教学大肠菌群检测

1、食品微生物学检验 大肠菌群计数（GB 4789.3-2010 ） 大肠菌群的定义大肠菌群的定义 o 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需 氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 o 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据 卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的 细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便 污染的指示菌，根据进一步的生化试验，可将 这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆 菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴 沟肠杆菌等。 大肠杆菌的定义大肠杆菌的定义 o 大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆 菌科，归属于埃希氏菌属。 o 与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌， 包

2、括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致 病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌 （EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏 附性大肠杆菌（EAEC）。 卫生学意义 o 大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指 标，作为食品中的粪便污染指标。 o 食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染， 既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通 过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌 群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映 了对人体健康危害性的大小。 o 1 范围 o 本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms） 计数的方法。 o 本标准适用于食品中大肠菌群的计数。 o 2 术语和定义 o 2.

3、1 大肠菌群 :在一定培养条件下能发酵乳 糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性 无芽胞杆菌。 o 3 设备和材料 o 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其 他设备和材料如下： o 恒温培养箱：36 1 。 o 冰箱：2 5 。 o 恒温水浴箱：46 1 。 o 电子天平：感量 0.1 g。 o 均质器、振荡器、接种环 o 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、 10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器 及吸头。 o 无菌锥形瓶：容量 500 mL。 o 无菌培养皿：直径 90 mm。 o 杜氏小管 o pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 o 菌落计数器。 o 4

4、 培养基和试剂 o 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐 （Brilliant Green Lactose Bile，BGLB） 肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA） o 磷酸盐缓冲液、9毫升无菌生理盐水、 o 无菌 1 mol/L NaOH、无菌 1 mol/L HCl 第一法 大肠菌群 MPN 计数法 o 操作步骤 o 7.1 样品的稀释 o 7.1.1 固体和半固体样品:称取25g样品,放 入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的 无菌均质杯内 ,8000r/min10000r/min

5、 均质1min2min,或放入盛有225mL磷酸 盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍 击式均质器拍打1min2min,制成1 10的 样品匀液。 o 7.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品 置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的 无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃 珠)或其他无菌容器中充分振摇或置于机械 振荡器中振摇,充分混匀,制成1 10的样品 匀液。 o 7.1.5 根据对样品污染状况的估计,按上述 操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。 每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸 头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过 程不得超过15min。 o 7.1.3 样品匀

6、液的pH 应在6.57.5之间,必 要时分别用1mol/LNaOH 或1mol/LHCl调 节。 o 7.1.4 用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1 10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注 意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇 试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打,使其 混合均匀,制成1 100的样品匀液。 o 7.2 初发酵试验 o 每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品 匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接 种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每 管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双料 LST肉汤),36 1 培养24h2

7、h,观察 倒管内是否有气泡产生,24h2h产气者进 行复发酵试验(证实试验),如未产气则继续培 养至48h2h,产气者进行复发酵试验。未 产气者为大肠菌群阴性。 o 7.3 复发酵试验(证实试验) o 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养 物1 环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管 中, 361培养48h2h,观察产气情况。 产气者,计为大肠菌群阳性管。 o 7.4 大肠菌群最可能数(MPN)的报告 o 按7.3确证的大肠菌群BGLB阳性管数,检索 MPN表(见附录B),报告每g(mL)样品中大肠 菌群的MPN值。 第二法 大肠菌群平板计数法 矿泉水中大肠菌群的测定 o 一、实验目的

8、o 1、了解大肠菌群在食品检验中的意义 o 2、掌握矿泉水中大肠菌群的检验原理和测 定方法； o 3、熟练稀释分离和无菌操作技术 o 二、实验原理 o 大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气， 需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便 指标来评价食品的卫生质量，并推断食品是 否污染肠道致病菌。 o 食品中大肠菌群数是指以1毫升（或1克）检 样中大肠菌群最可能数（MPN）来表示。本 实验依据GB 4789.3-2010制定。 o 三、设备和材料 o 设备： o 恒温培养箱、冰箱、恒温水浴锅、电子天平、 均质器、振荡器、无菌吸管、无菌锥形瓶、 无菌培养皿、菌落计

9、数器、PH试纸、接种 环、杜氏小管、试管等。 o 培养基和试剂： o 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）、煌绿 乳糖胆盐肉汤（BGLB）、无菌生理盐水、 NAOH和HCL标准溶液。 o 四、操作步骤： o 1、液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品置 盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无 菌锥形瓶中振摇,充分混匀,制成1 10的样 品匀液。 o 2、样品匀液的PH值应在6.57.5之间，必 要时可用标准溶液调节PH值。 o 3、用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1 10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注 意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇 试

10、管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打,使其 混合均匀,制成1 100的样品匀液。 o 4、根据对样品污染状况的估计,按上述操作, 依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递 增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。 从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不 得超过15min。 o （二）初发酵试验 o 每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品 匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接 种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每 管接种1mL，36 1 培养48h2h, 观察倒管内是否有气泡产生，产气者进行复 发酵实验，未产气者为大肠菌群阴性。 o （三）复发酵实验 o 用接种环从产气的LST肉汤

11、管中分别取培养 物1 环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管 中, 361培养48h2h,观察产气情况。 产气者,计为大肠菌群阳性管。 o 五、实验报告 o （一）实验数据记录： o 将初发酵结果、复发酵结果填入实验数据表 格中； o （二）大肠菌群最可能数（MPN）的报告确 证的大肠菌群BGLB阳性管数,检索 MPN表 (见附录B),报告每g(mL)样品中大肠菌群的 MPN值。 大肠菌群实验数据记录 根据初发酵和复发酵产气情况填写表格，产气记为“+”； 不产气记为“”，最后根据产气管数对照MPN表格得出 最后的结论。 10版MPN表 03版MPN表 o 瓶(桶)装饮用纯净水卫生标准(GB

12、17324-2003) o 细菌菌落总数cfu/ml： 20 o 大肠菌群MPN/100ml： 3 在实验中如何选择合适的稀释度？ MPN表 o 1、新国标的MPN表的基准问题: o 新国标的MPN表采用了3个稀释度，分 别是十倍百倍千倍，加样量是3管，每 管1毫升，意味着加入样品的量为0.333克。 o 在样品加入量为0.333克的情况下，使 用新国标MPN表，得到MPN/克 的数值。 o2、 改 变 加 样 量 的 问 题。 o 在 实 际 操 作 中， 因 为 一 些 原 因 需 要 改 变 加 样 量， 一 般 是 1 0 倍 增 加 或 者 降 低， 同 样 使 用 本 表， 得 到

13、 的 数 值 需 要 做 1 0 倍 调 整。 o下 面 我 们 一 起 来 看 几 个 例 子！ o 比如： o 加样量为3.33克，这样查表得到的数值，应 该降低10倍。 o 如果其阳性管为210，查表为15，这样 的话，结果应该为 MPN 1.5/克，或者MPN 15/10克，或者MPN 150/100克。 o 再比如： o 加样量为0.0333克（这样的情况是， 不使用十倍稀释液，而使用百倍千倍万 倍稀释液，各用三管，每管1毫升）。这样 查表得到的数值，应该增高10倍。 o 如果其阳性管为210，查表为15， 这样的话，结果应该为 MPN 150/克，或者 MPN 1500/10克，或

14、者MPN 15000/100 克。 o 3、关于和产品标准对应的问题。 o 大家应该注意到，这个问题其实是一个 稀释度的选择问题。另外，这个问题也可以 回答是否可以直接换算的问题。 o 比如：某产品要求MPN30 /100克。 o 在这种情况下，我们如果使用加样量 0.333，如果全部是阴性0-0-0，得到的结 果为3/克，或者是30/10克，或者是 300/100克。很明显，在这种加样量情况 下是不能做出是否符合结果的判定的。 o 这样的话，就需要增加加样量，变成加样量 为3.33克，如果全部是阴性0-0-0，得到结 果为0.3/克，或者是3/10克，或者是 30/100克。这样的结果才能符

15、合要求。 o 如果更精确的操作，应该是加样量为 33.3克。这样如果全部是阴性0-0-0，得到 3/100克，结果为2-1-0，得到MPN 15/100克，也是合格产品。 小结 o 从这个意义上讲，稀释度的选择是根据产品 要求进行的，理论上： o 如果要求得到每克产品菌群含量，加样 量应该是0.333克比较合适。 o 如果要求得到每10克产品菌群含量，加 样量应该是3.33克比较合适。 o 如果要求得到每100克产品菌群含量， 加样量应该是33.3克比较合适。 o 当然，对于上面的产品要求MPN30 /100 克，采用加样量为33.3克，会比较麻烦，大 家可以采用加样量为3.33克，要求9管全

16、阴 性，这样也可以说的过去。 o o 但是，如果上面的产品要求MPN5 /100 克，这是一个极端的例子，如果采用加样量 为3.33克，9管全阴性，也是得不到合适的 结果的，这样的话就应该采用加样量为33.3 克的规范做法。 o 再举两个极端的例子： o 产品要求5/吨（当然这是不可能的）， 那么如果你采用0.333克加样量，然后进行 换算，是没有任何意义的，如果真要测定， 就需要采用333千克的加样量。当然，这种 情况是不会发生的。 o 产品要求1100/克，这也是没有任何意义的， 还是没有办法来判断产品是否合格。这里就 可以看做是要求1000/0.1克，或者 100/0.01克，或者是10/0.001克，