生物医学电镜技术与细胞及组织超微结构总论

1、2021-6-191 Biomedical Electron Microscopy and Cell 19331934年,电镜的性能已达 光镜的分辨率0.2um, 10,000；1938-1939，第一批商 品电镜问世，分辨率达100A； 由于受到样品制备技术的限制，20世纪50年代初， 电镜技术才开始运用于生物医学方面的研究。 、细胞超微结构的分子细胞生物学的基础。 2021-6-194 1、分辨率（Resolution） 又称分辩本领（Resolving power），是将邻近两点清晰区分、辩认 的能力，用能被辨认的邻近两点的距离表示。 肉眼：在明视距离（25cm）时，为0.25mm； L

2、M：可见光的平均波长为500nm，r=/2，LM的极限分辨率为 0.25um; EM：电子波波长短,且波长随加速电压的增高而更短，目前较好 的电镜分辨率为0.2nm左右,比LM提高1000倍,比人眼提高100万倍. (注)：由于电镜存在各种像差（包括球差、像散等）,限制了分辨率,不 能真正达到其波长的一半; 分辨率还受到许多因素的影响,如切片的厚度等，超薄切片较薄 时,分辨率可达12.5nm,切片较厚时,实际分辨率为510nm. 2021-6-195 2、反差： 被观察物与其背景在亮度（黑白对比度）上有所不同，这种差别称为反 差；透射电镜的反差主要由样品对电子的散射产生。 3、空放大 不能提供

3、更为清晰的图像放大，称为无效放大，也称无效放大。 4、不同分辨率的形态研究 2021-6-196 5、亚微结构与超微结构的概念及关系 亚显微结构（submicroscopic structure）： 介于细胞水平和大分子水平之间的结构；简称为 “亚微结构”或“亚细胞结构（subcellullar structure）”，也称“细微结构（fine structure）” 超微结构（ultrastructure）： 严格的讲，是指分子水平的结构，目前一般书刊 对亚显微结构和超微结构无严格的界限，往往将普通 光镜分辩界限以下的结构笼统称为超微结构。 2021-6-197 l电镜的基本构造及原理 、电

4、子束主要特点： a、由电子组成，真空中直线前进，具波动 特性； b、电子束受电力和磁力作用； c、电子束照射样品时，能透过极薄样品， 得到透射电子，或产生二次电子，特征X射线， 背散射电子等。 2021-6-198 、电镜的基本构造：以透射电镜 为例 2021-6-199 l电镜的类型电镜的类型 、透射式电子显微镜(Transmission Electron Microscope, TEM)； 最常用、最典型，主要用于观察超薄切片和负染样品，点分 辨率的理论值可达1.42A。 、扫描式电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM）； 具有景深长，视野广，观察样品

5、表面立体图像的特 点，其分辨率和放大倍数都远低于TEM，一般分辨率为 60A左右。 上述两种电镜可综合，兼有功能，是现代电镜发展 的代表（STEM）。 2021-6-1910 、超高压电镜（High Voltage Electron Microscope, HVEM）； 常规电镜加速电压一般在200KV以下，如果加速电压在 500KV以上，则称为HVEM。 特点:观察厚切片(0.5-3um)，提高分辨率。观察到原子 水平，期望观察生活标本（含水份） 、分析电镜（ Electron Microscope Microanalyser， EMMA）； I、波谱仪（wavelength-dispers

6、ive spectrometer ， WDS） II、能谱仪（energy-dispersive spectrometer ，EDS） 、扫描探针显微镜(Scanning probe microscope,SPM): 原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)； 扫描隧道显微镜(scanning tunneling microscope,STM)。 2021-6-1911 2021-6-1912 2021-6-1913 2021-6-1914 2021-6-1915 2021-6-1916 2021-6-1917 、扫描电镜的二次成像原理 扫描电镜一般可分为四个重要

7、的组成部分： a、形成电子探针的电子光学系统； b、探针的电子束打击样品表面形成信息信号； c、检测系统； d、电子偏转系统（是电子探针在样品表面按 一定顺序扫描，并且使这一扫描过程与阴极射 线管的电子束在荧光屏上移动同步）。 2021-6-1918 2021-6-1919 扫描电镜的结构示意图： 2021-6-1920 2021-6-1921 2021-6-1922 2021-6-1923 2021-6-1924 2021-6-1925 2021-6-1926 2021-6-1927 、二维 三维，如三维重建技术； 、从单纯的形态观察,深入到对其功能、代谢、 化学组成、分子结构及元素分布的研

8、究。如X 线显微分析(electron probe x-ray microanalysis)； 、定性描述 定量测定方向发展，如电镜 形态测量技术（morphometry）； 、从经化学固定的结构向活细胞整体方向发展， 如超高压电镜技术的应用； 、仪器设备向小型化方向发展。 2021-6-1928 l本课程的重点内容 电镜生物样品制备常规技术及应用范围; 电镜图片的分析要领; 正常细胞超微结构理论和超微病理内容的基本掌握。 l学习要点 重视图像的分析和识别； 注意LM和EM结合； 形态与功能的联系； 正常超微结构与超微病理的联系； 建立整体的细胞结构和功能概念。 l主要参考文献 电子显微镜术在

9、临床医学的应用,杭振镳 蔡文琴主编,重庆出版 社,1988年8月,第一版； 医学细胞生物学,宋今丹主编,人民卫生出版社,1997年5月,第一版； 医用电子显微学，薄爱华主编,人民卫生出版社,2000年11月,第一版； 超微病理学基础,武忠弼主编,人民卫生出版社,1990年9月,第一版； Ultrastructural Pathology of the Cell and Matrix . Third Edition Vol.1 Feroce N,Ghadially Butterworths 1988 2021-6-1929 样品制备是电镜技术中一个很重要的组成 部分，是电镜工作中最繁重的环节。要

10、学习掌 握好细胞超微结构知识及应用电镜技术进行研 究工作，都必须首先了解电镜的标本制备技术， 故属于本课程的重点内容。 2021-6-1930 超薄切片（ultrathin-section）制备过程示意图： 2021-6-1931 1、取材的基本原则： 快：1min 小：1mm3 利： 静： 冷：4 取材部位要准确； 成批取材，部位一致、； 标本的编号和标签。 2021-6-1932 2、固定： 、几种常用的固定剂的理化特性和使用原则： a、四氧化锇（Osmium tetroxide，OsO4）； 又称锇酸，是电镜生物样品使用最广泛的固定剂，兼有电 子染色作用，可作单固定，一般不用于电镜细胞化

11、学实验的固定。 对糖原和核酸的保护作用差。多用于后固定。 b、戊二醛（glutaraldehyde，C5H8O2）； 不能单独作为电镜样品固定液，对脂肪的保护作用差。没有 “电子染色”的作用，通常用于前固定。 c、甲醛（formaldehyde）。 电镜多用多聚甲醛，对酶活性保存好，可与戊二醛混合或单 独用于细胞化学灌流固定或作为前固定液。 、固定方法： a、双重固定法； b、体内原位固定法； c、灌流固定法。 2021-6-1933 3、脱水：应递增浓度进行 4、浸透：半浸透 纯浸透 5、包埋、聚合：环氧树脂（epoxy resin）618#，Epon812 6、切片：修块 光切（半薄切片，

12、0.5-1um） 定位 超切(超薄切片,50-70nm) 超薄切片机(ultramicrotome)，玻璃刀，钻石刀，复有支持膜的载 网（grid）（铜、镍、金网）。 2021-6-1934 7、电子染色：利用重金属离子对不同细胞结构的结合 能力不同，使各细胞结构对电子产生不同散射程度，以增 强明暗之比（反差）。 常用的电子染色剂有以下几种 a、醋酸铀（Uranyl acetate），即醋酸双氧铀，多用于块染； b、枸橼酸铅（Lead citrate），用于片染，易被空气中的CO2污染。 电子密度（electron density）的概念： 2021-6-1935 利用高密度无结构的重金属物质

13、把生物标本 包绕起来。这种反差是负像（与正染色的超薄 切片相比较）。最常用的染色剂是磷钨酸钠 （phosphotungstic acid，PTA），此法常用于病 毒、蛋白分子或细胞亚单位的分子结构研究， 制样简单，可作快速诊断。 2021-6-1936 在保持细胞超微结构完整的条件下，借助细 胞中的化学反应，研究细胞乃至细胞器的结构与 功能的关系，是与化学、生物化学及免疫学有密 切联系的一门学科。广义的电镜细胞化学研究方 法主要有细胞超微标记示踪技术、电镜酶细胞化 学技术和电镜免疫细胞化学技术（简称免疫电镜 技术）等几种。 2021-6-1937 1、电镜酶细胞化学术(electron mic

14、roscopic cytochemistry of enzyme or ultracytochemistry of enzyme) 基本原理及内容: 酶细胞化学术（enzyme cytochemistry）是利用酶催化反应特点，从 亚微结构上研究酶的分布和活性。按其催化反应的性质可分为水解酶、氧 化还原酶、转移酶、裂解酶、合成酶和异构酶六大类，应用较多的有水解 酶和氧化还原酶。现以水解酶为例，介绍此技术的主要过程和基本原理。 初级反应：底物被磷酸水解酶作用后分解产生磷酸。 底物 磷酸水解酶 H3PO4 最终反应：磷酸与金属捕捉剂结合形成反应产物。 H3PO4 捕捉剂（如Pb2+） Pb3(PO

15、4)2 反应产物为电子致密的沉淀物，电镜下易于观察并显示出酶的定位。 近年来常用铈（ Ce3+）作为捕捉剂。 2021-6-1938 2021-6-1939 应用 一般说透射电镜已能分辨出超微结构和某些化学成份，如糖原颗粒、核 糖体、染色质和脂类等。电镜酶细胞化学则着重显示各超微结构的酶特别是 标志酶，研究细胞器的化学、功能及其动态变化，由于电镜方法的限制，迄 今所能显示的酶为数尚少。 酶细胞化学技术主要用于：（1）酶在超微结构上的定位，（2）标记和 鉴定某些细胞和细胞器，（3）通过显示过氧化物酶，定位示踪HRP,（4） 利用免疫酶技术，电镜下显示特异性标记物的定位。 目前应用电镜技术常显示的

16、标志酶有： 各种细胞器的标志酶 细胞器细胞器标志酶标志酶 内质网核苷二磷酸酶，葡萄糖-6-磷酸酶 高尔基体焦磷酸硫胺素酶（Trans膜囊）、烟酸胺腺嘌呤二核苷磷酸酶（中间膜囊） 溶酶体酸性磷酸酶 微体过氧化氢酶 线粒体细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氨酶 细胞膜核糖核苷磷酸酶（如ATP酶）、碱性磷酸酶 2021-6-1940 Figure 10 G-6-Pase reaction products were rich in Leydig cell of the control group rats. 20 000 Figure 11 G-6-Pase reaction products decreas

17、ed markedly after 3 d of cadium treatment. 20 000 Figure 12 Showing intense G-6-Pase reaction products of Leydig cell after 3 d of cadium add zinc treatment. 20 000 2021-6-1941 2021-6-1942 RER,G-6-Pase Plasmalemma , AlPMito., SDH 2021-6-1943 2、 免疫电镜技术(immunoelectronmicroscopy) 免疫细胞化学术（immunocytochem

18、istry）是用标记 特异性抗体对组织内抗原分布进行形态学研究的一门分支 学科。60年代，Nakane建立了酶标记抗体技术，70年代， Sternberger在此基础上改良并建立了非标记过氧化物酶- 抗过氧化物酶（PAP）技术，80年代Hsu建立了抗生物素- 生物素（ABC）法之后，胶体金标记技术、免疫金银染色 和亲和免疫细胞化学技术等相继问世，使免疫细胞化学技 术成为当今生物医学中形态、功能、代谢综合研究的一项 有力工具。目前免疫细胞化学正在向定量和分子水平发展。 2021-6-1944 2021-6-1945 2021-6-1946 ABC法法 基本原理：基本原理： 抗生物素-生物素-过氧

19、化物酶复合物技术（Avidin-Biotin- Peroxidase Complex Technique）简称 ABC技术，是目前常用的免疫细胞 化学技术之一。1979年Guessdon首先把生物素-卵白素技术用于免疫组织 化学，先后设计出桥式卵白素-生物素（BAB）技术和标记式卵白素一生 物素（LAB）技术，1981年Hsu和许世明在BAB法和LAB法基础上改良而 建立了ABC法，其基本原理与PAP法相似，特点是利用抗生物素分别连接 生物素标记的第二抗体和生物素标记的过氧化物酶，形成抗原-第一抗体 -生物素标记的第二抗体-抗生物素过氧化物酶复合体（AgAb1Ab2 ABC）。抗生物素又称卵白

20、素（Avidin），它有四个活动结合点，并与生 物素有特别高的亲和力，一旦和生物素结合就极为稳定。当生物素和第 二抗体共价偶联后，就使第二抗体获得与抗生物素相结合的能力。 2021-6-1947 2021-6-1948 胶体金标记技术胶体金标记技术 优点：优点：（l）胶体金可标记各种不同的生物大分子(如免疫球蛋白、葡萄球 菌A蛋白、植物凝集素、刀豆球蛋白A等)，并使其保持原有的生物学活性。 （2）胶体金标记技术可适用于光镜、透射及扫描电镜、X射线能谱分析、荧 光显微镜等。（3）胶体金非特异性吸附作用小、特异性强。（4）金颗粒电 子密度大，电镜下检出率远比DAB反应产物高，敏感性比PAP法高20

21、200倍、 比ABC法亦高数倍。（5）胶体金标记物是颗粒状物，电镜下易于计数，可直 接定量检测抗原。（6）胶体金标记不受内源性物质影响。（7）胶体金颗粒 直径可根据需要控制，将不同直径的肢体金分别标记不同抗体或抗原，可在 同一张切片上同时区分两种或两种以上的抗原或抗体，特别适合于电镜水平 的双标记或多标记。（8）胶体金标记和IGSS特别有利于回顾性研究,如过去 病理外检的石蜡切片和电镜包埋块,需要时可进行胶体金标记研究。胶体金的 颗粒较大,穿透性弱,是它的主要缺点。 电镜水平的免疫金技术，同PAP和ABC法免疫电镜一样，关键在于抗原 的保存。用L.R.White 和 Lowicryl K4M包

22、埋，其保存抗原优于Epon812，用 冷冻超薄切片作IGS，由于抗原性保存很好，更易成功。目前多采用包埋后染 色。包埋前染色，免疫金试剂对细胞膜的穿透性差,一般只用于细胞表面抗原 的标记。 2021-6-1949 2021-6-1950 真空喷镀：真空喷镀： 真空条件下金属加热至一定温度后，将以细颗粒向四周发射，在 样品面对喷镀源的一面形成一层重金属薄膜。又称金属投影法（metal shadowing）。 离子溅射：离子溅射： 与真空喷镀的区别在于：真空度不同，重金属离子运动的方向不 同，镀膜效果较前者好，金属用量可少10倍，镀膜更为均匀。 2021-6-1951 冷冻蚀刻技术又称冷冻蚀刻复型

23、法（freeze etching replica），该技术 主要用于生物膜内部及细胞内部三维结构的研究，如核孔复合体、细胞 连接等。 2021-6-1952 2021-6-1953 2021-6-1954 2021-6-1955 又称电子探针X线显微分析（electron probe X-ray microanalysis）或简称 X线微区分析（X-ray MA），是电镜技术与X线分析技术相结合的一种方法。 基本原理： 当高速电子束轰击固体标本表面的微小区域，使该区域所含的元素发射X 线，各种元素都能发射自己的特征X线，通过检测发射的X线的波长和强度， 便可了解该微小区域所含元素的种类及含量。

24、 分析仪器包括： a、电子探针显微分析仪； b、扫描电境与X线检测器的结合； c、扫描透射电境与X线检测器的结合； d、专用分析电镜（electron microscope microanlyser，EMMA）； e、透射电镜与X线检测器的结合。 2021-6-1956 优点： 、分析过程不破坏样品结构，在保持各元 素原有分布情况下对生物细胞内各种元素同时 进行分析； 、结合拍摄透射或扫描电镜图像，可在形 态观察的同时对一定结构内的元素进行测量， 从而获知超微结构变化与其组成元素变化的关 系。 、灵敏度高，可辨别1um3区域内质量小 于10-14g的元素。 应用： 中药研究，钙库研究，重金属中

25、毒（如镉） 研究等。 2021-6-1957 用立体学方法来分析形态结构，称为形态计量学（morphometry） 或体视学，形态定量分析目的是从二维图像推导出三维结构参数。 人工法； 生物医学图像分析系统 观察和研究腔隙性器官，特别是器官内的血管立体构筑和分布 情况。 铸型剂-甲基丙烯酸酯 样品经腐蚀，清洗，镀膜后在SEM下观察。 甲醛固定石蜡包埋样品； 培养细胞及游离细胞； 血液（白细胞、血小板），精液等液体标本； 骨组织。 2021-6-1958 2021-6-1959 l基础研究方面： 在病毒学、细胞生物学、组织学、病理学、分子生物学及分子 病理学上均做出了卓有成效的贡献。如核蛋白体超

26、微结构的研究； 核蛋白体与mRNA关系的阐明；核小体的发现；DNA复制及RNA转 录的分子形态观察；线粒体内膜的ATP合成酶颗粒的发现；电镜是 直接观察病毒的唯一工具。 l临床医学方面： 电镜在医学上的应用近10多年来已从医学基础性理论研究逐渐 扩大到临床医学的实际应用方面。对疾病的病情、病因的鉴定，对 肿瘤、血液病及肾脏病等的分型诊断上都取得显著成效。由于内窥 镜的应用和穿刺技术的发展，使得临床上获得如心脏、肝、肾、胃 等脏器的标本变得较容易。 2021-6-1960 2021-6-1961 l正确评价电镜的使用： 电镜是一种先进的科学仪器，其主要特点是分辨率高，能观察细 微结构。但正是由于

27、其高放大，使得观察范围较小，且制样复杂。而 光镜则有制样简单，观察面大，能动态观察活细胞等优点。因此电镜 不能取代光镜，二者应配合使用，取长补短。 l在科学研究中，电镜所起作用具体表现为： a、探查作用：观察很早期的改变，功能活动的提示，因复杂的代谢过 程中的定位往往是光镜看不见的；病毒学、病因学、免疫损伤等病因 的探讨； b、依据作用：“眼见为实”的重要性，在机理研究中从形态学上证 实了许多理论假说； C、辅助作用：电镜结果注意与光镜的关系，与宏观的关系，因其本 身有较大的局限性，如取材小，观察范围亦小，特别是在病理诊断上 应与其他方法结合进行研究。 2021-6-1962 l观察要领 1、正确判断和应用放大倍率： 原则：从低倍到高倍，以利于判断细胞组织种类，医学生物学范围内多用1-2 万倍，多数问题在5万倍以下就能解决。 电子放大，光学放大，总放大的概念。 2、具有全局的观点： 注意宏观提示，光镜和其他检查结果，防止片面性；电镜观察时注意连续追 踪，仔细全面，一定要有严格的正常对照；提倡2人以上同时观察。 3、及时作好拍片记录和观察小结； 4、重视基础理论指导： 良好的认识水平来自于坚实的专业理论知识和丰富的实践经验。电 镜观察如果缺少必要的认识基础，其结果是视而不见，见而不知其义。 因此必须做好文献准备，科研设计，有一定的超微结构知识，才能解释 图像，提高观察分析