细胞培养总结

1、细胞实验 总结李石营神经再生重点实验室如何做好实验？ 1.动手能力 -天赋 -训练 2.思考把握能力 -知道原理 清楚流程；把握关键点 -学会推理 -Why？Question youself！3. 实验前的准备和规划细胞培养总论 无菌 环境、操作、器皿、溶液 状态 水、器皿干净程度、操作等水、器皿干净程度、操作等 培养细胞的生长条件和要素培养细胞的生长条件和要素 培养细胞的生物学特征培养细胞的生物学特征细胞培养总论 无菌 环境、操作、器皿、溶液 状态 水、器皿干净程度、操作等水、器皿干净程度、操作等 培养细胞的生长条件和要素培养细胞的生长条件和要素 培养细胞的生物学特征培养细胞的生物学特征环境

2、 无菌细胞培养室细胞培养室要要紫外线紫外线照照射消毒，超射消毒，超净工作台要净工作台要经常经常紫外紫外照照射消毒，台射消毒，台面每次实验面每次实验前要用前要用75酒精酒精擦洗。擦洗。培养箱加CuSO4抑菌操作操作 无菌无菌 着装 洗手和酒精喷手 火焰消毒 操作过程器皿 无菌紫外过夜培养用液 无菌 培液，胰酶等 缓冲液等细胞培养操作 无菌 环境、操作、器皿、溶液 状态 水、器皿干净程度、操作等水、器皿干净程度、操作等 培养细胞的生长条件和要素培养细胞的生长条件和要素 培养细胞的生物学特征培养细胞的生物学特征水 三蒸水 Why？ 细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子细胞培养用水必须非常纯净，不含有

3、离子和其他的杂质。和其他的杂质。 需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或超纯水需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或超纯水 体外细胞对任何有害物质都非常敏感体外细胞对任何有害物质都非常敏感微生物产品附带杂物微生物产品附带杂物上次细胞残留物上次细胞残留物非营养成分的化学物质非营养成分的化学物质 需要清洗的培养用品需要清洗的培养用品玻璃器皿玻璃器皿胶塞胶塞塑料制品塑料制品器皿干净程度 Why？玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗 包括包括浸泡、刷洗、浸酸浸泡、刷洗、浸酸和和冲洗冲洗四个步骤四个步骤 浸泡：浸泡：WhyWhy？初次使用初次使用的玻璃器皿，有大量干固的灰尘，表面的玻璃器皿，有大量干固的灰尘，表面呈碱性等呈碱性等先

4、用自来水刷洗，然后用先用自来水刷洗，然后用5稀盐酸稀盐酸液浸泡过液浸泡过夜以中和碱性物质夜以中和碱性物质再次使用再次使用的玻璃器皿，常附有大量刚使用过的蛋的玻璃器皿，常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉白质，干固后不易洗掉用后立即浸入水中，要求浸泡完全，不能留有用后立即浸入水中，要求浸泡完全，不能留有气泡或浮在液面上气泡或浮在液面上 刷洗：刷洗：以除去器皿表面附着较牢的杂质以除去器皿表面附着较牢的杂质刷洗要适度刷洗要适度，过度会损害器皿表面，影响，过度会损害器皿表面，影响细胞的附着。细胞的附着。 浸酸浸酸强氧化作用强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质；可除掉刷洗不掉的微量杂质；浸泡时间：一

5、般为过夜，不应少于浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 6小时。小时。 清洁液，清洁液， 【根据浓硫酸比例】分为强清洁液，【根据浓硫酸比例】分为强清洁液，次强清洗液，弱清洁液次强清洗液，弱清洁液 配制时应注意安全配制时应注意安全 产热，配制过程中慢慢加浓硫酸，并不停的用产热，配制过程中慢慢加浓硫酸，并不停的用玻璃棒搅拌。玻璃棒搅拌。 冲洗冲洗洗干净洗干净顺序顺序：自来水【：自来水【5 5遍左右】，纯净水（双蒸遍左右】，纯净水（双蒸水）水） 【3-53-5遍】遍】 ，三蒸水【，三蒸水【3-53-5遍】遍】 胶塞的清洗 瓶塞瓶塞 不能浸酸不能浸酸 水中浸泡，用水中浸泡，用2% NaOH 或洗衣粉煮或洗

6、衣粉煮沸沸10-20 分钟（以除掉培养中的蛋白分钟（以除掉培养中的蛋白质），然后自来水，蒸馏水，三蒸水洗质），然后自来水，蒸馏水，三蒸水洗 塑料制品塑料制品 用用2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用分冲洗，再用5%盐酸盐酸溶液浸泡溶液浸泡30 分钟，分钟，最后用自来水，蒸馏水，三蒸水洗干净最后用自来水，蒸馏水，三蒸水洗干净操作 对细胞影响 火焰消毒 气泡 胰酶 力度 时间细胞培养总论 无菌 环境、操作、器皿、溶液 状态 水、器皿干净程度、操作等水、器皿干净程度、操作等 培养细胞的生长条件和要素培养细胞的生长条件和要素 培养细胞的生物学特征培养细胞的生物学特征培养

7、细胞的生长条件培养细胞的生长条件 细胞的生存环境细胞的生存环境 37，空气，空气 CO2: 5%，CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- 培养基 营养成分：氨基酸，单糖，维生素，微量营养成分：氨基酸，单糖，维生素，微量元素，促生长因子等元素，促生长因子等 渗透压；渗透压； pH: 7.27.4 NaHCO3-CO2缓冲系统缓冲系统？ 生长过程中，细胞代谢产生生长过程中，细胞代谢产生CO2 水：新鲜配置的三蒸水或去离子水水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液平衡盐溶液(BSS)：生理盐水、：生理盐水、D-Hanks、PBSpH调节液：调节液： NaHCO3 溶液、溶液、 HEPES

8、溶液溶液消化液：胰蛋白酶、消化液：胰蛋白酶、EDTA、胶原酶、胶原酶抗生素溶液：青霉素、链霉素抗生素溶液：青霉素、链霉素培养基：天然培养基、合成培养基培养基：天然培养基、合成培养基 基础培养基、完全培养基、无血清培养基基础培养基、完全培养基、无血清培养基细胞培养用液的配制细胞培养用液的配制细胞培养总论 无菌 环境、操作、器皿、溶液 状态 水、器皿干净程度、操作等水、器皿干净程度、操作等 培养细胞的生长条件和要素培养细胞的生长条件和要素 培养细胞的生物学特征培养细胞的生物学特征体外培养细胞的种类体外培养细胞的种类 （一）（一）原代培养。即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行原代培养。即直接从体内

9、取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。的第一次的培养物。性状与体内相似！性状与体内相似！（二）（二）细胞系细胞系 原代细胞第一次传代培养后的细胞，即称之为原代细胞第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。细胞系。（三）（三）细胞株细胞株 由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。 细胞数量：计数细胞数量：计数 细胞活力：活细胞占总细胞的百分比。细胞活力：活细胞占总细胞的百分比。 分裂指数分裂指数(MI) :(MI) :指培养物中分裂相数量占指培养物中分裂相数量占全部细胞数量的百分比。全部细胞数量的百分比。 细胞周期：细胞周期： 其它其它细胞评价指标细胞评价指标

10、实验课内容 细胞传代 原代培养 细胞评价指标： 细胞数量：细胞计数 细胞活力：台酚蓝染色 和 MTT法 细胞分裂指数：Giemsa染色 细胞周期：流式细胞术 细胞冻存与复苏 细胞转染细胞传代 Why 传代？ 原理？胰酶 与 血清关系 步骤?流程流程 1. 弃去培养液。弃去培养液。 2. 洗细胞表面残留血清。用基础培养基或洗细胞表面残留血清。用基础培养基或PBS 。 3. 加入胰蛋白酶消化。（显微镜下监测）。加入胰蛋白酶消化。（显微镜下监测）。 4. 加入完全培养液。用吸管吸取瓶内培养液，反加入完全培养液。用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打，形成细胞悬液。复吹打，形成细胞悬液。 4. 收集细胞悬液于

11、离心管中，室温收集细胞悬液于离心管中，室温1000rpm离心离心 5分钟。分钟。 5. 去上清，加适量培养液重悬细胞，接种细胞悬去上清，加适量培养液重悬细胞，接种细胞悬液于新培养瓶内。液于新培养瓶内。 6. 将培养瓶放入培养箱中培养。将培养瓶放入培养箱中培养。 Why 步骤？ 1、倒培液后要洗？ 2、胰酶量、浓度和消化时间？ 3、胰酶处理？3方法。 4、离心时间和转速？ 5、细胞分比例？ 6、培瓶？ 7、不影响结果的改进？原代培养 Why 原代培养？ 原理？ 步骤?（一）胰酶消化法（一）胰酶消化法 1、将鼠用、将鼠用酒精消毒酒精消毒，在超净台内处死，在超净台内处死，取脏器取脏器，置平皿中。，置

12、平皿中。 2、用、用PBS洗涤洗涤，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。 3、用手术剪、用手术剪剪成小块，剪成小块，再用再用PBS洗，转移至离心管中。洗，转移至离心管中。 4、加入、加入5-6倍的胰酶倍的胰酶，消化，消化5-10分钟，每隔分钟，每隔2-3分钟振荡一次。分钟振荡一次。 5、加入、加入3-5ml培养液终止胰酶培养液终止胰酶消化作用。消化作用。 6、离心离心5分钟，分钟，弃上清液弃上清液。 7、加入、加入完全培养液悬起细胞完全培养液悬起细胞，转移至培养瓶中，培养。，转移至培养瓶中，培养。（二）组织块直接培养法（二）组织块直接培养法 4、将、将组织块转

13、移到培养瓶组织块转移到培养瓶，贴附于瓶底面。，贴附于瓶底面。5、翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，、翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。培养液勿接触组织块。6、37静置静置3-5小时，轻轻翻转培养瓶，小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中使组织浸入培养液中（勿使组（勿使组 织漂起），织漂起），37继续培养。继续培养。 冰上，迅速，避免染菌冰上，迅速，避免染菌细胞计数 原理 公式? Why?过程？过程？（一）细胞计数（一）细胞计数1、将计数板及盖片擦试干净，并将盖片盖在计数板上。2、吸少许细胞悬液，滴加在盖片边缘，使悬液自动流进去。3、镜下观察。然后按公式计算：注意：1. 镜下偶

14、见细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团多，说 明分散不好，需重新制备细胞悬液。 2. 若细胞压线，计上不计下，计左不计右。 细胞活力 定义：活细胞占总细胞的百分比活细胞占总细胞的百分比 WhyWhy测定？测定？ 测定原则测定原则台盼蓝 染色测细胞活力 原理: 染色反应（物理）：台盼蓝与DNA 结合，使其着色,但不能穿过细胞膜。所以它是检测细胞膜完整性的指标。过程：过程：1、将细胞悬液以、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。加入试管中。2、加入、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色台盼兰染液，染色2-3分钟。分钟。3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。4、

15、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。数，计细胞活力。 MTT测细胞活力/细胞增殖 原理： 氧化还原反应：脱氢酶 (主要是琥珀酸脱氢酶)（还原剂)还原MTT产生蓝色结晶（甲赞）积于细胞内和细胞周围。其量与活细胞数呈正比。 活细胞有脱氢酶，死细胞没有，Why？ 1、接种细胞、接种细胞 到到 96孔板孔板2、呈色：培养、呈色：培养35天后，天后，每孔加每孔加MTT溶液，继续孵溶液，继续孵育育4小时小时，吸弃孔内培养上清液，（对于悬浮细胞需吸弃孔内培养上清液，（对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液）。要离心后再吸弃孔内培养上清液）。3、每

16、孔加、每孔加150ul DMSO，振荡，振荡10分钟。分钟。4、比色：主波长（、比色：主波长（primary wavelength）=490nm，参，参比波长（比波长（Reference wavelength）=630nm。在酶标。在酶标仪上测定各孔光吸收值。仪上测定各孔光吸收值。 ？步骤注意点 细胞要分均匀！ 1. 加过程要不断的混匀 2. 重复 细胞液要弃干净 台盼蓝染色 与 MTT测细胞活力差别台盼蓝MTT细胞死细胞活细胞反应物理氧化还原数值绝对相对准确性中高细胞增殖不能能细胞分裂指数：吉姆萨（Giemsa）染色 分裂指数：分裂指数：细胞群体中分裂细胞所占的百分比 原理： 吉姆萨（Gie

17、msa）染液由碱性染料天青（紫蓝色）和酸性伊红染料（粉红色）组成 -染色质 ，被碱性染料天青染色 -胞浆中的碱性和中性蛋白质，被酸性染料伊红染色。 1、将细胞种在内含盖玻片的培养皿中。、将细胞种在内含盖玻片的培养皿中。 2、培养使细胞长在盖片上。、培养使细胞长在盖片上。3、取出盖片，按下列顺序操作：、取出盖片，按下列顺序操作： PBS漂洗漂洗3分钟分钟甲醇：冰醋酸甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定固定液中固定30分钟分钟Giemsa液染色液染色10分钟分钟自来水冲洗。自来水冲洗。 ？4、盖片、盖片晾干后晾干后反扣在载玻片上，镜检。反扣在载玻片上，镜检。 ？5、计算、计算: 分裂细胞数分裂细胞数 分裂指数分裂指数= 100% 总细胞数总细胞数步骤影响因素 pH 洗涤 固定 染色细胞冻存与复苏 Why？ 冻存问题？冰晶和渗透压。 原则：慢冻速溶。Why？ 加冻存保护剂DMSO，作用？冻存 水中。冰晶 溶液中。渗透压改变 保护剂：与水分子结合，从而降低冰点