Chapter 8 RNAprocessing

1、Chapter 8RNA processing一、一、RNA的加工：的加工： 将各种前体将各种前体RNA分子加工成成熟的、有活性分子加工成成熟的、有活性的的RNA的过程的过程二、场所：二、场所： 主要是在细胞核内进行主要是在细胞核内进行第一节第一节 概述概述三、三、RNA加工的类型：加工的类型：1、剪切剪切：就是剪去部分序列；：就是剪去部分序列；2、剪接剪接：是指剪切后又将某些片段连接起来。：是指剪切后又将某些片段连接起来。3、末端添加核苷酸末端添加核苷酸：如：如 tRNA的的3-末端添加末端添加-CCA。4、修饰修饰：在碱基及核糖分子进行化学修饰。：在碱基及核糖分子进行化学修饰。5、RNA编

2、辑编辑：某些：某些RNA，特别是，特别是mRNA自自DNA模模板上所获得的遗传信息，在转录后又发生了变化。板上所获得的遗传信息，在转录后又发生了变化。 一、原核生物一、原核生物rRNA的加工的加工 第二节第二节 rRNA 的加工的加工16S rRNA23S rRNA5S rRNAtRNAtRNA大肠杆菌最初的转录物（大肠杆菌最初的转录物（30S ）1、核糖核蛋白复合体（、核糖核蛋白复合体（RNP） 形成形成 初生转录物形成一些茎环结构，随后与一些蛋初生转录物形成一些茎环结构，随后与一些蛋白结合形成核糖核蛋白复合体（白结合形成核糖核蛋白复合体（RNP）茎环结构茎环结构RNP原核生物原核生物rRN

3、A的加工的加工（RNA酶）2、甲基化修饰：、甲基化修饰：（通常是（通常是A） 甲基供体甲基供体- S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸3、剪切：、剪切：（1）Rnase剪切释放出剪切释放出5S，16S，23S前体分子；前体分子；（2）随后）随后RNA酶酶M5, M16, M23分别在每一前体分分别在每一前体分子的子的5端和端和3端进行剪切。端进行剪切。二、真核细胞二、真核细胞rRNA的加工的加工（一）概述（一）概述 1、rRNA基因：基因： RNA聚合酶聚合酶转录转录转录物需要加工转录物需要加工 2、5s rRNA 基因：基因： RNA聚合酶聚合酶转录转录-转录物一般不需加工转录物一般不需加工Mamm

4、als18S rRNA5.8S rRNA28S rRNA47S pre-rRNA(13500nt)100 site 2-O-methlsnoRNPMature rRNAsETS1ITS1ITS2ETS245S pre-rRNA41S pre-rRNA20S+32S pre-rRNA5.8S - 28S Base pair（二）真核细胞（二）真核细胞rRNA前体的加工过程前体的加工过程18S rRNA5.8S rRNA28S rRNA（1）广泛地进行甲基化修饰，主要是在）广泛地进行甲基化修饰，主要是在28S及及18S中。中。（2）除掉外部转录间隔区）除掉外部转录间隔区(ETS)1和和2，再切去内

5、部，再切去内部转录间隔区（转录间隔区（ITS），释放出），释放出32S和和20S的两个前的两个前RNA。 （3）随后）随后45 S rRNA前体经核酸酶顺序剪切下生成前体经核酸酶顺序剪切下生成18S、5.8S、28S rRNA。真核细胞真核细胞rRNA前体的加工过程前体的加工过程第三节第三节 tRNA的加工的加工一、原核生物一、原核生物tRNA的加工的加工1、tRNA的编码序列的编码序列n大肠杆菌大肠杆菌rRNA 操纵子中含有操纵子中含有tRNA的的编码序列编码序列ntRNA 的操纵子：含的操纵子：含7个个tRNA 基因基因2、原核生物、原核生物tRNA的加工过程的加工过程 初始转录物 RNa

6、se D, E, F and P 具有成熟末端的tRNA Base modification 成熟tRNA内切核酸酶（内切核酸酶（Rnase E、F）在）在3 端切除一个侧翼序端切除一个侧翼序列，在前体的列，在前体的3 端留下一个额外的九核苷酸端留下一个额外的九核苷酸外切酶外切酶RNaseD 依次切去依次切去3 端的端的7个核苷酸个核苷酸内切酶内切酶RNaseP切除切除5 端的一段，产生成熟的端的一段，产生成熟的5 端端外切酶外切酶RNaseD继续除去继续除去3 端剩余的两个核苷酸直至端剩余的两个核苷酸直至CCA，产生成熟的，产生成熟的3 端端34Modified bases二、真核生物真核生

7、物tRNA的加工的加工1、tRNA 前体5端有 16 nt 的前导序列 14 nt 内含子3端有 2个额外的核苷酸2、真核生物、真核生物tRNA的加工的过程的加工的过程去除5 前导序列和 3 额外的核苷酸3 端添加CCA，产生成熟3 端内含子的剪接碱基修饰CCA 的添加的添加tRNA核苷酸转移酶（tRNA nucleotidyl transferase）三、真核三、真核tRNA的加工和原核的区别的加工和原核的区别1、真核、真核tRNA前体中无二聚体和多聚体；前体中无二聚体和多聚体；2、增加了剪接内含子的过程；、增加了剪接内含子的过程；3、真核生物、真核生物CCA多由多由tRNA核苷酸转移酶核苷

8、酸转移酶添加，添加，而原核多由而原核多由tRNA基因编码。基因编码。第四节第四节 前体前体mRNA的加工的加工原核原核真核真核geneOperon intronmRNAPolycistronic monocistronicPre-mRNAmRNA processing 5-cap, poly(A) tail Longer-livedTransport to cytoplasm 一、原核生物与真核生物基因表达的差异一、原核生物与真核生物基因表达的差异二、核内不均一二、核内不均一RNA（hnRNA）-RNApol的产物的产物 hnRNP： hnRNA+蛋白蛋白 前前mRNA snRNP：snRNA

9、+蛋白蛋白 功能：参与前功能：参与前mRNA的剪接的剪接三、真核生物前三、真核生物前mRNA加工过程加工过程前前mRNA加工过程加工过程5端加帽（端加帽（5-capping）3端加尾端加尾剪接（剪接（splicing）甲基化修饰（甲基化修饰（methylation）（一）（一）5端加帽（端加帽（5-capping）1 1、三种、三种55帽结构形式帽结构形式帽帽0 m7GpppNpN帽帽1 m7GpppNmpN帽帽2 m7GpppNmpNm2、5帽的作用：帽的作用：（1）防止被）防止被5外切核酸酶降解外切核酸酶降解（2）翻译时可被起始因子和核糖体识别）翻译时可被起始因子和核糖体识别（3）有助于）

10、有助于mRNA越过核膜，进入胞质越过核膜，进入胞质（4）提高）提高mRNA的剪接效率的剪接效率3、5-capping: m7G ( 5-5, mRNA guanyltransferase鸟苷转移酶鸟苷转移酶) Base 1: 2-OH 甲基化；甲基化；A (N6-甲基化甲基化) Base 2: 2-OH 甲基化甲基化5 pppNp5 GpppNppppG ppi鸟苷酸鸟苷酸转移酶转移酶5 m7GpppNp甲基转移酶甲基转移酶SAM5 ppNp磷酸酶磷酸酶 Pi真核生物真核生物mRNA转录后加工转录后加工-“加帽加帽”（1）mRNA5末端末端pppNp在磷酸酶作用下脱在磷酸酶作用下脱Pi，形成形

11、成ppNp-。（2）在鸟苷酸转移酶作用下，与）在鸟苷酸转移酶作用下，与Gppp反应形成反应形成GpppNp-, 连接方式为连接方式为5-5三磷酸桥三磷酸桥。（3）在甲基转移酶作用下，由腺苷蛋氨酸）在甲基转移酶作用下，由腺苷蛋氨酸(SAM)提供甲基，在鸟嘌呤的提供甲基，在鸟嘌呤的N-7上甲基化上甲基化（4）在连接于鸟苷酸的第一个（或第二个）核）在连接于鸟苷酸的第一个（或第二个）核苷酸苷酸2OH上又进行甲基化，最后形成上又进行甲基化，最后形成m7GpppNmp。（二）（二）3端加尾端加尾1、3端端: poly(A) poly(A)聚合酶聚合酶-Poly(A) polymerase(PAP); po

12、ly(A) ：大部分真核：大部分真核mRNA有有poly(A)尾巴尾巴 poly(A) ：无：无poly(A)尾巴，如组蛋白的尾巴，如组蛋白的mRNA2、作用：、作用：稳定稳定mRNA （2）有助于）有助于mRNA从核到细胞质转运从核到细胞质转运 （3）翻译时可被起始因子和核糖体识别）翻译时可被起始因子和核糖体识别 （4）提高）提高mRNA的剪接效率的剪接效率3末端多聚末端多聚A尾的生成尾的生成Initiation elongationAAUAAA5 capAAUAAAAn5 capPoly(A) Endonucleases 3、3末端多聚末端多聚A尾的生成尾的生成（1 1）识别因子）识别因子

13、识别识别AAUAAA（2 2）剪切因子）剪切因子(CF)(CF)在加尾位点在加尾位点AAUAAA下游下游1111 30nt 30nt处处剪切剪切RNA；（3 3）poly(A)poly(A)聚合酶聚合酶合成合成poly(A)poly(A)尾巴；尾巴；AAUAAA(20bp)CA5UUGUGUGUUG3Polyadenylation signalCleavage sitepolyA addition siteGC-rich region第五节第五节 内含子的剪接内含子的剪接一、核酶一、核酶(Ribozyme) 是指本质为是指本质为RNA或以或以RNA为主含有蛋白质辅基为主含有蛋白质辅基的一类具有

14、催化功能的物质。的一类具有催化功能的物质。1、发现发现 1981年，年，T. Cech 四膜虫四膜虫 rRNA内含子的剪接内含子的剪接 S. Altman ，RNaseP2 2、类型：、类型：按结构按结构 n锤头型核酶锤头型核酶n发夹型核酶发夹型核酶按功能按功能n剪切型剪切型 ：相当于相当于内切核酸酶内切核酸酶 n 剪接型剪接型 ：相当于相当于内切核酸酶及连接酶内切核酸酶及连接酶 n其他类型：如核苷酸转移，脱磷酸作用其他类型：如核苷酸转移，脱磷酸作用3、核酶与传统酶的区别：、核酶与传统酶的区别：（1）一般的酶是纯的蛋白质）一般的酶是纯的蛋白质; 而核酶是而核酶是RNA或或 带蛋白的带蛋白的RN

15、A；（2）有的核酶既是催化剂又是底物。而酶仅催）有的核酶既是催化剂又是底物。而酶仅催化反应化反应4、意义：意义： 突破了酶的概念；突破了酶的概念； 揭示了内含子自我剪接的奥秘；揭示了内含子自我剪接的奥秘； 促进了促进了RNARNA的研究的研究 为生命的起源和分子进化提供了新的依据。为生命的起源和分子进化提供了新的依据。二、前体二、前体mRNA的的剪接（剪接（splicing）（一）前体（一）前体mRNA的内含子的内含子 GU-AG类（主要）类（主要） AU-AC类（次要）类（次要） G100U100A62A68G84T63 12Py N C65A100G100A64G73N内含子内含子外显子外

16、显子外显子外显子左位点左位点(5/ 供体供体)右位点右位点(3/ 受体受体)分支点共同序列分支点共同序列 Py80 N Py80 Py87 Pu75 A Py95GU-AG类内含子剪接位点的特征：类内含子剪接位点的特征：（1）5剪接位点（供体位点）为剪接位点（供体位点）为GU（2）3剪接位点（受体位点）为剪接位点（受体位点）为AG GT-AG rule (GT-AG 规则规则)：指在：指在核核基因内含子基因内含子开开始始和结和结束束出现的出现的两两个个固固定的定的脱脱氧氧核苷酸核苷酸: 5端为端为GT, 3端为端为 AG，与前体，与前体mRNA内含子剪接有关内含子剪接有关 (Chambon法则

17、法则)（3）分支部位：）分支部位： 多聚嘧啶序列：多聚嘧啶序列：Py80 N Py80 Py87 Pu75 A Py95，（ 二）剪接体的形成二）剪接体的形成 1、剪接体（、剪接体（spliceosome） 是由几种非特异的小核糖核蛋白是由几种非特异的小核糖核蛋白(UsnRNP)与与mRNA前体结合而成前体结合而成2 2、剪接因子、剪接因子（1 1）UsnRNPs ：U1、U2、U5、U4/U6（2）化学组成：）化学组成：U-RNA+proteins U-RNAs (uracil rich RNA)：UsnRNAs（3）特点：）特点：snRNP中的中的RNA成分与成分与5端和端和3端剪接点及分

18、支点的多种保守碱基配对端剪接点及分支点的多种保守碱基配对RNA-RNA interactions between different snRNPs, and between snRNPs and pre-mRNAU1U1U2U4/6U5U1U2U4/6U5U1U2OHOHUACUAACGUAGOHUACUAACUGAG3、剪接体的形成、剪接体的形成3、剪接体的形成：、剪接体的形成：（1）U1snRNP识别识别mRNAmRNA前体的前体的5末端剪接位点，末端剪接位点， 并与其互补而结合并与其互补而结合（2）U2snRNP识别并结合于分支部位识别并结合于分支部位（3）U5snRNP，识别并结合于内

19、含子，识别并结合于内含子3末端剪末端剪 接位点接位点（4）U4，U6也参加到剪接体中，起配合作用也参加到剪接体中，起配合作用（5）mRNA与与snRNP形成复合体形成复合体-剪接体剪接体GUAGAU GAGAGUAGA套索结构套索结构套索的形成及剪接套索的形成及剪接12123-OH（三）（三）前体前体mRNA的内含子的剪接的内含子的剪接1、分支点分支点A的的2-OH攻击攻击5端交界处的磷酸二酯端交界处的磷酸二酯键，形成键，形成套索套索（lariat）结构）结构2、切下的外显子、切下的外显子1的的3-OH攻击内含子攻击内含子3端的交界端的交界处磷酸二酯键，同时释放出套索状的内含子。处磷酸二酯键，

20、同时释放出套索状的内含子。（四）选择性剪接（四）选择性剪接(alternative splicing) 一个基因的转录产物在不同的发育阶段和一个基因的转录产物在不同的发育阶段和生理状态下，通过不同的剪接方式，可得到不生理状态下，通过不同的剪接方式，可得到不同的同的mRNA和翻译产物和翻译产物2、选择性剪接的类型选择性剪接的类型（1 1）利用不同利用不同的启动子的启动子（2 2）利用不同的）利用不同的polypoly（A A）添加）添加位点位点（3 3）保留或缺失特定的外显子）保留或缺失特定的外显子（4 4）保留特定的内含子）保留特定的内含子 PS 外显子 S PL 外显子 L 外显子 2 外显

21、子 3 DNA 50b 2800bp 161bp 4500bp 205bp 327bp 初始转录本： 在唾腺中转录 成熟 mRNA： 1663nt 初始转录本： 在肝中转录 成熟 mRNA： 1773nt 图 18-57 小鼠淀粉酶(amy) 基因利用不同启动子产生两个不同的 mRNA（1 1）利用不同）利用不同的启动子的启动子 在唾液腺中，特定的转录因子使淀粉酶基因从上游在唾液腺中，特定的转录因子使淀粉酶基因从上游 启动子开始转录启动子开始转录 在肝细胞中，使用下游启动子在肝细胞中，使用下游启动子 DNA 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 3 TATA TATA AATAAA 1 4

22、5 6 7 8 9 (在心脏中) 190aa LC1 mRNA 20kb AUG (在砂囊中) 149aa LC3 10kb 2 3 5 6 7 8 9 图 18-58 鸡肌球蛋白轻链前体 mRNA 在不同的组织中进行不同的选择性拼接 （2 2）利用不同的）利用不同的polypoly（A A）添加）添加位点位点WXZ W XZ W XZ 大鼠大鼠 / 型型肌钙蛋白肌钙蛋白T内含子是相对的内含子是相对的 在在 型中是外显子型中是外显子而在而在 型中是内含子型中是内含子（3）不同外显子、内含子外显子、内含子的选择的选择肌钙蛋白基因内含子交替剪切，肌钙蛋白基因内含子交替剪切，产生产生 / 两种类型的

23、蛋白两种类型的蛋白(四四) 反式剪接反式剪接1、顺式剪接（、顺式剪接（Cis-splicing） 剪接过程发生在一个剪接过程发生在一个RNA分子的内部，即通过分子的内部，即通过剪接将一个剪接将一个RNA分子的内含子去除，使外显子分子的内含子去除，使外显子连接在一起。连接在一起。2、反式剪接（、反式剪接（Trans-splicing） 以两种不同来源的以两种不同来源的RNA前体分子为底物，经过前体分子为底物，经过剪接在成熟的剪接在成熟的mRNA非翻译部分接上一小段非翻译部分接上一小段RNA片段（剪接前导序列或小外显子）片段（剪接前导序列或小外显子）锥虫可变表面糖蛋白前体锥虫可变表面糖蛋白前体RN

24、A的反式拼接的反式拼接三、三、I 型内含子的剪接型内含子的剪接（一）结构特点（一）结构特点 无无GT-AG结构结构 边界序列为边界序列为5 U.3G; （二）（二）I 型内含子剪接的机制型内含子剪接的机制1、自由鸟苷酸的、自由鸟苷酸的3-OH作为亲核基团攻击内含子作为亲核基团攻击内含子5端的磷酸二酯键，从上游切开端的磷酸二酯键，从上游切开RNA链链2、上游外显子的、上游外显子的3-OH作为亲核基团攻击内含子作为亲核基团攻击内含子3位核苷酸上的磷酸二酯键，使内含子被完全切开位核苷酸上的磷酸二酯键，使内含子被完全切开3、上下游外显子通过新的磷酸二酯键相连、上下游外显子通过新的磷酸二酯键相连UpAG

25、pUpGOHUOHGpUpGAUpUrRNApGpGUpAUpU（三）（三）I 型内含子剪接的特点型内含子剪接的特点1、内含子自我催化断裂和连接（、内含子自我催化断裂和连接（ribozymes）2、需要带有、需要带有3-OH的鸟苷酸参与的鸟苷酸参与3、两步转酯反应、两步转酯反应(transesterification)四、四、II 型内含子的剪接型内含子的剪接介于介于GT-AG和和 I 型内含子之间的类型型内含子之间的类型（一）结构特点（一）结构特点（1） 边界序列为边界序列为5GUGCGYnAG；（2）分支点顺序（）分支点顺序（branch-point sequence） 保守序列保守序列

26、Py Pu Py Py T A Py（3）分子内配对：）分子内配对： 分支点顺序的中间和两侧各有分支点顺序的中间和两侧各有3-5bp的序列与的序列与上游序列互补（上游序列互补（A除外）除外）（二）（二） II 型内含子剪接机制型内含子剪接机制1、分支点、分支点A的的2-OH对对5端交界处的磷酸二酯键发端交界处的磷酸二酯键发动亲核进攻，产生了动亲核进攻，产生了套索套索（lariat）结构）结构2、切下的外显子、切下的外显子1其其3-OH继续对内含子继续对内含子3端的交端的交界序列进行亲核进攻，同时释放出套索状的内界序列进行亲核进攻，同时释放出套索状的内含子。含子。第六节第六节 RNA的编辑的编辑

27、一、一、RNA的编辑（的编辑（RNA editing）的概念）的概念 是指转录后的是指转录后的RNA在编码区发生碱基的加入，在编码区发生碱基的加入， 丢失或转换等现象丢失或转换等现象二、编辑的生物学意义：二、编辑的生物学意义： 1 1、校正作用；、校正作用； 2 2、调控翻译、调控翻译 3 3、扩充遗传信息、扩充遗传信息 机制：脱氨基作用的结果（胞苷和腺苷脱氨酶催化）机制：脱氨基作用的结果（胞苷和腺苷脱氨酶催化） 进行编辑的进行编辑的脱氨酶脱氨酶能特异性识别靶位点能特异性识别靶位点三、编辑的机制三、编辑的机制 （一）碱基转换碱基转换CAAUAA肝脏肠哺乳类载脂蛋白哺乳类载脂蛋白apo-B转录物

28、的编辑转录物的编辑（二）碱基插入（二）碱基插入GGGGAAAGAUAUUGAUGAAAGGAGUGGUGAAUUUAUUGUUUAUAUUGAUUGUAUUAUAGGUUAAAAUUUAUGUUGUCUUUUAACUUUAAAUAUAAUAGAAAAUUGAAA A G G C UUUAACUUUAAAUAUAAUAGAAAAUUG编辑前RNA指导RNA指导指导RNA的作用模式的作用模式利什曼原虫细胞色素利什曼原虫细胞色素b mRNA的编辑的编辑1、指导、指导RNA的作用模式的作用模式（1）指导指导RNA（guide RNA）：长）：长40-80nt 提供提供mRNA的编辑信息，并作为模板；的编辑信