组织培养步骤

1、组织培养步骤一、培养材料的采集 组织培养所用的材料非常广泛，可采取根、茎、叶、花、芽和种子的子叶，有时也利用花粉粒和花药，其中根尖不易灭菌，一般很少采用。 对于木本花卉来说，阔叶树可在一、二年生的枝条上采集，针叶树种多采种子内的子叶或胚轴，草本植物多采集茎尖。 在快速繁殖中，最常用的培养材料是茎尖，通常切块在0.5厘米左右，如果为培养无病毒苗而采用的培养材料通常仅取茎尖的分生组织部分，其长度在0.1毫米以下。 二、培养材料的消毒 （一）先将材料用流水冲洗干净，最后一遍用蒸馏水冲洗，再用无菌纱布或吸水纸将材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小块。 （二）在无菌坏境中将材料放入70洒精中浸泡3060

2、秒。 （三）再将材料移入漂白粉的饱和液或0.01升汞水中消毒10分钟。 （四）取出后用无菌水冲洗三、四次。 三、制备外植体 将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮。然后切成0.20.5厘米厚的小片，这就是外植体。在操作中严禁用手触动材料。 四、接种和培养 （一）接种 在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，每瓶接种410个。 （二）封口 接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。 （三）温度 培养基大多应保持在25左右，但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待。 （四）增殖 外植体的增殖是组培的关键阶段，在新

3、梢等形成后为了扩大繁殖系数，需要继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于增殖率的提高。增殖1个月左右后，可视情况进行再增殖。 （五）根的诱导 继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，必须转到生根培养基上进行生根培养。1个月后即可获得键壮根系。 五、组培苗的练苗移栽 试管苗从无菌到光、温、湿稳定的环境进入自然环境，必须进行炼苗。一般移植前，先将培养容器打开，于室内自然光照下放3天，然后取出小苗，用自来水把根系上的营养基冲洗干净，再栽入已准备好的基质中，基质使用前最好消毒。移栽前要适当遮荫，加强水分管理，保持较高的空气湿度（相对湿度98左右），但基质

4、不宜过湿，以防烂苗。养材料的采集 要根据培养目的适当选取材料，选择原则：易于诱导、带菌少。要选取植物组织内部无菌的材料。这一方面要从健壮的植株上取材料，不要取有伤口的或有病虫的材料。另一方面要在晴天，最好是中午或下午取材料，决不要在雨天、阴天或露水未干时取材料。因为健壮的植株和晴天光合呼吸旺盛的组织，有自身消毒作用，这种组织一般是无菌的。培养材料的消毒 从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带人培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上。 第一步，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适

5、当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放人为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表面活性物质吐温。 第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸1030s。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以

6、浸润时间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。 第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取12种使用见表。第四步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗3-l0次左右。无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用注意：酒精渗透性强，幼嫩材料易在酒精中失绿，所以浸泡时间要短，防止酒精杀死植物细胞。老熟材料，特别是种子等可以在酒精中浸泡时间长一些，如种子可以浸泡5分钟。升汞的渗透力弱，一

7、般浸泡10分钟左右，对植物材料的杀伤力不大。漂白粉容易导致植物材料失绿，所以对于幼嫩材料要慎用。在消毒液中加入浓度为0.080.12%的吐温20或80（一种湿润剂），可以降低植物材料表面的张力，达到更好的消毒效果。灭菌剂 使用浓度(%) 持续时间（min） 去除的难易 效果 次氯酸钙 910 530 易 很好 次氯酸钠 2 530 易 很好 氯化汞 0.11 58 较难 最好 抗菌素 450mg/L 3060 中 较好 制备外植体 将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮。在操作中严禁用手触动材料。 接种和培养 （一）接种 在无菌

8、坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，每瓶接种12个，以防止交叉污染。（二）封口 接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。 （三）温度 培养基大多应保持在25左右，但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待。 增殖 外植体的增殖是组培的关键阶段，在新梢等形成后为了扩大繁殖系数，需要继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于增殖率的提高。增殖1个月左右后，可视情况进行再增殖。 根的诱导 继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，必须转到生根培养基上进行生根培养。1个月后即可获得键壮根系。 组培苗的炼苗移栽 试管苗从无菌到光、温、湿稳定的环境进入自然环境，必须进