益气活血中药延缓血管老化的作用与机制研究

1、1益气活血中药延缓血管老化的益气活血中药延缓血管老化的作用与机制研究作用与机制研究中国中医科学院中国中医科学院 雷雷 燕燕 陈可冀陈可冀 等等973项目分课题之一项目分课题之一2研究背景研究背景 血管老化（血管老化（vascular agingvascular aging）分为随增龄所致的生理性血分为随增龄所致的生理性血管老化和各种疾病引起的病理性血管老化，均表现管老化和各种疾病引起的病理性血管老化，均表现血管血管在在形态和功能上形态和功能上发生各种衰老变化，如发生各种衰老变化，如僵硬度增加、顺应性僵硬度增加、顺应性降低和动脉管壁增厚、降低和动脉管壁增厚、血管内皮功能低下血管内皮功能低下等等

2、血管老化血管老化是人体衰老的关键始发因素，也是老龄人群心血是人体衰老的关键始发因素，也是老龄人群心血管疾病风险增加的主要原因管疾病风险增加的主要原因 衰老的过程其实是一个动脉进行性硬化的过程，衰老的过程其实是一个动脉进行性硬化的过程，动脉硬化动脉硬化是衰老的根本原因，对衰老起决定因素的是血管而非年龄是衰老的根本原因，对衰老起决定因素的是血管而非年龄3研究背景 目前目前我国老龄人口比例以每年我国老龄人口比例以每年3%3%的速度递增的速度递增, ,老龄人群具有老龄人群具有心脑血管病发病率高的特点，心脑血管病发病率高的特点，高血压病、冠心病、心功能高血压病、冠心病、心功能不全、脑卒中等发生率随增龄急

3、剧上升，均存在着明显的不全、脑卒中等发生率随增龄急剧上升，均存在着明显的心血管老化的表现心血管老化的表现，即心血管系统结构和功能发生特征性，即心血管系统结构和功能发生特征性改变改变 随增龄出现的血管老化随增龄出现的血管老化问题已成为研究心血管病危险因素问题已成为研究心血管病危险因素及防治的新靶点，开展及防治的新靶点，开展心血管衰老的中医药干预研究心血管衰老的中医药干预研究，对，对延缓血管老化，防治心脑血管疾病具有重要意义延缓血管老化，防治心脑血管疾病具有重要意义4 血管老化属于血管老化属于血管病变血管病变的一种，可由增龄、高脂饮食、运动的一种，可由增龄、高脂饮食、运动减少、高血压、糖尿病、肥胖

4、等原因引起，老化的血管病理减少、高血压、糖尿病、肥胖等原因引起，老化的血管病理学表现为血管内膜增厚、血管硬化和动脉血压改变学表现为血管内膜增厚、血管硬化和动脉血压改变 随着对血管病变认识的深入随着对血管病变认识的深入, 已知血管壁病变而不是管腔病已知血管壁病变而不是管腔病变的发生发展才是各种心血管事件发生的基础；变的发生发展才是各种心血管事件发生的基础；在细胞和分在细胞和分子水平，血管老化表现在血管内皮细胞、平滑肌细胞和胞外子水平，血管老化表现在血管内皮细胞、平滑肌细胞和胞外基质水平的改变基质水平的改变 血管老化改变了各种心血管疾病的病理生理机制，从而改变血管老化改变了各种心血管疾病的病理生理

5、机制，从而改变了疾病了疾病发发生的阈值、严重程度和预后生的阈值、严重程度和预后老龄及血管老化概述老龄及血管老化概述老龄及血管老化概述老龄及血管老化概述血管老化与血管病变血管老化与血管病变5血管老化de主要表现p 脉搏波速度脉搏波速度(pwv) 是评价血管硬度的较好指标是评价血管硬度的较好指标p 脉压增大脉压增大是反映血管硬化的一项重要指标是反映血管硬化的一项重要指标p 颈总动脉内径颈总动脉内径反映血管壁弹性与伸展性随年龄而下降反映血管壁弹性与伸展性随年龄而下降,是衰老的标志是衰老的标志p 踝臂指数踝臂指数(abi)作为评估血管功能的指标，其降低反映作为评估血管功能的指标，其降低反映asp 晚期

6、糖基化终产物晚期糖基化终产物(age)随增龄在体内积累，是老年病的病理基础之一随增龄在体内积累，是老年病的病理基础之一p 活性氧活性氧(ros)水平异常增高在介导血管衰老中居于重要的地位水平异常增高在介导血管衰老中居于重要的地位p 肾素肾素-血管紧张素系统血管紧张素系统(ras) 调节血管细胞的凋亡、调节血管细胞的凋亡、vsmc 迁移、炎性反迁移、炎性反应及应及ecm重建等，重建等，ang是是ras的功能多肽的功能多肽p 基质金属蛋白酶（基质金属蛋白酶（mmp-2)与其抑制剂与其抑制剂(timp-2) 比值的调节可以控制血管比值的调节可以控制血管重构的发生、发展重构的发生、发展6中医学对血管衰

7、老的认识中医学对血管衰老的认识u认为虚损致衰。气（肾）虚夹瘀阻络是血管衰老的基本病认为虚损致衰。气（肾）虚夹瘀阻络是血管衰老的基本病机；延缓衰老应机；延缓衰老应补虚祛瘀法并用补虚祛瘀法并用u心血管疾病的基础病变和共同归路是血管老化，也是多种心血管疾病的基础病变和共同归路是血管老化，也是多种血管病变在血管病变在“入络入络”阶段异病同治的病理基础阶段异病同治的病理基础u益气活血药人参、三七是常见的具有抗衰老作用的天然药益气活血药人参、三七是常见的具有抗衰老作用的天然药物，均富含三萜类达玛烷型皂甙，国内外药理研究已证实物，均富含三萜类达玛烷型皂甙，国内外药理研究已证实此类有效成分有抗衰老作用，可达到

8、益气活血，祛瘀生新，此类有效成分有抗衰老作用，可达到益气活血，祛瘀生新，通脉活络的作用通脉活络的作用7研究目的研究目的u以以自然衰老自然衰老小鼠为模型，观察衰老小鼠血管老化所导致小鼠为模型，观察衰老小鼠血管老化所导致血管壁结构和功能的改变，血管壁结构和功能的改变，阐明血管衰老的可能机制阐明血管衰老的可能机制u通过复制通过复制内皮细胞内皮细胞( ec) 模型，揭示血管细胞衰老机制模型，揭示血管细胞衰老机制u观察益气活血中药能否通过产生观察益气活血中药能否通过产生ros的的nadph氧化酶氧化酶亚单位亚单位p47phox的途径的途径延缓血管老化延缓血管老化u揭示揭示益气活血益气活血中药中药人参三七

9、川芎人参三七川芎提取物延缓血管老化的提取物延缓血管老化的作用和机制作用和机制8研究方法研究方法 模型：模型：健康雄性健康雄性自然衰老小鼠自然衰老小鼠，14月龄，月龄，70只只复制复制衰老血管内皮细胞衰老血管内皮细胞（ec）模型）模型 分组：分组：衰老模型组、人参三七川芎高、中、低剂量组、衰老模型组、人参三七川芎高、中、低剂量组、 维生素维生素e组（组（vite组）、另设青年对照组组）、另设青年对照组 给药：给药：按照小鼠和人体重剂量折算系数关系，中药大、按照小鼠和人体重剂量折算系数关系，中药大、 中、小剂量相当于临床用量的中、小剂量相当于临床用量的2倍、倍、1.5倍、倍、1倍，倍， 维生素维生

10、素e50.0 mg/（kgd），），给药给药3个月个月9实验药物 中药制备：中药制备：l人参、三七、川芎人参、三七、川芎 按比例加入按比例加入3倍倍70乙醇提取乙醇提取3次，次，将醇提取液进行乙醇回收，浓缩至无醇味，制成中将醇提取液进行乙醇回收，浓缩至无醇味，制成中药浸膏，药浸膏，含含3.164 g生药生药/g浸膏浸膏 对照药：对照药： 维生素维生素e 购自购自sigma公司公司10研究内容构建自然衰老小鼠模型构建自然衰老小鼠模型观察观察行为学行为学改变改变胸主动脉胸主动脉messon染色及羟染色及羟脯氨酸含量测定脯氨酸含量测定检测血浆检测血浆ang含量含量血管组织抗超氧阴离子血管组织抗超氧阴

11、离子糖基化终末产物（糖基化终末产物（ages）mmp-2/ timp-2比值比值人参、三七人参、三七川芎川芎 干预干预复制衰老复制衰老vec模型模型细胞形态学观察细胞形态学观察衰老标志物衰老标志物-gal检测；检测；激光共聚焦观察激光共聚焦观察 ros；mmp-9、ages含量和含量和tgf-1的表达的表达流式检测线粒体膜电位流式检测线粒体膜电位细胞周期细胞周期观察指标观察指标11益气活血药延缓血管老化的实验研究益气活血药延缓血管老化的实验研究 ec部分部分 4代代 5代代 7代代 8代代 10代代 11代代 各代内皮细胞生长状况的比较各代内皮细胞生长状况的比较 12益气活血药延缓血管老化益气

12、活血药延缓血管老化-ec形态学观察形态学观察 中药高剂量组中药高剂量组 中药低剂量组中药低剂量组 光镜光镜 100 8代对照组代对照组 vite组组 第第8代自然衰老细胞，中药高剂量和代自然衰老细胞，中药高剂量和vite 组细胞较衰老模型组光镜下观察，组细胞较衰老模型组光镜下观察，内皮细胞生长状态好，数量较多，增殖较旺盛内皮细胞生长状态好，数量较多，增殖较旺盛13益气活血药延缓血管老化益气活血药延缓血管老化-内皮细胞内皮细胞b-gal染色染色 中药高剂量组中药高剂量组 中药低剂量组中药低剂量组 光镜光镜x400 8代对照组代对照组 vite组组 8代模型衰老组表达代模型衰老组表达b-gal蓝染

13、细蓝染细胞较多，约胞较多，约78%左右；左右；vite组阳性细胞数约组阳性细胞数约25%左右；中药高剂量组约左右；中药高剂量组约42%左右，低剂量组约左右，低剂量组约38%左右左右14细细 胞胞 周周 期期 8代衰老组代衰老组 vite组组 中药高剂量组中药高剂量组 中药低剂量组中药低剂量组 15细细 胞胞 周周 期期 与与vitevite组比较组比较, 8, 8代衰老模型组细胞周期向代衰老模型组细胞周期向g g0 0-g-g1 1期明显停顿，期明显停顿，g g2 2-m-m期细胞明显减少；与衰老模型组比较，中药高、低剂量组及期细胞明显减少；与衰老模型组比较，中药高、低剂量组及vitvit e

14、 e组组g g0 0- g- g1 1期细胞明显减少，处于期细胞明显减少，处于g g2 2-m-m期的细胞明显增多，差异有统计学期的细胞明显增多，差异有统计学意义；表明中药在一定程度上能够延缓细胞衰老，促进细胞增殖意义；表明中药在一定程度上能够延缓细胞衰老，促进细胞增殖16益气活血药延缓血管老化益气活血药延缓血管老化-细胞内细胞内ros含量含量（激光共聚焦）激光共聚焦）8代模型组代模型组 vite组组 中药高剂量组中药高剂量组 中药低剂量组中药低剂量组 激光共聚焦激光共聚焦x100中药高、低中药高、低剂量和剂量和vite组荧光强度组荧光强度较模型组明较模型组明显减弱；提显减弱；提示中药可通示中

15、药可通过减少细胞过减少细胞内活性氧产内活性氧产生，延缓细生，延缓细胞衰老胞衰老17细胞培养液抗超氧阴离子与细胞培养液抗超氧阴离子与no含量含量 8 8代衰老模型组抗超氧阴离子和代衰老模型组抗超氧阴离子和nono含量明显减少（含量明显减少（p0.05p0.05）；中药高、）；中药高、低剂量组抗超氧阴离子和低剂量组抗超氧阴离子和nono含量比衰老组明显增加，但较含量比衰老组明显增加，但较vitevite组含量降低，组含量降低，差异有统计学意义。提示差异有统计学意义。提示8 8代衰老代衰老ecec抗氧化能力下降，而中药能在一定程度上抗氧化能力下降，而中药能在一定程度上改善内皮的功能，增强抗氧化能力，

16、从而延缓细胞衰老改善内皮的功能，增强抗氧化能力，从而延缓细胞衰老18细胞细胞p47phoxp47phox、atat1 1r r、atat2 2r r蛋白表达蛋白表达 与与vite组比较，组比较，8代衰老组代衰老组p47phox，at1r，at2r表达明显上调；与表达明显上调；与8代衰老组比较，代衰老组比较，中药两组与中药两组与vit e组组p47phox表达明显下调，表达明显下调，at1r，at2r表达明显下调；与表达明显下调；与vit e组比较，组比较，中药两组中药两组p47phox，at2r表达上调，表达上调，at1r表达仅有上调趋势，无明显差异表达仅有上调趋势，无明显差异19益气活血药延

17、缓血管老化的整体研究（益气活血药延缓血管老化的整体研究（1） 一般情况一般情况 各组小鼠生活状况良好，体质量正常。青年组小鼠体毛各组小鼠生活状况良好，体质量正常。青年组小鼠体毛白且光泽，行动活泼，反应灵敏；其余各组小鼠体毛较白且光泽，行动活泼，反应灵敏；其余各组小鼠体毛较青年组颜色稍暗，动作稍迟缓；青年组颜色稍暗，动作稍迟缓；14月龄模型组小鼠，体月龄模型组小鼠，体毛蓬松，没有光泽，运动减少，动作相对较迟缓毛蓬松，没有光泽，运动减少，动作相对较迟缓20益气活血药延缓血管老化的整体研究（益气活血药延缓血管老化的整体研究（2） 中药中剂量组中药中剂量组 中药低剂量组中药低剂量组 维生素维生素e组组

18、 he x100 青年对照组青年对照组 衰老模型组衰老模型组 中药高剂量组中药高剂量组各组小鼠主动脉形态学比较各组小鼠主动脉形态学比较 衰老模型组小鼠血管壁出现典型的衰老表现，给予中药后的小鼠血管内膜中膜增厚不明衰老模型组小鼠血管壁出现典型的衰老表现，给予中药后的小鼠血管内膜中膜增厚不明显，内皮细胞脱落减少，仅有部分平滑肌细胞向内膜迁移，衰老改变不显著显，内皮细胞脱落减少，仅有部分平滑肌细胞向内膜迁移，衰老改变不显著21益气活血药延缓血管老化的整体研究（益气活血药延缓血管老化的整体研究（3） 各组小鼠主动脉各组小鼠主动脉masson染色结果比较染色结果比较衰老模型组小鼠血管壁平滑肌和胶原含量明

19、显增多，给予中药后胶原增生明显减少，高剂衰老模型组小鼠血管壁平滑肌和胶原含量明显增多，给予中药后胶原增生明显减少，高剂量组可使平滑肌细胞增生明显减少，衰老小鼠血管老化相对减缓量组可使平滑肌细胞增生明显减少，衰老小鼠血管老化相对减缓 青年对照组青年对照组 衰老模型组衰老模型组 中药高剂量组中药高剂量组 中药中剂量组中药中剂量组 中药低剂量组中药低剂量组 维生素维生素e组组 masson染色染色x100） 22主动脉主动脉masson 染色及染色及smc、cf相对含量相对含量(面积面积)比较比较 组别组别nsmc（平滑肌）（平滑肌）cf（胶原纤维胶原纤维 ）对照对照1424.30.2821.60.

20、40模型模型1431.90.86*29.90.80*中药高剂量中药高剂量1429.71.4824.60.38中药中药中剂量中剂量1430.51.4625.60.47中药中药低剂量低剂量1430.72.4226.10.53维生素维生素e1428.81.1424.50.43益气活血药延缓血管老化的整体研究（益气活血药延缓血管老化的整体研究（4 4）注：与对照组比较，*p0.05；与模型组比较，p0.05，下表同衰老模型组小鼠血管壁平滑肌和胶原含量明显增多，给予中药后胶原增生明显减少，衰老模型组小鼠血管壁平滑肌和胶原含量明显增多，给予中药后胶原增生明显减少，高剂量组可使平滑肌细胞增生明显减少，衰老小

21、鼠血管老化相对减缓高剂量组可使平滑肌细胞增生明显减少，衰老小鼠血管老化相对减缓23益气活血药延缓血管老化的整体研究（益气活血药延缓血管老化的整体研究（5）组别组别n n血浆血浆angang含量含量(ng(ng/l)/l)血管组织抗超氧阴离子血管组织抗超氧阴离子(u/l)(u/l)对照对照1414236.45236.4531.1231.1297.0697.063.813.81模型模型1414166.58166.5828.9428.94* *59.3459.344.564.56* *中药高剂量中药高剂量1414207.98207.9844.0544.0580.6180.612.902.90中药中剂

22、量中药中剂量1414176.40176.4045.4945.4969.1669.163.413.41中药低剂量中药低剂量1414168.61168.6144.4444.4465.8965.894.034.03维生素维生素e e1414186.84186.8452.7652.7681.5281.524.314.31各组血管组织抗超氧阴离子、血浆各组血管组织抗超氧阴离子、血浆ang含量比较含量比较注：与对照组比较，*p0.05；与模型组比较，p0.05，下表同中药灌胃后，小鼠血管组织中的抗活性氧生成能力比衰老模型组有一定程度的增强，说明中药灌胃后，小鼠血管组织中的抗活性氧生成能力比衰老模型组有一定

23、程度的增强，说明益气活血药可能通过减少活性氧的生成来延缓血管老化。衰老模型组益气活血药可能通过减少活性氧的生成来延缓血管老化。衰老模型组ang含量最低，对照含量最低，对照组最高，说明血浆中组最高，说明血浆中ang含量与血管老化的关系不密切，应进一步检测血管组织中含量与血管老化的关系不密切，应进一步检测血管组织中ang含量，确定与血管老化的关系含量，确定与血管老化的关系24各组血管组织中各组血管组织中ages含量及含量及mmp-2/timp-2比值比较比值比较组别组别n nages(ng/mlages(ng/ml) )mmpmmp2 (ng/ml2 (ng/ml) )timp-2 (ng/mlt

24、imp-2 (ng/ml) )mmp-2/timp-2mmp-2/timp-2对照对照141459.5559.551.851.85180.93180.9310.4610.460.640.640.0830.083286.50286.5028.2428.24模型模型1414215.89215.891.171.17* *246.48246.485.355.35* *0.310.310.0070.007* *794.53794.5325.1225.12* *中药高剂量中药高剂量1414142.57142.571.281.28205.51205.5110.3610.360.500.500.0320.03

25、2413.14413.1430.2130.21中药中药中剂量中剂量1414152.14152.141.521.52222.30222.306.936.930.390.390.0080.008565.28565.2820.4120.41中药中药低剂量低剂量1414170.54170.541.661.66224.79224.799.549.540.360.360.0070.007628.58628.5828.1728.17维生素维生素e e组组1414141.29141.291.591.59205.19205.194.144.140.510.510.0060.006401.95401.959.58

26、9.58注：与对照组比较，*p0.05；与模型组比较，p0.05青年小鼠青年小鼠ages含量较少，而老年小鼠含量较少，而老年小鼠ages含量较多，给予中药灌胃后，老年鼠血管中含量较多，给予中药灌胃后，老年鼠血管中ages含量有不同含量有不同程度的降低，说明益气活血药在一定程度上降低动脉僵硬度，从而延缓血管的老化。而衰老模型组程度的降低，说明益气活血药在一定程度上降低动脉僵硬度，从而延缓血管的老化。而衰老模型组mmp-2 、mmp-2/ timp-2最高，最高，timp-2含量最低，表明衰老小鼠已出现年龄相关的血管重构，中药各组小鼠含量最低，表明衰老小鼠已出现年龄相关的血管重构，中药各组小鼠mmp-2 、mmp-2/ timp-2明显降低，表明中药可能通过抑制明显降低，表明中药可能通过抑制mmp-2生成、增强生成、增强timp-2的活性，减少血管壁的活性，减少血管壁emc降解，降解，从而延缓血管老化从而延缓血管老化益气活血药延缓血管老化的整体研究（益气活血药延缓