不用对样品进行预处理。结构简单，体积小，使用方便结构简单，体积小，使用方便，特别是便，特别是便携式的生物传感器，非常有利干食品质量携式的生物传感器，非常有利干食品质量安全

12、的市场。安全的市场。快快速评价；可以实现连续的在线检测，可以实现连续的在线检测，使食品加工过使食品加工过程的质量控制变得简便程的质量控制变得简便；响应速度快，样品用量少响应速度快，样品用量少；与其他大型分与其他大型分析仪器相比，生物传感器的制作析仪器相比，生物传感器的制作成本低成本低，且可反复使用且可反复使用。手掌型葡萄糖(glucose)(glucose)分析仪 6.2 传感器类型(1) (1) 酶传感器(EnzymeSensor)(EnzymeSensor) 酶传感器酶传感器它将活性物质酶覆盖在电极表面它将活性物质酶覆盖在电极表面, ,酶与被测的有酶与被测的有机物或无机物反应机物或无机物反

13、应, ,形成一种能被电极响应的物形成一种能被电极响应的物质。质。19671967年年UpdickUpdick和和HicksHicks将固定化的葡萄糖氧化酶将固定化的葡萄糖氧化酶膜结合在氧电极上膜结合在氧电极上, ,做成了第一支葡萄糖电极；做成了第一支葡萄糖电极；此后此后, ,这类酶传感器通常是通过检测产物这类酶传感器通常是通过检测产物H2O2H2O2的的浓度变化或氧的消耗量来检测底物。浓度变化或氧的消耗量来检测底物。 组织传感器组织传感器(TissueSensor)(TissueSensor)组织传感器是以动植物组织薄片中的组织传感器是以动植物组织薄片中的生物催生物催化层与基础敏感膜电极化层与

14、基础敏感膜电极结合而成结合而成, ,该该催化层以催化层以酶为基础酶为基础, ,基本原理与酶传感器相同基本原理与酶传感器相同. .与酶传感器比较，组织传感器具有如下优点：与酶传感器比较，组织传感器具有如下优点：1.酶活性较离析酶高酶活性较离析酶高.2.酶的稳定性增大酶的稳定性增大.3.材料易于获得材料易于获得.肝组织电极肝组织电极 动物肝组织中含有丰富的动物肝组织中含有丰富的H H2 2O O2 2酶，可酶，可与氧电极组成测定与氧电极组成测定H H2 2O O2 2及其它过氧化物的及其它过氧化物的组织电极组织电极19811981年年MasciniMascini等研究了数种等研究了数种哺乳动物和其

15、它动物（鸟、鱼、龟）的肝哺乳动物和其它动物（鸟、鱼、龟）的肝组织电极。组织电极。 微生物传感器微生物传感器微生物传感器分为两类微生物传感器分为两类： 一类是利用微生物在同化底物时消一类是利用微生物在同化底物时消耗氧的呼吸作用；耗氧的呼吸作用； 另一类是利用不同的微生物含有不另一类是利用不同的微生物含有不同的酶。同的酶。装置装置：由适合的微生物电极与氧电极组成。：由适合的微生物电极与氧电极组成。原理原理：利用微生物的同化作用耗氧：利用微生物的同化作用耗氧, ,通过通过测量氧电极电流的变化量来测量氧气的减测量氧电极电流的变化量来测量氧气的减少量少量, ,从而达到测量底物浓度的目的从而达到测量底物浓

16、度的目的. .例如例如, ,荧光假单胞菌荧光假单胞菌, ,能同化能同化葡萄糖葡萄糖；芸苔丝孢酵；芸苔丝孢酵母可同化母可同化乙醇乙醇, ,因此可分别用来制备葡萄糖和乙因此可分别用来制备葡萄糖和乙醇传感器，这两种细菌在同化底物时醇传感器，这两种细菌在同化底物时, ,均消耗溶均消耗溶液中的氧液中的氧, ,因此可用氧电极来测定。因此可用氧电极来测定。基于不同类型的信号转换器基于不同类型的信号转换器, ,常见的微生物传感常见的微生物传感器有电化学型、光学型、热敏电阻型、压电高频器有电化学型、光学型、热敏电阻型、压电高频阻抗型和燃料电池型，阻抗型和燃料电池型， 核酸传感器依据生物体内核苷酸顺序相对稳定依据

17、生物体内核苷酸顺序相对稳定, ,核苷酸碱基核苷酸碱基顺序互补的原理而设计出核酸探针传感器顺序互补的原理而设计出核酸探针传感器, ,即基即基因传感器。基因传感器一般有因传感器。基因传感器一般有10301030个核苷酸的个核苷酸的单链核酸分子单链核酸分子, ,能够专一地与特定靶序列进行杂能够专一地与特定靶序列进行杂交从而检测出特定的目标核酸分子。交从而检测出特定的目标核酸分子。这种传感器这种传感器可用于检测食品中的病原体可用于检测食品中的病原体, ,为食品为食品中病原体的鉴定提供了新的手段中病原体的鉴定提供了新的手段。 生物传感器的应用生物传感器的应用在食品分析中的应用在食品分析中的应用在发酵工程

18、中的应用在发酵工程中的应用在环境监测中的应用在环境监测中的应用在生物医学上的应用在生物医学上的应用在军事上的应用在军事上的应用在食品分析的应用在食品分析的应用食品成分分析食品成分分析食品添加剂的分析食品添加剂的分析农药和抗生素残留量分析农药和抗生素残留量分析微生物和生物毒素的检验微生物和生物毒素的检验食品鲜度的检测食品鲜度的检测（一）食品鲜度的测定1、鱼鲜度传感器 鱼鲜度传感器在日本、拿大等国广泛用于鱼类鲜度的测定。鱼死后体内ATP经酶解依次形成ADP、AMP、IMP、肌苷、次黄嘌呤和尿酸、鲜度可用K值表示： 由于大多数鱼死后由于大多数鱼死后5 520h20h，ATPATP，ADPADP 和和

19、AMPAMP已分解尽，已分解尽，超过超过24h24h，鲜度主要取决鲜度主要取决于于IMP-IMP-肌苷肌苷- -次黄嘌呤次黄嘌呤- -尿酸。尿酸。 基于此，基于此，KarubeKarube等催化将这等催化将这3 3个步骤个步骤的三种酶（的三种酶（55核苷酸酶、核苷磷酸化核苷酸酶、核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶）固定在氧电极上，制酶、黄嘌呤氧化酶）固定在氧电极上，制成鱼鲜度测定仪。成鱼鲜度测定仪。K=K=肌苷肌苷+ +次黄嘌呤次黄嘌呤/ (ATP +ADP+AMP+IMP +/ (ATP +ADP+AMP+IMP +肌苷肌苷+ +次黄嘌呤次黄嘌呤+ +尿酸尿酸) )当当K K2020时，鱼极新鲜，可

20、供生食。时，鱼极新鲜，可供生食。K K在在20204040之问为新鲜，必须熟食。之问为新鲜，必须熟食。K K大于大于4040，不新鲜，不宜食用，这与嗅觉检验结果，不新鲜，不宜食用，这与嗅觉检验结果相一致。相一致。 2. 2.肉鲜度传感器肉鲜度传感器肉类在腐败过程中会产生各种胺类，故胺类测定肉类在腐败过程中会产生各种胺类，故胺类测定也能反映肉类的新鲜程度。也能反映肉类的新鲜程度。用腐胺氧化酶与过氧化氢电极构成多胺生物传感用腐胺氧化酶与过氧化氢电极构成多胺生物传感器，测定肉在贮藏过程中的鲜度，反应时间器，测定肉在贮藏过程中的鲜度，反应时间40s40s，测定腐胺线性范围为测定腐胺线性范围为0.030

21、.033 3 10 10-4 -4 molmolL L。用单胺氧化酶膜和氧电极组成的酶传感器测定可用单胺氧化酶膜和氧电极组成的酶传感器测定可以猪肉新鲜度，响应时间为以猪肉新鲜度，响应时间为4min4min，单胺测定线性，单胺测定线性范围为范围为5050202010 10 -4-4 mol molL L。3.3.食品添加剂的分析食品添加剂的分析过量的食品添加剂通常会对人体造成危害，因此过量的食品添加剂通常会对人体造成危害，因此对食品中添加剂含量进行分析和监测是非常必要对食品中添加剂含量进行分析和监测是非常必要的。的。亚硫酸盐是常用的食品防腐剂和漂白剂，但是亚亚硫酸盐是常用的食品防腐剂和漂白剂，但

22、是亚硫酸盐容易引起哮喘，因此美国硫酸盐容易引起哮喘，因此美国FDAFDA规定了其在规定了其在新鲜水果和蔬菜等食品中的含量不得超过新鲜水果和蔬菜等食品中的含量不得超过1 11010- -6 6mol/Lmol/L。GroomGroom等人将亚硫酸氧化酶固定于玻璃电极上，制成等人将亚硫酸氧化酶固定于玻璃电极上，制成了测定亚硫酸盐的生物传感器，其灵敏度（检出下了测定亚硫酸盐的生物传感器，其灵敏度（检出下限）达到限）达到5nmol/L5nmol/L，线形范围为，线形范围为0-5mmol/L0-5mmol/L，电极在，电极在3mol/L3mol/L的硫酸盐溶液中的硫酸盐溶液中4 4o oC C保存保存2

23、 2个月活性不变。个月活性不变。天冬酰苯丙氨酸甲酯天冬酰苯丙氨酸甲酯，又称甜味素，是人工合成的，又称甜味素，是人工合成的低热量甜味剂。低热量甜味剂。GuilbaultGuilbault等将等将天冬氨酸酶固定于氨天冬氨酸酶固定于氨电极电极上，制成生物传感器，其检测线性范围为上，制成生物传感器，其检测线性范围为0.4-0.4-0.8mmol/L0.8mmol/L。4.4.污染微生物的检测污染微生物的检测MatssunageMatssunage等人开发出一种基于微生物在代谢过等人开发出一种基于微生物在代谢过程中能产生电子，电子直接在阳极上放电产生电流，程中能产生电子，电子直接在阳极上放电产生电流，通

24、过测定电流大小从而测定微生物浓度的传感器。通过测定电流大小从而测定微生物浓度的传感器。用该传感器能很好地检测用该传感器能很好地检测酿酒酵母酿酒酵母和和乳酸菌乳酸菌等微等微生物的数量生物的数量在发酵工业中的应用在发酵工业中的应用- -为发酵自动控制提供了新的基础平台为发酵自动控制提供了新的基础平台 发酵中葡萄糖测定发酵中葡萄糖测定 过去用操作繁琐时间长的还原糖方法只能过去用操作繁琐时间长的还原糖方法只能近似地估计葡萄糖的变化。近似地估计葡萄糖的变化。 现在提供了快速而准确的固定化酶的测定方现在提供了快速而准确的固定化酶的测定方法，发酵中可根据糖消耗确定微生物的生长速率，法，发酵中可根据糖消耗确定

25、微生物的生长速率，观察是否染菌，随时与产物的产生一起估算转化观察是否染菌，随时与产物的产生一起估算转化率，确定补料效果和及时判断发酵结束的时间。率，确定补料效果和及时判断发酵结束的时间。 发酵过程或设备异常现象通过葡萄糖分析得发酵过程或设备异常现象通过葡萄糖分析得到及时预报。到及时预报。 谷氨酸发酵液的分析谷氨酸发酵液的分析在谷氨酸发酵中，随时跟踪目标产物的产生。快在谷氨酸发酵中，随时跟踪目标产物的产生。快速获得主控参数的变化信息，使时间缩短了几十速获得主控参数的变化信息，使时间缩短了几十倍。倍。在发酵前期及时知道产酸出现时间在发酵前期及时知道产酸出现时间在发酵中期可根据谷氨酸产生速率，预知最

26、终的在发酵中期可根据谷氨酸产生速率，预知最终的产量，并获得补氨是否均匀的信息产量，并获得补氨是否均匀的信息在发酵后期，可根据谷氨酸产生速率变慢情况确在发酵后期，可根据谷氨酸产生速率变慢情况确定放罐时间和今后配料的调整定放罐时间和今后配料的调整在我国发酵工厂普及应用的谷氨酸- -葡萄糖双功能分析仪工厂发酵车间化验工厂发酵车间化验员正在分析样品员正在分析样品 乳酸传感器在发酵上的应用乳酸传感器在发酵上的应用 乳酸测定是生物传感器出现后新增加的控制乳酸测定是生物传感器出现后新增加的控制参数。实践中发现它的控制是获得发酵高产的关参数。实践中发现它的控制是获得发酵高产的关键。键。 乳酸是需氧发酵产物转化过程中的中间产物，乳酸是需氧发酵产物转化过程中的中间产物，是过程控制的敏感参数，与生物素的加入量、补是过程控制的敏感参数，与生物素的加入量、补糖、活菌数、菌活力、空气补给等控制直接相关。糖、活菌数、菌活力、空