5.3血红蛋白的提取和分离(定稿)

1、课题课题3 3：血红蛋白的提取和分离：血红蛋白的提取和分离 血红蛋白存在于红细胞内，含有四条肽链血红蛋白存在于红细胞内，含有四条肽链, ,每条肽链环每条肽链环绕一个绕一个亚铁血红素基团，亚铁血红素基团，此基团可携带此基团可携带一分子氧一分子氧或或一分子二一分子二氧化碳，氧化碳，血红蛋白因含有血红蛋白因含有血红素血红素而呈而呈红色。红色。一一. . 基基 础础 知知 识识蛋白质提取与分离的依据蛋白质提取与分离的依据不同蛋白质的物理、不同蛋白质的物理、化学性质不同：化学性质不同： 不同蛋白质的形状、不同蛋白质的形状、大小大小、电荷性质和多少、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等等各不相同。溶

2、解度、吸附性质、亲和力等等各不相同。 ( (一一) )凝胶色谱法凝胶色谱法1 1、凝胶：、凝胶： 根据被分离物质的根据被分离物质的相对分子质量的大小，相对分子质量的大小，利用具利用具有网状结构的凝胶有网状结构的凝胶( (分子筛作用分子筛作用) )，来进行分离。来进行分离。一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的孔隙，由一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的孔隙，由多糖类构成，如葡聚糖、琼脂糖）多糖类构成，如葡聚糖、琼脂糖）由葡萄糖通过不同方式形成的聚糖。 2 2、原理：、原理：小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短

3、，流动快；大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；( (一一) )凝胶色谱法凝胶色谱法小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶内部；2 2、原理：、原理：小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；( (一一) )凝胶色谱法凝胶色谱法小分子物质在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒；2 2、原理：、原理：小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，

4、流动慢。大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；( (一一) )凝胶色谱法凝胶色谱法如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质；2 2、原理：、原理：小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；( (一一) )凝胶色谱法凝胶色谱法从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。( (一一) )凝胶色谱法凝胶色谱法4.4.具体过程具体过程 混合物

5、混合物上上 柱柱洗洗脱脱大分子流动快大分子流动快小分子流动慢小分子流动慢收集收集大分子大分子收集收集小分子小分子 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分 子产生差速流动。子产生差速流动。 1 1 、缓冲液是什么？、缓冲液是什么？2 2、 缓冲液有什么作用呢？缓冲液有什么作用呢？（二）、缓冲溶液（二）、缓冲溶液- 在一定的范围内，凡是能够抵制在一定的范围内，凡是能够抵制外来少量强酸或强外来少量强酸或强碱碱的影响，并使原来溶液的影响，并使原来溶液PHPH值基本保持值基本保持不变的混合溶液。不变的混合溶液。 由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。如由弱酸

6、和相应的强碱弱酸盐组成。如H H2 2COCO3 3/NaHCO/NaHCO3 3，醋酸醋酸/ /醋酸钠，醋酸钠， NaHNaH2 2POPO4 4/Na/Na2 2HPOHPO4 4等等 能够抵制能够抵制外界的酸和碱外界的酸和碱对溶液对溶液PHPH值值的影响，的影响，维持维持PHPH基本不变。基本不变。洗脱剂洗脱剂3 3、 缓冲液是如何配制的？缓冲液是如何配制的？ 通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水中配制而成。溶解于水中配制而成。pHpH5.86.06.26.46.66.88.0 mL12.3 mL18.5 mL26.5 mL37.5 mL49.0 mL92.0 mL87.7

7、 mL81.5 mL73.5 mL62.5 mL51.0 mL7.07.27.47.67.88.061.0 mL72.0 mL81.0 mL87.0 mL91.5 mL94.7 mL39.0 mL28.0 mL19.0 mL13.0 mL8.5 mL5.3 mL0.2 mol/LNaHNaH2 2POPO4 4/mL/mL0.2 mol/LNaNa2 2HPOHPO4 4/mL/mL0.2 mol/L0.2 mol/LNaHNaH2 2POPO4 4/mL/mLNaNa2 2HPOHPO4 4/mL/mL3 3、 缓冲液是如何配制的？缓冲液是如何配制的？ 通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓

8、冲剂溶解于水中配制而成。溶解于水中配制而成。 通过通过调节调节缓冲剂的缓冲剂的使用比例使用比例就可以制就可以制得得不同不同pH的缓冲液。的缓冲液。4 4、 本实验加的是什么缓冲液？本实验加的是什么缓冲液？ 为何要加缓冲液？为何要加缓冲液？, ,利用缓冲液模拟细胞内的利用缓冲液模拟细胞内的pHpH环境，环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察便于观察( () )和科学研究和科学研究( () )磷酸缓冲液磷酸缓冲液（三）电（三）电 泳泳1 1、概念：、概念：带电粒子带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。在电场作用下发生迁移的过程。2 2、原理：、原理： 电泳利用电泳

9、利用了待分离样品中各种了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子带电性质的差异以及 分子本身的大小，形状的不同分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的，使带电分子产生不同的 迁移速度迁移速度，从而实现样品中各种分子的，从而实现样品中各种分子的分离分离。 许多许多重要的重要的生物大分子生物大分子，如多肽、核酸等都具，如多肽、核酸等都具有可解离有可解离 的基团的基团，在一定的，在一定的pH下，这些基团会带上下，这些基团会带上正电或负电正电或负电。 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反电荷相反 的的电极移动。电极移动。3.3.分类：分

10、类：琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳和和聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳+ + + + +电泳原理图解电泳原理图解 相对分子质量等不同相对分子质量等不同，其其移动速度不同移动速度不同，从而实现了各种分子的，从而实现了各种分子的分离分离。 各种各种分子大小、分子大小、 带电性质、带电性质、 分子形状、分子形状、+ + + + +不同大小不同大小DNA片段的混合液片段的混合液样品处理样品处理粗分离粗分离纯纯 化化纯度鉴定纯度鉴定二、实验操作二、实验操作 ？ 动动 动动 脑脑二、实验操作二、实验操作二、实验操作二、实验操作（一）样品处理（一）样品处理知识回忆知识回忆血液的组成血液的组成二、实验操作二

11、、实验操作1 1血液血液100mL3g3g柠檬酸钠柠檬酸钠低速离心低速离心2 min红细胞红细胞血血 浆浆吸出血浆吸出血浆5 5倍体积生理盐水倍体积生理盐水搅拌搅拌10min重复洗涤重复洗涤3 3次，次，直至上清液没有黄色直至上清液没有黄色 红细胞红细胞 （一）样品处理（一）样品处理初次离心初次离心3 3次洗涤后次洗涤后1 1、红细胞的洗涤：、红细胞的洗涤：( (1 1) ) 为什么要进行红细胞的洗涤，洗涤的目的是什么？为什么要进行红细胞的洗涤，洗涤的目的是什么？( (2 2) ) 怎样洗涤红细胞？能用蒸馏水代替生理盐水吗怎样洗涤红细胞？能用蒸馏水代替生理盐水吗? ?(3) (3) 红细胞洗涤

12、干净的标志是什么红细胞洗涤干净的标志是什么? ?直至上清液中无黄色直至上清液中无黄色，表明洗涤干净。表明洗涤干净。（一）样品处理（一）样品处理2 2、血红蛋白的释放：、血红蛋白的释放： ( (1 1) )怎样让红细胞中的血红蛋白释放出来？怎样让红细胞中的血红蛋白释放出来？ ( (2 2) )加入甲苯的目的是什么？加入甲苯的目的是什么？ (3) (3)加入甲苯后搅拌的目的是什么加入甲苯后搅拌的目的是什么? ? 加入加入蒸馏水和甲苯蒸馏水和甲苯, ,使红细胞破裂使红细胞破裂，释放出血红蛋白，释放出血红蛋白加速细胞破裂加速细胞破裂点拨：点拨：细胞膜的主要成分是脂质，易溶于甲苯等细胞膜的主要成分是脂质

13、，易溶于甲苯等 有机溶剂中，加入甲苯可加速红细胞的破裂有机溶剂中，加入甲苯可加速红细胞的破裂溶解细胞膜溶解细胞膜（一）样品处理（一）样品处理红细胞红细胞破碎液破碎液高速离心高速离心10min 离心管离心管3 3、分离血红蛋白溶液：、分离血红蛋白溶液：出现分层出现分层2000r/min（一）样品处理（一）样品处理有机溶剂有机溶剂 无色透明的无色透明的甲苯层甲苯层脂类物质脂类物质 白色脂溶性白色脂溶性物质物质沉淀层沉淀层血红蛋白溶液血红蛋白溶液 红色透明液体红色透明液体红细胞破碎物沉淀红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物暗红色沉淀物离心管离心管3 3、分离血红蛋白溶液：、分离血红蛋白溶液：（一）样品处理

14、（一）样品处理红细胞红细胞破碎液破碎液高速离心高速离心10min 离心管离心管滤纸滤纸过滤过滤烧杯烧杯3 3、分离血红蛋白溶液：、分离血红蛋白溶液：去除脂溶性沉淀层去除脂溶性沉淀层出现分层出现分层分液漏斗中静置片分液漏斗中静置片刻后，分出下层的刻后，分出下层的红色透明液体红色透明液体2000r/min（一）样品处理（一）样品处理透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。取取1ml1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，的血红蛋白溶液装入透析袋中，（除去样品中分子量较小的杂质）（除去样品中分子量较小的杂质）二、实验操作二、实验操作（二）粗提取（二）粗提

15、取透析透析 将透析袋放将透析袋放入盛有入盛有300ml300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l20mmol/l的磷酸缓的磷酸缓冲液中（冲液中（pHpH为为7.07.0），透析，透析1212小时。小时。（二）粗提取（二）粗提取透析透析二、实验操作二、实验操作二、实验操作二、实验操作阅读教材相关部分内容，回答：阅读教材相关部分内容，回答：1.1.凝胶色谱操作分为哪几个步骤？凝胶色谱操作分为哪几个步骤？凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱（三）纯化（三）纯化-凝胶色谱法凝胶色谱法将分子量较大的将分子量较大的杂质蛋白质除去杂

16、质蛋白质除去二、实验操作二、实验操作1 1、凝胶色谱柱的制作：、凝胶色谱柱的制作：取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两两 端需用砂纸磨平。端需用砂纸磨平。（三）纯化（三）纯化-凝胶色谱法凝胶色谱法底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆盖覆盖尼龙网，再用尼龙网，再用100100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。二、实验操作二、实验操作1 1、凝胶色谱柱的制作：、凝胶色谱柱的制作：（三）纯化（三）纯化-凝胶色谱法凝胶色谱法指筛网在指筛网在1 1英寸线段英寸线段内的孔数为内的孔数为10010

17、0二、实验操作二、实验操作1 1、凝胶色谱柱的制作：、凝胶色谱柱的制作：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。导致液体残留，蛋白质分离不彻底。（三）纯化（三）纯化-凝胶色谱法凝胶色谱法二、实验操作二、实验操作1 1、凝胶色谱柱的制作：、凝胶色谱柱的制作：顶塞的制作：顶塞的制作：打孔打孔安装玻璃管安装玻璃管。（三）纯化（三）纯化-凝胶色谱法凝胶色谱法二、实验操作二、实验操作1 1、凝胶色谱柱的制作：、凝胶色谱柱的制作：（三）纯化（三）纯化-凝胶色谱法凝胶色

18、谱法组装：组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体将上述三者按相应位置组装成一个整体。+2 2、凝胶色谱柱的装填：、凝胶色谱柱的装填：材料：交联葡聚糖凝胶颗粒材料：交联葡聚糖凝胶颗粒G-75G-75；20mmol/L20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液装填装填: :步骤步骤操作要求操作要求根据色谱柱体积计算凝胶用量根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上色谱柱垂直固定在支架上计算称量凝胶计算称量凝胶固定色谱柱固定色谱柱“G”“G”表示凝胶的交联表示凝胶的交联程度程度。7575表示凝胶的表示凝胶的得水值，即每克凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水膨胀时吸水7.57.5克。克。二、实验操作二、

19、实验操作（三）纯化（三）纯化-凝胶色谱法凝胶色谱法配制悬浮液配制悬浮液装填悬浮液装填悬浮液或者凝胶颗粒洗脱液或者凝胶颗粒洗脱液沸水浴沸水浴 凝胶颗粒蒸馏水凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀充分溶胀一次性缓慢倒入；轻轻敲动一次性缓慢倒入；轻轻敲动色谱柱，色谱柱，使凝胶填装均匀。使凝胶填装均匀。商品凝胶凝胶是干燥的颗粒颗粒可直接在洗脱液洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可在沸水浴沸水浴使其快速膨胀 2 2、凝胶色谱柱的装填：、凝胶色谱柱的装填：二、实验操作二、实验操作（三）纯化（三）纯化-凝胶色谱法凝胶色谱法步骤步骤操作要求操作要求洗涤平衡洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤立刻用磷酸缓冲液洗涤12h，使凝胶装填紧密使凝胶装填紧密。3 3、样品加入与洗脱：、样品加入与洗脱：二、实验操作二、实验操作（三）纯化（三）纯化-凝胶色谱法凝胶色谱法 调节缓冲液面：调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 滴加透析样品：滴加透析样品：吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动顶端，滴加样