嗜盐紫色硫细菌耐盐机制与光合色素研究

1、嗜盐紫色硫细菌耐盐机制与光合色素研究【摘要】：紫色硫细菌是不产氧光合细菌中的一个生境独特 的类群，大约出现在3.5Ga年前，是深入理解生命起源、自然界碳氮硫 在物质循环中的作用、以及揭示不产氧光合作用机理的良好模型生物 在去除污染水体有机物、氮和磷以及有毒物质硫化物中也具有重要的 应用价值。因该类群大多数种类生境特殊，较难获得纯培养物、菌种 生长不良易于丢失，因此对其研究远不如紫色非硫细菌深入和广泛。 奥氏酮(Okenone)类胡萝卜素是迄今发现的最古老的生物标志之一，已 被用作研究地球进化和环境适应机制的一个有效工具，目前发现它仅出现在紫色硫细菌的15个种类中。本课题组从青岛东风盐场分离获

2、得一株含有独特光合色素-奥氏酮的嗜盐紫色硫细菌 Marichromatiumsp.283-1。本文对该菌株的生物学特性、耐盐特性和 耐盐机制、光合色素组份分析、环境因子对色素合成的影响、尤其是 Oke none的特性和理化性质进行了系统研究，研究结果显示出 Okenone类胡萝卜素性能稳定，耐热性、抗光性良好，高色价且色泽鲜 艳，具有良好的特性，因此本文又进一步对Okenone的产量进行了优 化。主要研究结果如下：1生物学特性研究结果表明，紫色硫细菌 Marichromatiumsp.283-1对氧气敏感，最高能够耐受 15Og/LNaCI,1.8g/LNa2S.9H2O,7.7g/LNaNO

3、2,能在 pH6-9,温度 15 45C，光照强度100-8000Lux的范围内生长。不同的碳源、氮源、盐 度、pH、光照、温度对菌体形态和胞内硫粒数量都有影响。高盐胁 迫下细胞形态多样，体积增大，比表面积减小；在碱性和低温环境中细 胞呈棒状而且体积较大，胞内积累较多的硫粒；高温下，细胞呈长杆状, 体积变大,胞内积累较多硫粒。2.Marichromatiu nsp.283-1是一株厌氧 中度嗜盐紫色硫细菌，对其耐盐特性和耐盐机制进行了初步研究。结 果表明随着盐度增加菌株283-1生长的延滞期延长，对Na+有专一依 赖性，而对C1-依赖性较弱；它主要通过在胞内积累相容性溶质甜菜碱 来对抗胞外渗透

4、压力，胞内甜菜碱的含量随培养基 NaCI浓度的增加而 增加,2.0mol/LNaCl浓度时胞内甜菜碱含量可达到156.4mg/g细胞干 重。外源添加甜菜碱可以明显提高菌株 283-1耐盐生长的能力。因此, 菌株283-1是通过胞内积累甜菜碱来调节细胞内外渗透压平衡，外源添加甜菜碱可以明显提高该菌株对盐的耐受能力。3为了解决紫色硫细菌生物量普遍较低的问题，对其生长培养基进行了优化。采用单因 子试验、Plackett-Burman设计、最陡爬坡试验及中心组合设计响应面 分析,研究了乙酸钠、碳酸氢钠、氯化铵、硫化钠、硫酸镁和无机盐6个因子对菌株283-1生物量的影响。结果表明，乙酸钠和硫化钠是影响该

5、菌株生物量的主要因素，并获得了最佳培养基配方。优化后菌株生 长速率提高，延迟期缩短，生物量提高了 6倍，并且结果与理论预测值相 近。4.采用丙酮甲醇法提取菌体色素，通过UV-VIS、TLC、HPLC、 MS和图像灰度分析等方法全面分析了该菌株的光合色素。结果表明：光照厌氧条件下，菌株283-1主要积累8种光合色素，包括BChlaGG、 BChlaDHGG、BChlaTHGG 和 BChlap4 种细菌叶绿素,1 种 BPhe 和 OH-R.g-keto I、R.g-keto皿和Okenone3种类胡萝卜素，其中细菌叶绿 素BChlaP和类胡萝卜素Okenone含量最高，分别占总色素含量的 39

6、.6%和47.4%。同时建立了菌株283-1全色素的TLC和HPLC指纹 图谱,这两种指纹图谱分析方法均能进行光合色素的快速分析，适合于 紫色硫细菌Okenone系合成途径中和BChla合成途径中主要积累色 素组分和含量变化规律的研究。5.利用构建的指纹图谱研究了环境因 子光照、温度和盐度对菌株色素合成的影响，结果表明：光照强度的 变化主要影响类胡萝卜素和细菌叶绿素单位细胞的含量，对色素组份影响不明显；温度的对色素组份影响较大，低温(20 C)时，积累的类胡 萝卜素主要是Okenone,TLC指纹图谱未检测到另外两种类胡萝卜素。 在30C ,2000Lux时，细菌叶绿素和类胡萝卜素单位细胞含量

7、最高；而 在45C ,5000Lux时，细菌叶绿素和类胡萝卜素单位细胞含量最低。盐 度变化不影响菌株的色素组份，但对各组分的相对含量影响较大。高 盐(11%NaCI)下,BChlap和BPhe的积累量明显增加，尤其是BChlap的 相对含量增加约70%;但是,OH-R.g-ketol的积累量下调了 40%。低 盐(1%NaCl)下,BPhe和Okenone的相对含量明显上调。6.Okenone类 胡萝卜素作为地球进化过程一种重要的生物标志物。菌株283-1胞内可积累大量的Okenone系类胡萝卜素。在紫色硫细菌Marichromatiumsp.283-1光合色素组成分析的基础上，通过丙酮甲醇提

8、 取、皂化、TLC和HPLC分析、制备得到纯化的 Okenone类胡萝卜 素，并研究了光(包括紫外线)、温度、pH、金属离子、氧化剂、还原剂、 自由基和食品添加剂等对 Oke none类胡萝卜素稳定性的影响。结果表 明，在暗处、1000Lux光照强度和4C、30C、50C的条件下，Okenone 具有很好的稳定性，有很高的耐光和耐热能力；强酸和强碱对Okenone 破坏较大；对食品添加剂和多数金属离子稳定，但是Fe3+、Mg2+、 AI3+和Cu2+的影响较大，尤其是Fe3+因此,Okenone存放时应避免与 这些物质接触。Okenone类胡萝卜素吸收光谱形状和精细结构受到有 机溶剂极性的影响

9、，当溶剂由非极性转变为极性时，其精细结构减弱或 消失，吸收峰趋于平滑。Okenone在石油醚溶液中呈鲜艳的橙红色，色 价为40000。Okenone对紫外辐射具有较强的吸收作用，因此它可通过 牺牲自己起到防护作用。以DPPH-作为自由基检测试剂，测定了该类 胡萝卜素清除DPPH-自由基能力，结果表明它具有抗氧化生物活 性,EC50=0.022mg/mL。7.在优化了生物量的基础上，继续通过响应面 分析法研究了培养基中5种无机盐和微量元素对菌株 283-10kenone 类胡萝卜素积累的影响。结果表明：培养基中微量元素、碳酸氢钠和 磷酸二氢钾显著影响Okenone类胡萝卜素在胞内的积累，通过 B

10、ehnkenBox试验设计，得到了最佳培养基配方。在优化培养基 中,Okenone产量由原来的1.454mg/L提高到了 2.926mg/L,提高了 101.2%【关键词】：紫色硫细菌耐盐机制光合色素奥氏酮稳定性【学位授予单位】：山西大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2013【分类号】：Q93【目录】：中文摘要12-15ABSTRACT15-19第一章绪论19-361.1紫 色硫细菌概述19-221.1.1紫色硫细菌的系统分类191.1.2紫色硫细菌 的生理生态特征19-211.1.3紫色硫细菌的应用21-221.2中度嗜盐菌概 述22-231.2.1中度嗜盐菌的耐盐机制22-231.2

11、.2中度嗜盐菌的应用 231.3光合色素概述23-311.3.1类胡萝卜素24-261.3.2细菌叶绿素 26-281.3.3光合色素分析方法28-311.4影响微生物色素合成的因素 31-321.4.1培养基成分对微生物色素合成的影响311.4.2环境因素对微生物色素合成的影响31-321.4.3金属离子和无机盐对微生物色素合 成的影响321.4.4添加有机物对微生物色素合成的影响321.5本课题研究目的和意义32-36第二章嗜盐紫色硫细菌Marichromatiumsp.283-1 的生物学特性 36-452.1 材料与方法 36-382.1.1 材料362.1.2方法36-382.2结果

12、38-432.2.1细胞形态382.2.2NaCI耐受 性382.2.3氧气敏感性测试38-392.2.4碳源、氮源和硫化物利用能力 392.2.5硫化物的耐受能力39-402.2.6亚硝酸钠的耐受能力402.2.7环 境条件对菌株生长的影响40-412.2.8不同条件下283-1细胞形态 41-432.3结论43-45第三章嗜盐紫色硫细菌Marichromatiumsp.283-1 的耐盐机制45-523.1材料与方法45-473.1.1材料45-463.1.2方法 46-473.2结果47-503.2.1不同NaCI浓度对菌株生长的影响 47-483.2.2 不同种类阴阳离子对菌株283-

13、1生长的影响483.2.3不同渗透压冲击 对菌株283-1耐盐生长的影响48-493.2.4外加相容性溶质对菌株283-1 耐盐生长的影响493.2.5不同盐浓度下菌株283-1胞内游离氨基酸的 积累49-503.2.6不同盐浓度下菌株283-1胞内甜菜碱的积累503.3结 论50-52第四章嗜盐紫色硫细菌 Marichromatiumsp.283-1生长培养基 优化52-594.1材料与方法52-544.1.1材料52-534.1.2方法53-544.2结 果与分析54-574.2.1单因素试验544.2.2Plackett-Burman试验54- 554.2.3最陡爬坡试验554.2.4中

14、心组合试验和响应面分析55- 574.2.5验证试验574.3结论57-59第五章嗜盐紫色硫细菌Marichromatiumsp.283-1光合色素分析及环境因子对色素合成的影响 59-725.1材料与方法59-615.1.1材料59-605.1.2方法60-615.2结果与 分析61-705.2.1活细胞吸收光谱61-625.2.2色素的提取和含量测定 625.2.3TLC色素指纹图谱分析和灰度分析 62-635.2.4TLC色素指纹光 谱学特征63-645.2.5HPLC色素指纹图谱64-655.2.6MS分析655.2.7 色素组分定性分析65-665.2.8环境因子对色素合成的影响66

15、-705.3结 论70-72第六章嗜盐紫色硫细菌生物标志物 Oke none的分离鉴定和性 质研究72-866.1材料与方法72-756.1.1材料72-736.1.2方法73-756.2 结果与分析75-846.2.1Okenone类胡萝卜素的制备和鉴定756.2.2Oke none类胡萝卜素色价和溶剂效应 75-776.2.3光照强度对 Okenone类胡萝卜素的影响77-796.2.4Okenone类胡萝卜素的热稳定 性796.2.5酸碱对Okenone类胡萝卜素稳定性的影响 79-826.2.6金属 离子、食品添加剂和氧化还原剂对 Oke none稳定性影响826.2.7Oke none类胡萝卜素抗紫辐射能力 82-836.2.8Oke none类胡萝 卜素清除DPPH自由基能力83-846.3结论84-86第七章响应面法优化Okenone类胡萝卜素发酵培养基86-967.1材料与方法87-887.1.1材 料 877.1.2 方法 87-887.2 结果与分析 88-947.2.1Plackett-Burman试验 88-897.2.2最陡爬坡试验89-907.2.3Box-Benhken试验设计和响应面分 析90-937.2.4验证试验93-947.3结论94-