实验四乳鼠肺细胞原代培养

1、实验四 乳鼠肺细胞原代培养、实验目的1. 了解原代细胞培养的根本方法及操作过程2. 学习细胞消化、细胞计数方法。二、实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、 组织或器 官，经体外培养后， 直到第一次传代为止。 这种培养， 首先用无菌操作的方 法， 从动物体内取出所需 的组织或器官，经消化，分散成为单个游离的 细胞，在人工培养下，使其不 断的地生长及繁殖。三、实验用品1. 设备 CO2 培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、恒温水浴箱、离 心机等。2. 器材 眼科剪尖头、弯头、眼科镊尖头、弯头、培养皿、纱布块 或不锈钢 网、玻璃漏斗、量筒、移液管、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、 培养

2、皿等。上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好， 15 磅灭菌 30min 。此外，还需显 微 镜、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球等。3. 试剂 1 D-Hanks 平衡盐溶液： 即无钙、镁离子的 Hanks 液。2细胞消化液：胰蛋白酶液胰蛋白干粉，加 D-Hanks 平衡盐溶液 100mL ， 溶解后过滤除菌，调 pH 值3 NaHC 3O 溶液。4 RPMI1640 培养液。以上溶液均经适当包装， 除菌后备用。 此外，还需胎牛血清和 1000U/mL 的青、 链霉素液双抗。在 RPMI1640 培养液中参加 10% 胎牛血清， 1%双 抗，即成细胞培 养液。4. 仪器药品以 3-5 人为一个小组

3、，每组需备：乳鼠一只；眼科剪、眼科镊各两 90mm 把； 玻璃培养皿 3个，用以清洗组织块； 50mL 离心管 1个； 5mL、10mL 移 液管各 5 支； 35mm 培养皿 1个。四、材料出生后 2-3 天的乳鼠。五、实验步骤1. 清洗与消毒 操作者首先进行手的清洗与消毒。2. 处死动物 新生小鼠拉颈椎致死，置 75%酒精泡 23 秒钟，置平皿中。3. 取肺 左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部， 右手以眼科直剪剪开 皮肤， 充分 撕拉开，再用酒精棉球消毒， 继而以另一把眼科弯剪沿胸骨柄左 下缘向上剪开肋 骨，然后在切口中间横剪胸骨。 用眼科聂取出肺，置于盛有 Hanks 液含有 200U

4、/ml 青链霉素的玻璃平皿中，冲洗去血。4. 剪肺用眼科剪将肺分成几个肺叶， 用镊子去除周边的血凝块及纤维组织， 用 眼科 剪剪去肺门处的支气管和血管， 再用含有双抗的 Hanks 液冲洗 1 遍。用 弯头眼科剪， 将肾剪成 1mm3 大小的组织块，大小应尽量均匀一致，再用 Hank 液洗涤 2-3 次，直 到液体澄清为止。5. 消化及分散组织块将上步清洗过的 Hank 液吸掉，按组织块体积的 5-6 倍量参加消化液。转 入50mL离心管，置于37C水浴中进行消化。消化时间在 20-40min左右。每 隔 10min 摇动 一次，以便组织块散开，以利继续消化，直到组织变成松散、粘 稠状，并且颜

5、色 略变为白色为止。从水浴中取出离心管， 吸去胰蛋白酶液， 参加少量培养液， 用吸管反覆 吹打 组织块，直到大局部组织块均分散成混淆的细胞悬液为止。 此时，可将 分散的细 胞悬液经过灭菌的纱布 或不诱钢网 进行过滤，以去除局部较大的组织碎片。6. 计数与稀释从上步滤过的细胞悬液中吸取 1mL 细胞液，进行计数。将细胞液滴于血细 胞 计数板上， 按白细胞计数法进行计数， 计数后用培养液进行稀释， 将细 胞调整到5 X 105/ml左右7. 分装与培养接种时，在 25ml 的培养瓶中先参加的培养液，在用移液管将接种 1ml 稀 释好的细胞悬液，做好标志，注明细胞、日期等信息。然后将培养皿置于37C, 5%C2O 培养箱进行培养8. 观察置于37C培养的细胞，需逐日进行观察，主要观察： 1 培养液假设变为桔红色，一般显示细胞生长良好。2细胞生长状况与培养液颜色的变化，如培