第六章 化学物质与蛋白质的相互作用

1、第六章第六章 化学物质与蛋白质的相互作用化学物质与蛋白质的相互作用 在生物体内，蛋白质（包括酶）占细胞干重的在生物体内，蛋白质（包括酶）占细胞干重的70%70%以上，以上， 种类繁多，在生命活动过程中起着发挥各种各样的作种类繁多，在生命活动过程中起着发挥各种各样的作 用。随着人们对环境保护和生活质量要求的提高，蛋用。随着人们对环境保护和生活质量要求的提高，蛋 白质在食品、医药（生化药物、临床检验、药物筛选白质在食品、医药（生化药物、临床检验、药物筛选 等）、环保（环境分析）、农业、日用化工（化妆等）、环保（环境分析）、农业、日用化工（化妆 品）、精细化工（酶催化合成）等领域的应用日益广品）、精

2、细化工（酶催化合成）等领域的应用日益广 泛。泛。 在蛋白质体外的应用中，一般涉及到在蛋白质体外的应用中，一般涉及到分离纯化、储存、分离纯化、储存、 含量检测含量检测等过程等过程，其中常常发生化学物质与蛋白质非，其中常常发生化学物质与蛋白质非 专一性的相互作用，如沉淀作用、变性作用、稳定作专一性的相互作用，如沉淀作用、变性作用、稳定作 用以及化学修饰作用等。用以及化学修饰作用等。 球状蛋白三级结构的主要特征球状蛋白三级结构的主要特征 绝大多致的蛋白质折叠成为近乎球状的结构。球状蛋白质一旦具有绝大多致的蛋白质折叠成为近乎球状的结构。球状蛋白质一旦具有 三级结构后，蛋白质内部变得更为紧密，内部的空间

3、约有三级结构后，蛋白质内部变得更为紧密，内部的空间约有7575被原被原 子所充满。这样的密集程度远远超过在液体中的小分子，可以与一子所充满。这样的密集程度远远超过在液体中的小分子，可以与一 些晶体的情况相比。些晶体的情况相比。 可以认为蛋白质是带有极性外套的油滴，也就是可以认为蛋白质是带有极性外套的油滴，也就是“非极性在内，极非极性在内，极 性在外性在外”。大量蛋白质的。大量蛋白质的X X射线晶体衍射分析统计的结果充分证明射线晶体衍射分析统计的结果充分证明 了这一规律。了这一规律。 存在于蛋白质内部主要是一些非极性残基的侧链存在于蛋白质内部主要是一些非极性残基的侧链，约有，约有6363是丙氨是

4、丙氨 酸、甘氨酸、异亮氨酸、有氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸等；酸、甘氨酸、异亮氨酸、有氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸等；带电的残带电的残 基基，天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸只有，天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸只有4 4。约约9595的带电的带电 的侧链是分布在蛋白质的表面的侧链是分布在蛋白质的表面；约；约1414的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨 酸和苯丙氨酸在蛋白质分子表面。酸和苯丙氨酸在蛋白质分子表面。 在蛋白质的内部也存在极少量的亲水残基，在蛋白质分子的表面也常在蛋白质的内部也存在极少量的亲水残基，在蛋白质分子的表面也常 见到一些疏水的残基。这些见到一些疏水的残基。这些“异常异常”

5、分布的残基，致使肽链的局部结分布的残基，致使肽链的局部结 构发生构发生“扭曲扭曲”，一些键的张角与一般正常的值有所偏离，蛋白质中，一些键的张角与一般正常的值有所偏离，蛋白质中 这些局部的构象具有相对偏高的能量，相对地处于较不稳定的状态，这些局部的构象具有相对偏高的能量，相对地处于较不稳定的状态， 在外界很小的扰动作用下，就能发生变化。在外界很小的扰动作用下，就能发生变化。 原则上，一些相对规则的原则上，一些相对规则的 - -螺旋和螺旋和 - -折叠分布在球状蛋白的内部，而折叠分布在球状蛋白的内部，而 且压积得很紧密，致使球状蛋白成为致密的结构；那些连接且压积得很紧密，致使球状蛋白成为致密的结构

6、；那些连接 - -螺旋和螺旋和 - -折叠叠的规整性相对差一些的二级结构，转角和环状以及特定的折叠叠的规整性相对差一些的二级结构，转角和环状以及特定的 “无规无规”卷曲，则更多地是分布在球状蛋白的外周。卷曲，则更多地是分布在球状蛋白的外周。 还值得指出的是，在很多蛋白质分子的内部还存在着数量不同的水分还值得指出的是，在很多蛋白质分子的内部还存在着数量不同的水分 子，这些水分子也和一些极性的基因或负电性的原子形成氢键。其中子，这些水分子也和一些极性的基因或负电性的原子形成氢键。其中 一些水分子也参与了蛋白质功能的行使。一些水分子也参与了蛋白质功能的行使。 球状蛋白的表面并不是非常光滑的，而是具有

7、很多沟渠，多数球状蛋球状蛋白的表面并不是非常光滑的，而是具有很多沟渠，多数球状蛋 白的可及表面的面积约为同样大小的球的表面积的两倍。白的可及表面的面积约为同样大小的球的表面积的两倍。 球状蛋白质分子的立体结构具右高度特异性和高度灵球状蛋白质分子的立体结构具右高度特异性和高度灵 敏性。每种蛋白质分子都有特定的高级结构。这种构敏性。每种蛋白质分子都有特定的高级结构。这种构 象的特异性，使它区别于其他蛋白质；但这种高度特象的特异性，使它区别于其他蛋白质；但这种高度特 异的结构，并非固定不变，在执行生物学功能时，常异的结构，并非固定不变，在执行生物学功能时，常 常发生一系列的构象变化，表现出高度灵敏性

8、。常发生一系列的构象变化，表现出高度灵敏性。 在生物体内，这些构象变化，往往是该蛋白质分子与在生物体内，这些构象变化，往往是该蛋白质分子与 配基相互作用引起的，配基包括酶的小分子底物、受配基相互作用引起的，配基包括酶的小分子底物、受 体的小分子激素和神经介质、血红蛋白的体的小分子激素和神经介质、血红蛋白的O O2 2等。因此，等。因此， 生物体内的蛋白质是处于一种可以相互转变的多种构生物体内的蛋白质是处于一种可以相互转变的多种构 象的平衡态象的平衡态. . 球状蛋白质分子表面并不是光滑的，经常会出现一些球状蛋白质分子表面并不是光滑的，经常会出现一些 “裂隙裂隙”或或“洞穴洞穴”，在，在“裂隙裂

9、隙”或或“洞穴洞穴的周的周 围常常是疏水性的：这些围常常是疏水性的：这些“裂隙裂隙”或或“洞穴洞穴”可能是可能是 蛋白质蛋白质( (酶酶) )的活性部位所在。的活性部位所在。 硫氧还蛋白的结构硫氧还蛋白的结构 紧密结合水紧密结合水 亲水性残基亲水性残基 疏水性残基疏水性残基 第一节第一节 化学物质对蛋白质的沉淀作用化学物质对蛋白质的沉淀作用 由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶 液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔 现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通现象、布郎运动等。由于

10、胶体溶液中的蛋白质不能通 过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂 质除去。质除去。 根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环境发生改变时，根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环境发生改变时， 蛋白质会发生沉淀作用。蛋白质会发生沉淀作用。 蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的 电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白 质的溶解性质。在适当的条件下，蛋白质能够从溶液质的溶解性质。在适当的条件下，蛋白质能够从溶液 中沉淀出来。中沉淀出来。 一、一、 沉沉

11、 淀淀 作作 用用 的的 类类 型型 1 1、可逆沉淀可逆沉淀 2 2、不可逆沉淀不可逆沉淀 3 3、抗体抗体- -抗原沉淀抗原沉淀 在温和条件下，通过改变溶液的在温和条件下，通过改变溶液的pHpH 或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液 中沉淀分离。蛋白质在沉淀过程中中沉淀分离。蛋白质在沉淀过程中 结构和性质都没有发生变化，在适结构和性质都没有发生变化，在适 当的条件下，可以重新溶解形成溶当的条件下，可以重新溶解形成溶 液，又称为非变性沉淀。液，又称为非变性沉淀。 在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋 白质胶体溶液的稳定性，而且也破白质胶体溶液的

12、稳定性，而且也破 坏了蛋白质的结构和性质，产生的坏了蛋白质的结构和性质，产生的 蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构由于沉淀过程发生了蛋白质的结构 和性质的变化，又称为变性沉淀。和性质的变化，又称为变性沉淀。 抗体和抗原蛋白通过相互识别抗体和抗原蛋白通过相互识别 和结合而发生的沉淀现象。这和结合而发生的沉淀现象。这 种特殊的沉淀作用是生物体免种特殊的沉淀作用是生物体免 疫功能的基础疫功能的基础。 二、沉淀剂类型二、沉淀剂类型 1 1、无机物沉淀、无机物沉淀 2 2、等电点沉淀等电点沉淀 3 3、有机物沉淀有机物沉淀 4 4、聚合物沉淀聚合

13、物沉淀 盐析盐析 金属离子沉淀法金属离子沉淀法 有机溶剂有机溶剂 酚类化合物及其有机酸酚类化合物及其有机酸 非离子型聚合物沉淀法非离子型聚合物沉淀法 聚电解质沉淀法聚电解质沉淀法 当向蛋白质溶液中逐渐加入无机盐时，当向蛋白质溶液中逐渐加入无机盐时， 开始，蛋白质的溶解增大，这是由于开始，蛋白质的溶解增大，这是由于 蛋白质的活度系数降低的缘故，这种蛋白质的活度系数降低的缘故，这种 现象称为盐溶。现象称为盐溶。 但当继续加入电解质时，另一种因素但当继续加入电解质时，另一种因素 起作用，使蛋白质的溶解度减小，称起作用，使蛋白质的溶解度减小，称 为盐析。这是由于电解质的离子在水为盐析。这是由于电解质的

14、离子在水 中发生水化，当电解质的浓度增加时，中发生水化，当电解质的浓度增加时， 水分子就离开蛋白质的周围，暴露出水分子就离开蛋白质的周围，暴露出 疏水区域，疏水区域间的相互作用，疏水区域，疏水区域间的相互作用， 使蛋白质聚集而沉淀，疏水区域越多，使蛋白质聚集而沉淀，疏水区域越多， 就越易产生沉淀。就越易产生沉淀。 （1 1）盐析）盐析 牢固结牢固结 合水合水大量溶大量溶 剂水层剂水层 1、无机物沉淀、无机物沉淀 含高价阴离子的盐，效果比含高价阴离子的盐，效果比1 1价的盐好。阴离子价的盐好。阴离子 的盐析效果有下列次序：的盐析效果有下列次序： 柠檬酸盐柠檬酸盐POPO4 43- 3- SOSO

15、4 42- 2- CHCH3 3COOCOO- -ClCl- -NONO3- 3- SCNSCN- -。 但高价阳离子的效果不如低价阳离子，例如硫酸但高价阳离子的效果不如低价阳离子，例如硫酸 镁的效果不如硫酸铵。对于镁的效果不如硫酸铵。对于1 1价阳离子则有下列价阳离子则有下列 次序：次序：NHNH4 4+ +K K+ +NaNa+ +。 因此，最常用的盐析剂是硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾或因此，最常用的盐析剂是硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾或 磷酸钠。但硫酸钠在磷酸钠。但硫酸钠在40C40C 以下溶解度较低，因而仅适以下溶解度较低，因而仅适 用于对热稳定的蛋白质。磷酸盐在中性范围内实际上用于对热稳定的蛋白

16、质。磷酸盐在中性范围内实际上 是是HPOHPO4 42- 2-和 和H H2 2POPO4- 4-的混合物，其作用比 的混合物，其作用比POPO4 43+ 3+差。硫酸铵 差。硫酸铵 由于价廉、溶解度大，且能使蛋白质稳定由于价廉、溶解度大，且能使蛋白质稳定, , 在在2-2- 3mol/L (NH4)3mol/L (NH4)2 2SOSO4 4中酶可保存几年。同时由于盐的浓中酶可保存几年。同时由于盐的浓 度高，可防止蛋白酶和细菌作用，故是最常用的盐析度高，可防止蛋白酶和细菌作用，故是最常用的盐析 剂。硫酸铵的缺点是水解后变酸，在高剂。硫酸铵的缺点是水解后变酸，在高pHpH下会释放出下会释放出

17、氨，腐蚀性强；残留的硫酸铵在食品中虽然量少，也氨，腐蚀性强；残留的硫酸铵在食品中虽然量少，也 会影响其味，在医疗上有毒，因此必须除去。会影响其味，在医疗上有毒，因此必须除去。 （2 2）金属离子沉淀法）金属离子沉淀法 一些高价金属离子对沉淀蛋白质很有效。它们可以分一些高价金属离子对沉淀蛋白质很有效。它们可以分 为三类：为三类： 第一类为第一类为MnMn2+ 2+， ，FeFe2+ 2+， ，CoCo2+ 2+， ，NiNi2+ 2+， ，CuCu2+ 2+， ，ZnZn2+ 2+和 和CdCd2+ 2+能 能 和蛋白质分子表面的羧基，氨基、咪唑基、胍基等侧和蛋白质分子表面的羧基，氨基、咪唑基、

18、胍基等侧 链结合。链结合。 第二类为第二类为CaCa2+ 2+， ，BaBa2+ 2+， ，MgMg2+ 2+和 和PbPb2+ 2+能和蛋白质分子表面 能和蛋白质分子表面 的羧基结合，但不和含氮化合物相结合。的羧基结合，但不和含氮化合物相结合。 第三类为第三类为AgAg+ +，HgHg2+ 2+和 和PbPb2+ 2+能和蛋白质分子表面的巯基 能和蛋白质分子表面的巯基 相结合。相结合。 金属离子沉淀法的优点是它们在稀溶液中对蛋白金属离子沉淀法的优点是它们在稀溶液中对蛋白 质有效强的沉淀能力。处理后残余的金属离子可质有效强的沉淀能力。处理后残余的金属离子可 用离子交换树脂或螯合剂除去。用离子交

19、换树脂或螯合剂除去。 在这些离子中，应用较广的是在这些离子中，应用较广的是ZnZn2+ 2+， ，CaCa2+ 2+， ，MgMg2+ 2+， ， BaBa2+ 2+和 和MnMn2+ 2+，而 ，而CuCu2+ 2+， ，FeFe2+ 2+， ，PbPb2+ 2+， ，HgHg2+ 2+等较少应用， 等较少应用， 因为它们会使产品损失和引起污染。如因为它们会使产品损失和引起污染。如ZnZn2+ 2+可用于 可用于 沉淀杆菌肽沉淀杆菌肽( (作用于第作用于第4 4个组氨酸残基上个组氨酸残基上) )和胰岛素；和胰岛素； CaCa2+ 2+(CaCO (CaCO3 3) )用于分离乳酸，血清清蛋白

20、等。用于分离乳酸，血清清蛋白等。 2 2、等电点沉淀等电点沉淀 蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。 在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 等电点沉淀法的一个主要优点是很多蛋白质的等电点等电点沉淀法的一个主要优点是很多蛋白质的等电点 都在偏酸性范围内，而无机酸通常价较廉，并且某些都在偏酸性范围内，而无机酸通常价较廉，并且某些 酸，如磷酸、盐酸和硫酸的应用能为蛋白质类食品所酸，如磷酸、盐酸和硫酸的应用能为蛋白质类食品所 允许。同时，常可直接进行其他纯化操作，无需将残允许。同时，

21、常可直接进行其他纯化操作，无需将残 余的酸除去。余的酸除去。 等电点沉淀法的最主要缺点是酸化时，易使蛋白质失等电点沉淀法的最主要缺点是酸化时，易使蛋白质失 活，这是由于蛋白质对低活，这是由于蛋白质对低pHpH比较敏感。比较敏感。 pHpH对对 - -乳球蛋白溶解度的影响乳球蛋白溶解度的影响 3 3、有机物沉淀有机物沉淀 利用和水互溶的有机溶剂使蛋白质沉淀的方法很早就利用和水互溶的有机溶剂使蛋白质沉淀的方法很早就 用来纯化蛋白质。加入有机溶剂于蛋白质溶液中产生用来纯化蛋白质。加入有机溶剂于蛋白质溶液中产生 多种效应，这些效应结合起来使蛋白质沉淀。其中主多种效应，这些效应结合起来使蛋白质沉淀。其中

22、主 要效应是水活度的降低。要效应是水活度的降低。 当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白质分子表面上荷电当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白质分子表面上荷电 基团或亲水基团的水化程度降低，或者说溶剂的介电基团或亲水基团的水化程度降低，或者说溶剂的介电 常数降低，因而静电吸力增大。常数降低，因而静电吸力增大。 在疏水区域附近近有序排列的水分子可以为有机溶剂在疏水区域附近近有序排列的水分子可以为有机溶剂 所取代，使这些区域的溶解性增大。但除了疏水性特所取代，使这些区域的溶解性增大。但除了疏水性特 别强的蛋白质外，对多数蛋白质来说，后者影响较小，别强的蛋白质外，对多数蛋白质来说，后者影响较小， 所以总的效果是导致

23、蛋白质分子聚集而沉淀。所以总的效果是导致蛋白质分子聚集而沉淀。 （1 1）有机溶剂）有机溶剂 有机溶剂沉淀法的优点是溶剂容易蒸发除去，不会残留有机溶剂沉淀法的优点是溶剂容易蒸发除去，不会残留 在成品中，因此适用于制备食品蛋白质。而且有机溶剂在成品中，因此适用于制备食品蛋白质。而且有机溶剂 密度低，与沉淀物密度差大，便于离心分离。有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，便于离心分离。有机溶剂 沉淀法的缺点是容易使蛋白质变性失活，且有机溶剂易沉淀法的缺点是容易使蛋白质变性失活，且有机溶剂易 燃、易爆、安全要求较高。燃、易爆、安全要求较高。 一般所选择的溶剂必须能和水互溶，而和蛋白质不发生一般所选择的溶剂

24、必须能和水互溶，而和蛋白质不发生 化学反应，最常用的溶剂是乙醇和丙酮，加量在化学反应，最常用的溶剂是乙醇和丙酮，加量在20%-50%20%-50% （V/VV/V）之间。当蛋白质的溶液）之间。当蛋白质的溶液pHpH接近等电点时，引起接近等电点时，引起 沉淀所需加入有机溶剂的量较少。沉淀所需加入有机溶剂的量较少。 （2 2）酚类化合物及有机酸沉淀）酚类化合物及有机酸沉淀 当蛋白质溶液当蛋白质溶液pHpH小于其等电点时，蛋白质颗粒带小于其等电点时，蛋白质颗粒带 有正电荷，容易与酚类化合物或有机酸酸根所带的有正电荷，容易与酚类化合物或有机酸酸根所带的 负电荷发生作用生成不溶性盐而沉淀。负电荷发生作用

25、生成不溶性盐而沉淀。 这类化合物包括鞣酸（又称单宁）、苦味酸（即这类化合物包括鞣酸（又称单宁）、苦味酸（即 2,4,6-2,4,6-三硝基苯酚）、三氯乙酸、磺酰水杨酸等。三硝基苯酚）、三氯乙酸、磺酰水杨酸等。 单宁是一种多酚类化合物的寡聚单宁是一种多酚类化合物的寡聚 体，它们的酚羟基可以解离而带体，它们的酚羟基可以解离而带 有负电荷，而且分子中的苯环、有负电荷，而且分子中的苯环、 多个羟基可以与蛋白质发生非共多个羟基可以与蛋白质发生非共 价相互作用，结合在蛋白质的表价相互作用，结合在蛋白质的表 面，然后在蛋白质分子之间形成面，然后在蛋白质分子之间形成 多点交连而成网络结构，最终导多点交连而成网络结构，最终导 致聚集而沉淀致聚集而沉淀 4 4、聚合物沉淀聚合物沉淀 许多非离子型聚合物，包括聚乙二醇（许多非离子型聚合物，包括聚乙二醇（PEGPEG）可用来进行）可用来进行 选择性沉淀以纯化蛋白质。聚合物的作用认为与有机溶剂选择性沉淀以纯化蛋白质。聚合物的作用认为与有机溶剂 相似，能降低水化度，使蛋白质沉淀。此现象和双水相的相似，能降低水化度，使蛋白质沉淀。此现象和双水相的 形成有联系。若使低分子量的蛋白质沉淀，需加入大量形成有联系。若使低分子量的蛋白质沉淀，需加入大量 PEGPEG；而使高分子量的蛋白质沉淀，加入的量较小。；而使高分子量的蛋白质沉淀，加入的量较小。PEGP