基于Cytb基因、28SrDNA序列分析对蕨叶蜂亚科系统发育的研究毕业论文

1、1 引言昆虫纲是动物界种类最丰富的一个类群，研究昆虫的系统学和系统发育对了解生物进化以及进化机制都有重要意义。叶蜂总科(tenthredinoidea)隶属于昆虫纲膜翅目(hymenoptera)广腰亚目(symphyta)，种类极多，分布广泛。叶蜂科是叶蜂总科最大的科，大概有7000余种，已知5000种以上，中国种类超过300属2000种,这个类群对农、林害虫种群控制和保持生态平衡起到一种关键性的自然调控作用。长期以来，传统的叶蜂分类学和系统发育研究主要依赖于形态解剖特征、生物学性状以及生物地理学信息等，因为外部形态等比较直观，容易得到。这些分类依据在大多数情况下能清晰地反映一个物种的分类地

2、位或系统发育关系1-3。传统的昆虫系统学和系统发育研究主要依赖形态解剖特征、生物学性状以及生物地理学信息等，这些依据在大多数情况下能清晰的反映一个物种的分类地位或系统发育关系。但随着学科的发展也遇到了一些传统方法难以解决的困难，例如，一些近缘种很难确定其分类地位，对于种群、生态型的研究更是如此。生物大分子如dna和蛋白质是生命活动所必需，其中核酸携带了生物的所有遗传基因。berlocher(1984)以昆虫分子系统学4（insect molecular systematics）为题首次专门介绍了分子技术在昆虫系统学研究中的应用及其数据分析方法。20年来，昆虫分子系统学快速发展，目前应用核酸序列

3、分析技术测定昆虫特定的核苷酸序列，以比较不同昆虫之间的演化关系，建立符合自然发育的分子系统谱系，是昆虫分子系统发育方面的主要研究方向之一。coi基因是mtdna13个蛋白质编码基因之一。该基因的产物是细胞色素氧化酶亚基i，后者是细胞色素氧化酶的重要组成部分。细胞色素氧化酶在呼吸链电子传递和质子的跨膜反应中发挥着巨大作用，在真核生物中它由多个亚基组成，其中亚基i，ii和iii由线粒体dna编码，其余为核基因编码。这些亚基多为跨膜蛋白，跨过线粒体的内膜，亚基i和11组成酶的催化核心。col是细胞色素c氧化酶中最大和最保守的亚基，叶蜂中col全长860bp。研究叶蜂亚科生物学一方面在生产上有助于害虫

4、治理，另一方面，通过研究其系统演化及在各个地质时期的分布变迁，研究其和寄主植物的协同演化关系，将有助于人类对自然界的演化规律、物种多样性及地球表面环境变迁(大陆漂移、陆地表面的升降等)的认识，有助于人类更好地保护和利用我们赖于生存的环境。1.1 研究背景及研究内容在昆虫分子系统学研究中主要应用细胞核dna、mtdna和rdna。其中细胞核dna或mtdna的序列分析是一项最急需的技术，它提供了大量的详细资料。而mtdna在进化研究中非常有用，一直应用于种群结构和基因流、杂交、生物地理学和系统发育的研究5 。mtdna小、相对快的进化速率和母本的遗传特性使得它很适合于种群历史和亲缘关系相近的分类

5、单元间进化的研究68 。mtdna主要用于rflp和克隆后或pcr扩增后的测序910 。1.1.1 核基因序列生物的性状基本由核基因决定。核基因中含有更加丰富的生物学信息，用适当的核基因研究昆虫的系统发育，其结果更有可能比较真实地反映出昆虫的进化历史。核基因有以下优点：1)核基因一般比线粒体基因进化得慢，这使它们成为一种解决分歧久远的类群关系比较好的标记；2)核基因构建的树普遍有比较高的ci值，与线粒体基因相比更有助于整棵树的解决；3)核基因的碱基位点速率变异有更高的同质性；4)核基因的碱基替代速率距阵比线粒体基因的要均匀。细胞色素b是一个横贯膜两侧的极端疏水性的蛋白。对细胞色素b氨基酸组成和

6、结构基因的脱氧核糖核酸(dna)顺序研究指出,约68的氨基酸为非极性的。对细胞色素b在电子传递链中的复杂功能至今还不清楚。1.1.2 线粒体基因(mtdna)序列mtdna 广泛存在于昆虫体内富含线粒体的飞行肌中和卵内,昆虫的mtdna 大小一般为15141613 kb，以高拷贝数目存在于线粒体内。相对于核dna 来说，mtdna 是一个封闭的环状双链，核酸序列和组成比较保守，以它作为模板制作的pcr 反应引物的通用性比较强。对进化过程中不同生物体的dna 序列的核苷酸替换率的比较研究发现，mtdna 基因组的替换率比核dna 高510 倍。mtdna 基因组中不含间隔区和内含子，无重复序列和

7、不等交换，在遗传过程中不发生基因重组、倒位、易位等突变，并且遵守严格的母系遗传方式，可以简单地认为mtdna 是克隆型。正是由于以上结构和进化上的特点，mtdna 已成为研究生物(主要是动物) 进化的重要材料。国内已有很多学者利用mtdna上的不同基因组对昆虫纲内不同分类阶(单) 元之间的系统发育关系进行了研究。印红11将我国直翅目蝗总科8 科8个种和从互联网genbank 中检索到相关物种的线粒体基因组16s rrna序列片段进行同源性比较，计算核苷酸使用频率，并构建分子系统树。胡婧12年以网翅蝗科的6种昆虫作为材料，通过特异性引物，对mt 16s rrna基因序列进行了扩增。刘殿锋13测定

8、了斑腿蝗科10亚科20种蝗虫和其他蝗科3种蝗虫的线粒体16s rrna部分序列，并从genbank中下载了15种蝗亚目昆虫的16s rrna基因相应序列片段。刘晓丽在2004年报道了9种拟步甲16s rdna 部分序列及其亲缘关系，部分拟步甲16s rrna和和18s rrna基因序列与分子系统14-15。现有的研究结果表明，快速进化的基因或者核苷酸区段（如线粒体dna、线粒体的rrna的igs区域）适合于种内或近缘种的系统发育分析；慢速进化的基因（如核糖体dna及其产物rrna）适合于远缘种类或高级阶元的系统发育。有学者认为，由于核基因没有线粒体基因的替代偏异特征，昆虫分子系统学应该更加关注

9、核基因数据而不是线粒体基因数据。总之，当前运用核基因序列或将核基因序列与线粒体基因相结合研究昆虫的系统发育正成为该领域的一种发展趋势。虽然应用dna 序列分析等分子手段来探讨昆虫不同类群之间的系统关系是当今昆虫系统学研究的热点。但是目前在实验技术、资料积累、数据处理分析以及序列数据的可比性等方面还有待于进一步的完善和充实。1.2分子系统树构建方法分子系统学的主要目的是根据分子数据构建系统树，已有很多统计学方法可以用于分析分子数据来重建系统发育树，通常使用的方法分为4类：距离法、简约法、似然法以及贝叶斯法。距离矩阵法（distance matrix method）首先获得所有分类群间的进化距离，

10、再基于这些距离值之间的关系构建系统发育树。包括两种方法，算术平均的不加权对群法（upgma），类群间的距离是两个类群内所有成员成对距离的平均值，聚类结果可用树状图表示，分支点是两个序列间的中间点。一对序列间的距离是分支长度的总和。邻接法（neighberjointingmethod）原理是逐渐寻找新的近邻，使最终生成的分支树的总长度达到最小。它只产生一个带有分支长度估计的拓扑结构。简约法（parsimony method）中最大简约法是获得最简约的进化途径。所产生的最大简约树中，所有类群的性状状态的变化总数也最小。对dna序列而言，理论上每个位点均可以构建三种可能的谱系树，然而并非所有的位点都

11、可用于重建系统发育关系。可用于构建最大简约树的位点称为信息位点。最大似然法（maximumlikelihoodmethod，ml）对每个谱系拓扑结构，计算出可观察到符合特定替代模式的一组特定的序列数据的最大概率（似然率），然后挑选最大似然值最高的拓扑结构（树分支图）作为重建的谱系树。以核酸替代模型为基础，ml法需要确定每个分支在一定时间间隔内核苷酸发生特定替代变化的概率。贝叶斯法16（bayesain analysis）建立在ml基础上的但比ml更为捷径的一种统计学方法，它采用了ml法的基本原理，同时引进了马尔科夫链蒙特卡洛方法(the markov chain monthe carloanl

12、ysis，mcmc)途径，将运算效率提高，大大地缩短运算时间，最终获得一组似然率最大树构成的合意树，直接估算贝叶斯后验概率(bayesain posterior probabilities)。目前还没有一种构树方法可以适合所有的数据和各种条件。在距离矩阵法中，upgma法隐含了所有支系上速率相等的假设。邻接法和转换距离法不包括速率一致的假设，但均采用校正距离矩阵来减少各分支不同速率的影响。这些方法依赖校正距离系数的准确性。当序列之间的进化速率差异很大或替代型式不同时，同型事件出现的可能性就较大，这也直接限制了简约法的应用。swofford17提出了最大简约法中转换替代和颠换替代赋予不同权重的计

13、算算法，但该方法仍需要假定转换替代与颠换替代的比率。计算机模拟研究表明：在进化速率恒定的前提下，最大似然法的结果质量则依赖序列进化模式的确定。在进化速率可变的前提下，最大简约法略差于转换距离法和邻接法，最大似然法结果最优。然而，如果转换替代的频率大大颠换替代时，邻接法要优于最大似然法的结果。1.3 叶蜂科昆虫分子系统发育研究现状 一般认为，叶蜂总科包括三节叶蜂科(argidae),四节叶蜂科/梨室叶蜂科（blasticotomidae),锤角叶蜂科（cimbicdae）,松叶蜂科（diprionidae）,筒腹叶蜂科（pergidae),叶蜂科(tenthredinidae)。研究叶蜂总科内部

14、的系统关系对解决整个广腰亚目之间的关系有至关重要的作用。2003年schulmeister1提出了叶蜂总科的系统关系: （叶蜂科（不包括残青叶蜂科）+ 锤角叶蜂科 + 松叶蜂科）是单系群，并且作为（三节叶蜂科+ 筒腹叶蜂科）的姐妹群，显然是叶蜂科的并系，而去除残青叶蜂科外的其余叶蜂科类群是单系17。schulmeister对分子数据独立分析所得叶蜂总科内部的分支与vilhelsmsen不同，也未出现vespina。叶蜂总科内的节点目前大部分还处于模糊状态。中国叶蜂研究的工作在新中国成立以后繁荣起来，叶蜂研究的工作者越来越多，中国科学院动物研究所的朱弘复、王林瑶、袁德成，中国林业科学研究院的黄孝

15、运、周淑芷、肖刚柔、吴坚、张真等先后报道了中国一些叶蜂的新种18-27。萧刚柔先生于1991年总结了中国叶蜂的系统分类研究成果 28。从20世纪90年代开始，中南林业科技大学昆虫系统与进化研究组的魏美才、聂海燕、张少冰、钟义海、邓铁军、陈明利、黄宁廷等都对中国叶蜂研究工作做出了突出贡献，发现大量新种，并建立了许多新属。2006年魏美才等系统回顾了中国叶蜂系统学和生物地理学研究历史，给出了中国叶蜂种类名录和研究文献目录。叶蜂总科是广腰亚目最大的总科，中国己记载6个科，分别为三节叶蜂科argidae，叶蜂科tenthredinidae，松叶蜂科diprionidae，锤角叶蜂科cimbicidae

16、，筒腹叶蜂科pergidae和茸蜂科blasticotomidae。2 材料与方法2.1 标本及来源本研究提取了叶蜂科昆虫10个样品的基因组dna，标本是中南林业科技大学昆虫系统与进化生物学实验室人员在野外采集的近三年标本，100% 酒精浸泡，20保存。魏美才博士完成标本鉴定。实验选取叶蜂成虫胸部提取基因组dna，残骸继续用酒精保存以做证据。提取的dna和残骸标本均保存于中南林业科技大学昆虫系统与进化实验室。以蕨叶蜂亚科selandriinae、平背叶蜂亚科allantinae、巨基叶蜂亚科megabelesesinae及蔺叶蜂亚科belesesinae为内群，从genbank下载runari

17、a reducta的28s dna及cytb基因序列做为外群。样本详情见表1。 表1 蕨叶蜂亚科与其它各亚科系统发育研究选用类群信息 table.1 specimens information of tenthredinidae researched in this study 所属类群 基因序列号 采集地点采集时间科 亚 科属 种 名cytb28srdnain grouptenthredinidaeselandriinaeaneugmenusaneugmenus frontalis 00湖北宜昌神农架2010.5aneugmenus pteridii00湖南东安舜皇山2010.7neostr

18、ombocerosneostromboceros nipponicus00湖南东安舜皇山2010.7euforsiuseuforsius pieli00湖南浏阳大围山2010.5allantinaetaxonus taxonus attenatus00浙江临安清凉峰2010.5linomorphalinomorpha flava00浙江临安清凉峰2010.4allantusallantus nigrocaeruleus00湖南东安黄泥洞2010.7megabelesesinaemegabeleses megabeleses liriodendrovorax00湖南浏阳大围山2010.5bele

19、sesinaeabeleses abeleses rufotibialis00湖南东安舜皇山2010.7belesesbeleses nigroapicalis00湖南浏阳大围山2011.4out groupblasticotomidaerunariarunariarunaria reductaef032212gq374688注: “0”表示本次实验所得序列, “no”表示序列缺失, 有序列号标注的为ncbi中下载的序列. 2.2 实验用品2.2.1 主要仪器pcr扩增仪：2720 thermal cycler，凝胶成像仪：tanon2500r, 稳压稳流电泳仪：dyy8c，长沙平凡仪器仪表有

20、限公司，台式高速离心机：tg16w，移液枪：eppendorf，数显恒温水浴锅：hhs26，实验室超纯水器：p105w，多功能漩涡混合仪：230/240vac。2.2.2 主要试剂溴代十六烷基三甲胺（ctab）；tris饱和酚；乙二胺四乙酸（edta）；溴化乙锭（eb）；taq dna聚合酶（takara）；琼脂糖；250bpdna marker；其余试剂均为分析纯； 实验所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。2.2.3 主要溶液dna提取常规溶液配制：te溶液（ph8.0）：10mmol/l tris-hcl，（ph8.0，1 mmol/l edta（ph8.0）2ctab 100ml提取

21、液：ctab 2g，nacl 1.4m，tris-hcl（ph8.0）0.1m， edta（ph8.0）0.02m，pvp（1%）1g。氯仿:异戊醇=24:1。tbe缓冲液（5储存液）：每升含54g tris碱，27.5g硼酸，20ml 0.5mol/l edta（ph8.0）。2.3 实验方法2.3.1 基因组dna的提取本文采用ctab法和试剂盒法提取叶峰基因组dna。提取具体步骤如下：1 将2%ctab buffer 预热至60。2 将100%酒精浸泡过的叶峰标本用1te buffer 浸泡两次，每次15min。3 解剖叶峰，取个体胸部肌肉组织，于1.5ml离心管中液氮研磨；待液氮完全挥

22、发，加入600ul 2% ctab buffer（已预热）。4 在所得溶液加入2ul 25mg/mlprok(终浓度100mg/ml)和1.0ul -巯基乙醇溶液，轻轻摇匀。5 将上述所得溶液于60下恒温水浴34h。6 从水浴锅中取出溶液，于4 7000rpm下离心3min，取上清液，去杂质碎片。7 在上清液中加入4等体积氯仿/异戊醇（24:1）混合液混匀，然后在7000rpm下离心10min，取上层清液，量体积；重复一次。8 在上层清液中加入2倍体积无水乙醇（20）沉降dna过夜。9 dan沉降溶液于4 10000rpm下离心15min，取沉淀，小心弃上清。10 用4 200ul 75%酒精

23、洗涤沉淀10000rpm下离心3min，弃上清；重复一次。11 自然干燥。12 用40ul te buffer重溶所得基因组dna，然后，置20保存备用。2.3.2 pcr扩增（1）28s dna基因扩增引物：上游：5-gacccgtcttgaaacacgga-3；下游：5-cccacagcgccagttctgcttacc-3。（2）pcr反应循环体系及参数pcr反应体系1为50ul体系，成分如下：浓度体积ddh2o34.5ulprimer buffer5ulmix dntp4ulprimer110ul/mol2ulprimer210ul/mol2ultemplate2ultaq dna po

24、lymer 酶0.5ul28s dna基因的pcr反应的参数：94预变性1分钟，33个循环（94变性30秒，55退火30秒，72延伸60秒）；最后72延伸10分钟。后期更换为pcr反应体系2，亦为50ul体系，成分如下：浓度体积taq mastermix25ulprimer110ul/mol2ulprimer210ul/mol2ultemplate2ulrnase-free water19ulpcr反应体系2的反应参数为：由于实验样品有限，在实验后期更改为25ul体系，即以上两个反应体系的每种成分均减半。2.3.3 pcr产物检测、纯化及测序pcr产物检测,取5ul的反应产物，经0.8%琼脂糖

25、凝胶电泳后（57v，0.5小时）eb染色0.5小时，在凝胶成像系统中检测是否有目标条带并照相；产物的纯化和测序均有上海博尚生物技术公司完成。 2.3.4 数据处理的相关软件(1)bioedit 5.0.629 bioedit是一个生物序列编辑器可在windows 95/98/nt/2000中运行，它的基本功能是提供蛋白质核酸序列的编辑排列处理和分析，其直观的菜单式的并有大量的图示提供用户一个外部分析程序的图形界面。 (2) clustalx 1.8330clustalx是一个使用最广泛的菜单操作的多序列比对程序，在任何主流的计算机平台上都可以免费使用31。这个程序基于渐进比对的思想，得到一系列

26、序列的输入，对每两个序列进行成对比对(pairwise alignment)并且计算结果。(3) mega 4.132 mega 是 molecular evolutionary genetics analysis 的简称，由 sudhir kumar 等人编写是一个用于序列分析、比较统计和系统发育分析的免费软件包，其操作界面清晰简单，主要功能包括核酸和蛋白质序列的多序列比对、对比对序列的统计分析，估算进化距离(genetic distance)和标准误、和系统树的推断和检验等32。(4) paup4.033 paup是 phylogenetic analysis using parsimon

27、y的简称，是一款用于构建进化树（系统发育树）及进行相关检验的软件，包含了众多分子进化模型和方法，可利用最大似然法、简约法、距离法等分析分子数据（dna、蛋白质序列）、形态学数据及其他类型的数据。截至目前，paup是应用最广泛的系统发育分析软件。2.3.5 外群的选择选取runaria reducta 这个种为外群。2.3.6 系统发育关系分析将所得双向测序结果输入contigexpress软件中，辅以bioedit软件进行序列拼接和序列编辑。此程序可自动对序列进行编辑选择，当然也可手工对其进行编辑，最后将编辑后的最终序列输出，保存成fasta格式。然后用clustalx进行计算比对，再用meg

28、a 4.1 统计28s dna基因序列碱基组成，计算遗传距离。本文选用nj、me和mp分析法构建系统发育树。nj、me分析法建立的发育树在mega4.1中完成，mp法建立的发育树在paup4.0中完成。3 研究结果与分析3.1 pcr扩增结果本文共提取了10个样品的28s dna基因，扩增结果如图1.2所示。图1所测样品pcr检测结果1 m 1 2 3 4 注：m：marker：200bpdna，从下往上依次是200bp，400bp，600bp，800bp，1000bp,1200bp.图中，1：arge xanthogaster；2：arge vulnerata； 3：arge lingulo

29、pygia； 4：eutomostethus formosanus。图2 所测样品pcr检测结果2 m 1 2 3 4 5注：m：marker：200bp； 1：pachyprotasis wui； 2：pachyprotasis sellata； 3：cibdela chinensis； 4：megabeleses liriodendrovorax； 5：aneugmenus pteridii。从以上图1、图2可以看出，28s dna的引物扩增结果特异性强，条带均清晰，测序长度约在1050bp。3.2基因序列长度和碱基组成基因部分序列经clustalx1.83比对后对位排列，测得的 28s

30、rrna基因部分片段比对后长为1086bp，用mega4.0计算出保守位点为837个，变异位点239个，简约信息位点155个。28s rrna基因序列的长度和碱基组成见表2：表2 28s rrna基因片段长度以及碱基组成speciest(u) c a g total55 euforsius pieli 28s87 aneugmenus frontalis 28s173 aneugmenus pteridii175neostrombceros nipponicus91 megabeleses liriodendrovorax58taxonus attenatus 28s63 linomorpha

31、 flava 28s153 allantus nigrocaeruleus178 abeleses rufotibialis219 beleses nigroapicalicrunaria reductadownloadavg.19.7 26.9 22.9 30.4 109519.9 26.9 22.6 30.6 108220.0 26.8 23.1 30.2 106118.9 27.2 22.9 31.0 106919.7 27.2 22.5 30.6 107219.8 27.3 22.1 30.8 102919.3 26.9 23.0 30.7 109119.9 26.6 22.9 30.

32、5 111320.5 26.7 22.3 30.5 111719.7 27.7 22.7 30.0 108119.3 26.8 22.0 31.9 122019.7 27.0 22.6 30.7 1093.6由表2统计结果可知28s rrna平均碱基组成为：t：22.5%；c：30.6%；a：19.9%；g：27.1%，碱基组成没有明显ta的偏好。3.3 碱基替换统计与遗传距离3.3.1 碱基替换统计对28s dna基因序列进行碱基替换统计结果见表3表3 28s rdna基因序列碱基替换统计表domainiisisvrtotaldomaininfoavg102221121.61057.0dat

33、a1st342732.4351.6 1st pos data2nd3381071.4354.4 2nd pos data3rd342541.2351.1 3rd pos data对28s rdna基因序列进行碱基替换统计结果见表4表4 cytb dna基因序列碱基替换统计表domainiisisvrtotaldomaininfoavg4121061370.8654.3data1st14133410.8215.4 1st pos data2nd13142460.9219.1 2nd pos data3rd13931500.6219.9 3rd pos dataii表示不变位点 ii = iden

34、tical pairssi表示转换位点 si = transitionsal pairssv表示颠换位点 sv = transversional pairsr 表示转换与颠换的比值 r = si/svdomain表示统计内容 total表示总长 domain info表示统计所包括的位点利用表3中统计结果计算出28s dna转换取代(transition)的速率为3.74%，颠换取代(transversion)的速率为2.68%，颠换取代的速率略低于转换取代的速率，转换速率与颠换速率之比r=1.4。3.4 28s rdna分子系统树图1:28s rdna基因部分序列经 mega分析产生nj树扩

35、朴结构图。nj分析选用的模型是kimura 2-parameter，在 nj分析树中只有属内种形成了一个分支，构成了单系群，结果表明：28s dna平均碱基组成无明显ta的偏好，而cytb基因碱基组成有明显ta的偏好。采用nj、me和mp法建分子系统树分析它们在分子水平的系统发育关系，结果表明：各亚科内均独立形成一支，成为单系群。图2：28s rdna基因部分序列经 paup分析产生mp树拓扑结构图。图3: 28s rdna基因部分序列经 paup分析产生me树拓扑结构图。结 论叶蜂总科是广腰亚目中最大的总科，长期以来，叶蜂总科昆虫的系统学都是建立在形态学的基础上，叶蜂总科昆虫在亚科水平争议一

36、直就比较大。分子数据有极强的遗传学基础，是客观、真实、可量化的，利用分子数据可以弥补形态学上的不足。目前dna序列数据已广泛应用于昆虫系统学研究中，并取得了一定的结果。本文研究的类群为叶蜂总科昆虫一小部分种类，用nj法对28s dna基因的部分片段以进行系统发育重建，结果发现不同方法对同一序列构建的分子系统树的拓扑结构不太相同。基因序列建树比较表明：测得的28s dna基因部分序列构建的分子系统树不能推断叶蜂总科昆虫之间的明确关系，原因是这段序列过于保守，没有足够的简约信息位点，不适合作为叶蜂科昆虫科级及科级以下阶元系统发育的分子标记。叶蜂总科中6个科的演化关系复杂。在进一步的研究中，应增加样

37、本的种类和数量，使分类单元更具代表性， 本文研究的叶蜂总科昆虫只有5属，以后可以增加更多的研究类群。本实验所用的是核糖体的基因，测得的序列长度不够长，在未来的工作中我们可以延长核酸序列的长度，使其包含更大的遗传信息；可以加入一些编码蛋白质的基因，如co和ef1-a基因这些分子标记，把更多的基因联合起来分析；另外，本文仅用了nj 一种方法构建分子系统树，还可结合 baysain 和ml 多种统计学方法来综合讨论这些类群之间的关系。致谢这篇论文是在 老师的悉心指导和严格要求下完成的。从论文的选题、实验操作、研究方法、结果分析、直至论文的审定都饱含着她众多的辛劳。老师严谨的治学态度、忘我的工作精神、

38、敏锐的学术洞察力、谦逊平和的性格、诲人不倦的育人风格是我做人和学习的楷模，也是我今后努力和学习的方向。在此，特向老师致以崇高的敬意和衷心的感谢!本文自开题至成文，除受老师指导外，特别要感谢 在我们的实验操作、论文撰写及生活各个方面的帮助。同时跟我一起实验的同学对我的帮助也是我实验及论文能完成不可缺少的，对他们也表示内心的感谢。最后，深深感谢在工作和求学之路上，所有关心和帮助过我的人。参考文献1 schulmeister, s.simultaneous analysis of basal hymenoptera (insecta) : introducing robust-choise sens

39、itivity analysis j. biol j linn soc, 2003, 79: 245-275.2 schulmeister , s. review of morphological evidence on the phylogeny of basal hymenopera ( insecta ), with a discussion of the ordering of characters j. biol j linn soc, 2003, 79: 209-243.3 vilhelmsen, l. phylogeny and classification of the ext

40、ant basal lineages of the hymenoptera (insecta) j. zoological journal of the linnean society, 2001, 131: 393-4424 程家安, 唐振华. 昆虫分子学m. 北京:科学出版社. 2001. 25 avise j c, amold j, ball rm et al. 1987. intraspecific phylogeography : the mitochondrial dna bridge between population genetics and systematics. ann

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