酿酒酵母发酵液中SAM分离纯化工艺的研究讲解

1、燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 酿酒酵母发酵液中SAM分离纯化工艺的研究摘 要 本设计拟定以酿酒酵母发酵液为原料，以离子交换提取法对酿酒酵母发酵液中SAM进行分离提取，并对其工艺的优化条件进行探究。本实验主要分为三部分来研究：酵母不同破碎方法对SAM释放率的影响；JK110树脂层析的最佳条件的测定；JK110树脂层析的最佳条件的测定通过本次课程设计。第一部分是用不同的方法对细胞进行破碎，从酿酒酵母细胞中抽提SAM 从过实验方法的到提取率和产品质量来确定最佳的细胞破碎的方法，第二部分以单一条件为变量进行试验确定层析的最佳流速、pH、SAM的浓度等条件，第三部分同样以单一条件为变量进行

2、实验确定洗脱的最佳流速和洗脱剂的浓度。拟确定酿酒酵母发酵液中SAM的提取的优化条件，以获得较高提取率及各项指标的最佳范围，进一步扩宽SAM的应用范围，为SAM的提取在本专科实验教学中的应用及工业生产中提供参考依据，并为今后某些物质的分离提取工艺研究奠定技术基础。关键字：SAM、细胞破碎、分离提取、最佳条件 目录第一部分 文献综述1. SAM11.1 SAM 简介11.2 SAM 的功效11.3 SAM的合成方法12 腺苷蛋氨酸的床应用和药理22.1 SAM 临床应用研究22.1.1抑郁症22.1.2肝病32.1.3关节炎32.1.4纤维性肌痛、偏头痛32.1.5 其它应用42.2药理作用42.

3、2.1腺苷蛋氨酸的体内代谢52.2.2 腺苷蛋氨酸的药理53食品营养强化剂64. S-腺苷甲硫氨酸的分离纯化74.1细胞破碎74.1.1机械法：74.1.2 非机械法84.2离子交换树脂法分离纯化8第二部分 课程设计1.材料111.1 实验原料111.2 实验仪器122实验方法122.1酵母细胞中抽提SAM122.1.1酸法122.1.2有机溶剂法132.1.3超声波法132.1.4 pH 反复冻融法132. 1.5雷氏盐沉淀分离SAM132.2 SAM在JKll0树脂上的静态交换容量的测定132.3动态离子交换实验142.4SAM在JKl10树脂上的交换最佳条件测定142.4.1最佳流速的测

4、定142.4.2 SAM最佳浓度的测定142.4.3 pH测定142.5 最佳脱洗条件的测定153设计153.1酵母不同破碎方法对SAM释放率的影响153.2 JK110树脂层析的最佳条件的测定153.3 JK110树脂层析脱洗的最佳条件的测定164分析与展望164.1酵母不同破碎方法对SAM释放率的影响164.2JK110树脂层析的最佳条件174.3 JK110树脂洗脱的最佳条件175总结体会17参考文献19第一部分 文献综述1. SAM1.1 SAM 简介S -腺苷- L -甲硫氨酸 (S-adenosyl-L-methinnine， 简称SAM，SAMe 或 AdoMet) 是甲硫氨酸的

5、一种有机四价硫形式(金属梳)的磺酞化合物，被称为“活性甲硫氨酸”，其结构于 1952 年被 cantoni 阐明。sAM 有两种异构体形式，分别为 (R,S)-SAM，(S,S)-SAM只有 (S,S)-SAM 才具有生物活性。在生物体内，SAM 的胞内合成是通过 SAM 合成酶(ATP:L- 甲硫氨酸 s-adenosyltransferase,EC2.5.1.6) 催化 ATP 和 L-甲硫氨酸反应完成的1。1.2 SAM 的功效SAM 是广泛存在于动物、植物和微生物体内的重要代谢中间物质，也是人体内一种重要的生理活性物质，作为基团提供者和酶的诱导剂参与许多关键的生化反应，如脂类、蛋白质、

6、核酸的甲基化，转硫反应及聚胺的合成等等。由于分子中高能硫离子的存在，SAM 表现出极端的不稳定性，易发生水解反应，消旋反应和裂解反应。 SAM 不仅具有广泛的重要生理作用，更有良好的临床应用价值。30 多年的应用研究证明， SAM 对肝病、抑郁症、痴呆症、关节炎和空泡脊髓炎等疾病有显著的治疗作用，而且还是预防癌症，心血管疾病和抗衰老的高级保健药物2。1.3 SAM的合成方法SAM 的生产方法有化学合成法、体外酶催化合成法和微生物发酵法3。 SAM的旋光性及其不稳定性大大降低了化学合成法的可能性4。酶催化合成法是以 ATP 和 L-甲硫氨酸为底物，在 SAM 合成酶的催化下合成 SAM，但是 A

7、TP 价格昂贵，而且生物细胞中 SAM 合成酶的浓度很低，造成生产水平不高，提取困难，生产效率很低，成为大规模酶催化生产 SAM 的限制因素5。目前的工业化规模中微生物发酵生产 SAM 仍然是主流。 SAM 的高产主要取决于两个因素：优良的菌种和细胞高密度发酵培养，前者侧重于提高胞内含量，后者侧重于提高体积产量。优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键。菌种选育包括自然选育以及人为引起的遗传变异或者基因重组。微生物诱变育种是菌种选育的一个重要途径，在发酵工业的菌种选育中发挥着不可磨灭的作用。微生物诱变育种的过程主要包括：出发菌株的选择；菌种的富集培养与分离纯化；单抱子(或者单细胞)悬液的制备：诱

8、变剂、诱变剂用量以及诱变方式的选择；突变菌株的分离、高产菌株的筛选及其遗传稳定性的考察。在富含L-甲硫氨酸的培养基中，酿酒酵母属微生物 (5cerevisiae) 尤其具有较强的 SAM 胞内合成积累能力，而且易于高密度发酵培养。该方法成本合适，易于实现，工业化前景良好。 SAM 是胞内产物，需要使用化学试剂将其释放到胞外。萃取液中仍会含有大分子的蛋白质、多糖、核酸等杂质，必须进一步的分离纯化，同其它的氨基酸衍生物一样，通常采用离子交换法提取分离 SAM，也可以通过超滤、凝胶柱层析将 SAM 与大分子杂质分离或者采用选择性沉淀剂，如苦酮酸、苦味酸等对 SAM 进行选择性沉淀。生物体内合成的 S

9、AM 极不稳定，易被降解，大大限制了 SAM 的推广和应用。研究表明， SAM 与多种阴离子化合物混合得到的 SAM 盐可以大大提高 SAM 的稳定性。这是因为阴离子通过静电作用与 SAM 结合，利用其空间位阻限制 SAM 氨基酸链的自由旋转，从而使得 SAM 的稳定性得到提高。目前己有几种稳定的 SAM 盐专利产品获得 FDA 批准。其中，对甲苯磺酸硫酸双盐和1,4-丁烷二磺酸盐己应用在临床中6。2 腺苷蛋氨酸的床应用和药理2.1 SAM 临床应用研究临床研究刚开始时集中在腺苷蛋氨酸抗抑郁的方面，随后逐渐发现其对人体其它的一些疾病也具有治疗作用。2.1.1抑郁症 临床研究中，采用 HaIIl

10、ilton 抑郁量表 (HRSD) 以及其它的抑郁量表对给药前后迟滞抑郁、躯体症状、睡眠、自杀及体重等因子进行评分来评估该药的抗抑郁作用。口服或注射给药第四天，评分值就显著下降，第二周已较起始时下降了52%。SAM 疗效与中、低剂量三环类抗抑郁药相当。而与其它抗抑郁药不同，SAM 抗抑郁作用无剂量相关性，起效快，几乎无不良反应，耐受性好7。临床中还发现，SMA 与标准抗抑郁药，如米安巴林、氯丙咪嗦、丙咪嗦、去甲基咪嗦等联合用药比单独用药起效快。2.1.2肝病人量临床研究证明，腺苷蛋氨酸对各种原因引起的肝功能异常有良好疗效。到目前为止，腺苷蛋氨酸临床研究包括各种原因引起的慢性肝炎、原发胆汁性肝硬

11、化、药物性胆汁淤积、妊娠性胆汁淤积等8。给酒精性肝硬化患者使用腺苷蛋氨酸后，肝脏中谷胱甘肽含量升高，血浆半胱氨酸、甲硫氨酸水平下降，组织切片表明在组织水平有明显改善。腺苷蛋氨酸也对药物性胆汁淤积(如雌激素、扑热息痫等)、妊娠性胆汁淤积、慢性肝病性胆汁淤积有效，患者血清转氨酶、总胆酸、胆汁、胆固醇各指数恢复正常。并可缓解胆汁淤积造成的瘙痒、疲劳等症状。腺苷蛋氨酸可使慢性铅中毒患者临床症状、生化指标明显改善；对Gilberts综合症(一种家庭性胆红素代谢缺陷)亦有一定疗效，用药者非结合胆红素及总胆红素含量降低，尿液中D-葡萄糖二酸含量升高。2.1.3关节炎目前已有多名关节炎患者接受了腺苷蛋氨酸治疗

12、，通常在服药 2 周后症状就得到改善。一荐双盲试验结果表明，腺苷蛋氨酸与酮洛芬疗效相当，两者联合用药能增强和延长酮洛芬的作用。研究还表明，100 mg 的腺苷蛋氨酸与750 mg 萘普生，20 mg 炎痛息康，150 mg 消炎痛，1200 mg 布洛芬作用相当。腺苷蛋氨酸与类固醇类抗炎药相比，既不抑制前列腺素合成，也不会操作胃肠道。2.1.4纤维性肌痛、偏头痛原发纤维性肌痛是一种慢性非关节性风湿病，症状为全身多处疼痛、僵直，通常还伴有抑郁症、疑病症、偏执狂等。肌注腺苷蛋氨酸 (200 mg/d)21天后，患者疼痛感位点数量减少，根据 Hamilton 抑郁量表进行的评分值降低：另一项腺苷蛋氨

13、酸口服临床研究表明，患者服药后疼痛、不良情绪、躯体僵直等症状得到改善。给124位偏头痛患者注射腺苷蛋氨酸 (400 mg/d)30 天后，剧烈头痛患者数量减少，头痛持续时间缩短，止痛药用量降低，患者情绪明显改善。2.1.5 其它应用给阿尔茨海默病患者静注 SAM(200 mg/d)，连续 15 天后，其活动、注意力、情绪显著改善，但认知功能的改善不明显。给癫痫患者静注SAM(200 mg/d) 8-14 天后，患者情绪、警觉性、活动明显改善。研究者认为，SAM的这些作用与其抗抑郁作用密切关联。目前 SAM 在中枢神经系统疾病方面的临床研究还涉及到脑缺血及爱滋病并发症之一的骨髓病等。给朱出现肝硬

14、化的酗酒病人肌注 SAM(200 mg/d)30 天，与对照组相比，给药组血清中-谷氨酰转肽酶 (-GT)、转氨酶含量降低，疲劳、厌食、失眠、焦虑、抑郁等症状得到缓解。研究者认为这可能与SAM 抗肝病、抗抑郁作用有关。近来研究表明，SAM 对肿瘤坏死因子 -a(TNF-a) 的表达与分泌也有抑制作用。TNF-a 是一种多向炎性细胞因子，在肝脏受损的过程中起重要作用。在脂多糖诱导 TNF-a 过量表达的大鼠模型中，SAM 能明显降低血清中TNF-a的含量。进一步研究表明，SAM 能降低 TNF-a 的释放以及稳定态TNF-a mRNA的含量。研究还发现，血浆中同型半胱氨酸的升高是血管疾病的危险信

15、号，且冠状动脉疾病患者血浆腺苷蛋氨酸含量低于正常水平。给健康志愿者口服腺苷蛋氨酸肠溶片以后，受试者血浆5-甲基四氢叶酸 (5-MTHF) 水平升高，5-MTHF 能使同型半胱氨酸重新甲基化生成甲硫氨酸，增强同型半胱氨酸的代谢，可用于预防血管疾病。SAM 使用安全，即使加大剂量也没有危险对孕妇和育婴期妇女尤其安全。是长期服用一些常规抗抑郁药物而无效患者的福音，被亲切地称为“快乐药片”。由于其消炎、止痛和改善情绪的双重作用。对一些长期忍受折磨而具有抑郁症状的慢性病患者，疗效非常显着。2.2药理作用因为腺苷蛋氨酸中间代谢产物多，并且作用可能与受体及受体，效应器偶联系统有关，因而对腺苷蛋氨酸确切的作用

16、机制的研究也是一个热点。2.2.1腺苷蛋氨酸的体内代谢腺苷蛋氨酸作为体内一种主要的甲基供体可向多种分子提供甲基，例如儿茶酚胺和其他生物胺、脂肪酸、神经递质、核酸、多糖、蛋白及膜磷脂等。腺苷蛋氨酸去甲基后生成 S-腺苷同型半胱氨酸，经过转硫途径生成同型半胱氨酸，随后分解代谢生成体内关键的抗氧化及解毒物质一半胱氨酸，再生成另一种关键的抗氧化及解毒物质谷胱甘肽。腺苷蛋氨酸还可以通过脱羧提供氨丙基用于多胺的生物合成。目前己发现至少有35 种不同的甲基转移酶反应需要腺苷蛋氨酸作为甲基供体。在正常生理条件下，去甲基后生成的S-腺苷同型半胱氨酸 (SAH) 迅速代谢生成同型半胱氨酸。同型半胱氨酸积累有利于S

17、-腺苷同型半胱氨酸的形成。SAH 是大多数甲基转移酶的竞争性抑制剂。甲基转移酶流行性腺苷蛋氨酸和SAH 的浓度有关。同型半胱氨酸只能在甲基循环中生成，不能从任何食物来源获得，是腺苷蛋氨酸代谢重要的分支点。同型半胱氨酸作用有：决定SAH水解酶催化反应进行的方向；重新甲基化生成甲硫氨酸；生成胱硫醚，然后生成细胞内重要的抗氧化物-谷胱甘肽等。同型半胧氨酸的浓度受腺苷蛋氨酸浓度影响：腺苷蛋氨酸浓度升高，抑制5,10-甲基四氢叶酸还原酶，激活胱硫醚-合成酶，从而使同型半胱氨酸向甲硫氨酸合成方向进行的代谢硫减少，向转硫途径方向进行的代谢硫增加。由此可看出，腺苷蛋氨酸的代谢受到多重调控，一旦平衡被打破(如腺

18、苷蛋氨酸合成受阻，腺苷蛋氨酸过度代谢等)，就会引起腺苷蛋氨酸及其各种代谢物的变化。因此，可以通过腺苷蛋氨酸替代疗法恢复腺苷蛋氨酸合成、分解代谢的整体平衡，使体内甲基化反应、谷胱甘肽水平等保持正常9。2.2.2 腺苷蛋氨酸的药理腺苷蛋氨酸治疗抑郁症的确切机制还不清楚，但有大量的事实表明，叶酸、维生素 B12 不足将使中枢神经系统内腺苷蛋氨酸含量降低，诱发神经性及精神性疾病。研究者发现，色氨酸羟化酶是儿茶酚胺合成中的限速酶。在体外试验中，色氨酸羟化酶能被腺苷蛋氨酸激活，被 SAH抑制。 Oteno-Losada 等给大鼠腹腔注射腺苷蛋氨酸后，人鼠脑内去甲肾上腺素、多巴胺水平升高，大鼠脑内多巴胺水平

19、下降与抑郁症发病有关，因此认为补给腺苜蛋氨酸能够促进去甲肾上腺素、5-羟色胺、多巴胺等的生成，从而达到治疗抑郁症的目的。腺苷蛋氨酸还可能影响脑内单胺类的重吸收，Fonlupt 等在体外试验中发现，腺苷蛋氨酸能够抑制去甲肾上腺素在神经系统的专一性吸收，这可能也与腺苷蛋氨酸的抗抑郁作用机制有关。现已发现，肝硬化时肝内腺苷蛋氨酸的合成明显下降，这是因为腺苷蛋氨酸合成酶(催化必需氨基酸蛋氨酸向腺苷蛋氨酸转化)的活性显著下降所致。这种代谢障碍使蛋氨酸向腺苷蛋氨酸转化减少，因而削弱了防止胆汁淤积的正常生理过程。结果使肝硬化病人饮食中的蛋氨酸血浆清除率降低，并造成其代谢产物，特别是半胱氨酸，谷胱苷肽和牛磺酸

20、利用度的下降。而且这种代谢障碍还造成高蛋氨酸血症，使发生肝性脑病的危险性增加。有研究证明，人体内蛋氨酸累积可导致其降解产物(如硫醇，甲硫醇)在血液中的浓度升高，而这些降解产物在肝性脑病的发病机理中起着重要作用。由于腺苷蛋氨酸可以克服腺苷蛋氨酸合成酶不足的障碍，应用腺苷蛋氨酸可以使巯基化合物合成增加，但不增加血液循环中蛋氨酸的浓度。因此，给肝硬化病人补充腺苷蛋氨酸可以使那些在肝病时生物利用度降低了的必需化合物恢复其内源性水平。腺苷蛋氨酸抗炎止痛的作用机制尚不清楚，但在研究中发现腺苷蛋氨酸能促进蛋白多糖的合成，而蛋白多糖是关节软骨细胞合成的必需物质10。3食品营养强化剂食品添加剂在食品营养保健和食

21、品加工过程中起着非常重要的作用，许多食品添加剂不但在食品加工以及食品质地结构的形成过程和营养保健功能方而扮演重要角色，而且能在人类一系列疾病的治疗作用中发挥一定的作用，如辅酶-Q10，DHEA，松果体素。S-腺苷蛋氨酸作为一种新型(新兴)的既可作为疾病治疗药物，义可作为食品营养强化剂的物质，一种甲硫氨基酸-蛋氨酸的天然代谢产物，能够协助人体内无数重要功能的正常运行，是无毒、抗衰老的健康产物。一种良好的肝脏营养剂11。可防止酒精、药物和细胞素 (cytokines) 对肝脏的损伤；防止胆汁淤积；预防慢性活动性肝炎以及其他因素而造成的肝损伤。作为食品营养强化剂的腺苷蛋氨酸必须以生物法生产为基础。这

22、也是目前腺苷蛋氨酸的主要工业生产途径。本实验所选清酒酵母菌为野生菌，符合食品安全标准，可以直接食用，而基因工程菌不能食用，必须将 SAM 纯化后才可以使用。 4. S-腺苷甲硫氨酸的分离纯化微生物细胞内的 SAM 主要累积在细胞的液泡中12从细胞中提取纯SAM 可采用以下两个技术路线：采用萃取剂如高氯酸、盐酸、硫酸、乙酸乙酯等将SAM 从细胞中提取出来，然后用其选择性沉淀剂如苦酮酸、尼兰克盐、苦味酸、磷钨盐酸及硼酸等沉淀破胞液中的 SAM，从而将其与其他杂质如核酸、蛋白质等分离13。生物分离的一般工艺流程：发酵液预处理细胞分离(细胞破碎细胞碎片分离)初步纯化高度纯化成品加工。4.1细胞破碎随着

23、80年代初期以后基因重组技术的广泛应用，国内外生物技术发生了质的飞跃，但是生物技术的下游加工过程却很薄弱，一定程度上制约了生物产品的工业化。利用基因重组技术构建的基因工程菌所产的生物制品中有相当一部分是胞内产物，因此必须将细胞壁破碎使产物释放出来，这也为此类产品的分离提纯过程提出了挑战。影响细胞破碎的因素主要是细胞壁的结构和所选用的破碎方法。细胞破碎的方法很多14，有机械法(如珠磨法、高压匀浆法、超声波法)和非机械法(如溶酶法、渗透压冲击、冻融法、干燥法、化学渗透法)。用于释放胞内物质的研究近年引起人们的关注，但国内外有关这方面的研究进展缓慢，有关报道集中在有机溶剂、抗生素、表面活性剂、螯合剂

24、、变性剂等化学试剂进行细胞破碎。4.1.1机械法：高压均浆法适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉等，不适用于高度分枝的微生物。珠磨法利用玻璃小珠与细胞悬液一起快速搅拌，由于研磨作用，使细胞破碎。这两种机械破碎方法处理量大，速度非常快，目前在工业生产上应用最广泛。但在机械法破碎过程中，容易产生大量的热量，使料液温度升高，从而造成生化物质的破坏，特别是在超声波处理时。因此，超声波破碎法主要适用于实验室或小规模的细胞破碎，影响破碎效果的因素主要是频率、液体温度和粘度、处理时间等。4.1.2 非机械法非机械法一般仅适用于小规模应用。渗透压冲击法是将细胞放在高渗溶液中，由于渗透压作用，细胞内水分

25、向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压发生突然变化，胞外的水分迅速渗入胞内，使细胞快速膨胀而破裂。冻结一融化法是将细胞放在低温(-150)，然后在室温中融化，反复多次直至细胞壁破裂。渗透压冲击和冻融法都属于较温和的方法，但破碎作用较弱。化学渗透法采用化学试剂处理细胞，溶解细胞或抽提细胞组分。干燥法经干燥后的菌体，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来，主要方法有空气干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等。干燥法属于较激烈的一种破碎方法，容易引起蛋白质或其它组分变性。溶酶法利用

26、酶(溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、透明质酸酶等)反应分解破坏细胞壁上特殊的键，以达破壁的目的，此方法需与其它方法配合使用(辐射、渗透压冲击、反复冻融法等)。适宜的细胞破碎条件应该从高的产物释放率、低的能耗和便于后续提取这三方面进行权衡。4.2离子交换树脂法分离纯化离子交换树脂是一类带有活性功能基，能通过所带的可交换离子与溶剂(水、有有机溶剂、气体)中的其他离子进行交换或吸附的小颗粒状物质15。离子交换法被广泛应用于物质的分离，主要对象为带有电荷、离子形式的物质。二十世纪六十年代，离子交换材料取得重要突破，各种离子交换材料相继出现并逐步发展，如大孔交联聚苯乙烯离子交换树脂、热再生树脂和螯合树脂

27、等新型材料，为离子交换法的应用开辟了广阔前景。二十世纪末，离子交换法第一次应用于生物物质的分离，从蛋白质水解液中分离氨基酸。近年来，随着生命科学的发展，离子交换法分离的对象也由简单的金属离子、小分子化合物扩展到大分子以及各种普遍的生物物质。离子交换材料的合成和离子交换法的应用技术互相推动，迅速在工业、冶金、环保、生物、医药、食品等许多领域取得了巨大成功。离子交换树脂是三元网状结构的高分子聚合物，由三部分组成：不溶性的三维空间网络骨架，连接在骨架上的功能基团和功能基团所带的相反电荷的可交换离子。按交联聚合物的不同品种，离子交换树脂可分为苯乙烯系、脲醛系、氯乙烯系等；按树脂形态的不同可分为凝胶型和

28、大孔型两种；另外，根据离子交换树脂所含官能团的性质又可分为强酸、弱酸、强碱、弱碱、螯合、酸碱两性和氧化还原型等七类：按用途还可分为水处理用树脂、药用树脂、催化用树脂、脱色用树脂、分析用树脂以及核子级树脂等15-16。当树脂处在溶液中时，可交换离子在树脂的骨架中进进出出，与溶液中的同性离子发生交换过程。离子交换过程可以看作是可逆多相化学反应。一般来说包括三个步骤：外部扩散、内部扩散、化学交换。影响离子交换树脂交换选择性的因素取决于：1、树脂本性；2、pH，弱酸型在较高的pH时交换容量大，弱碱型在较低的pH下交换容量大；3、活性基团中固定离子对交换活动离子的亲和力，价态高易交换；4、同族中随原子序

29、数增大而被交换。另外还有其他规律，如当离子交换剂的交换容量增大，或结构中架桥横键数量增大，则选择性增大；液温升高、浓度高，则选择性下降；亲和力大的，平衡交换容量亦大17。离子交换树脂主要用于水处理工艺，包括水的软化及脱盐18。同时也是食品和发酵工业用于产物提纯、分离、浓缩、催化的良好材料。在食品工业中，除制取专用给水、处理废水外，还可以用于糖、酒、奶、油脂、饮料的去盐、脱色、分离、提纯、催化等方面19。文献中一般利用选择性沉淀剂如苦酮酸、Reinack 盐、苦味酸、磷钨酸盐等沉淀SAM，与其他杂质如核酸、蛋白类等分离20，工艺中有机溶剂的用量较大21。SAM 除具有一个带正电荷的硫外，还有三个

30、可离子化的基团：pKa分别为1.8、7.8 的氨基酸链上的羧基和氨基，pKa 为3.4的嘌呤上的氨基。SAM 在酸性条件下带正电荷，能和阳离子交换树脂进行离子交换。因此，通过离子交换法，可与杂质分开22。第二部分 课程设计部分 酿酒酵母发酵液中SAM分离纯化工艺的研究 S-腺苷蛋氨酸简称 SAM，是生物体内重要的代谢中间物质。SAM 是人体内重要的生理活性物质，参与了人体内各种代谢及关键生化反应。SAM 通过转甲基、转硫基、转氨丙基等生理作用参加人体内的代谢，是维持人体正常代谢和健康必不可少的重要生命物质。 SAM 对肝病、抑郁症、痴呆症、关节炎和空泡脊髓炎等疾病有显著的治疗作用，还是预防癌症

31、，心血管疾病和抗衰老的高级保健药物，而且SAM没有副作用非常的安全。SAM 还可以用来配置一些保健品，是一些食品的加强剂。它的应用非常的广泛。 之前人们对SAM 的分离纯化研究已经进行了很多，不同方法有各自的优点，但也有许多不足，人们也正对这些不足进行改进，以期发现更好的提取方法对提取工艺进行优化，以提高SAM 的提取率及提取纯度。为使SAM的纯度和提取效率更高，本实验对细胞的破碎，离子交换法的工艺条件和洗脱条件做了进一步的研究。此外，本实验将所有的提取方法进行综述，并对其提取率进行比较，得出各方法的优劣。为SAM 的工业提取纯化提供一定的数据和理论基础。1.材料1.1 实验原料甲苯磺酸 分析

32、纯 西陇化工股份有限公司柠檬酸 分析纯 西陇化工股份有限公司甲酸 分析纯 西陇化工股份有限公司乙酸乙酯 分析纯 西陇化工股份有限公司硫酸 分析纯 西陇化工股份有限公司雷氏盐 分析纯 西陇化工股份有限公司JK110树脂 华东理工大学上海华震科技贸易公司1.2 实验仪器 仪器名称 生产厂家centrifuge 5415D 小型高速离心机德国 EppendorfCo.,Ltd KQ5200DE 型数显超声波清洗器昆山市超市一起有限公司WCJ-802 磁力搅拌器常州国华电器有限公司FE20/EL20 型 pH 计梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司waters 2695 高效液相色谱仪美国 Waters

33、 Co.,LtdBC/BD-318A 海尔冰柜青岛海尔特种电冰柜有限公司Thermo scientific 层析柜 Thermo Fisher Scientific Inc. TDL-40B 台式离心机 上海安亭科学仪器厂PC2000 HPLCSSI Hamiton公司HYG -IIa回旋式恒温调速摇瓶柜 上海欣蕊自动化设备有限公司制GradiFrac System 层析系统Amersham Pharmaxia Biotech层析柱F55X680mm、F35X400mm 上海锦华层析设备厂 2实验方法2.1酵母细胞中抽提SAM2.1.1酸法 酵母细胞培养结束后，5000 RPM，4，离心20

34、min，收获菌体。按每克菌体加入0.24 mL 50%乙酸乙酷水溶液,剧烈搅拌处理30 min，然后加入0.56 mL，0.35 mol/LH2SO4；处理1.5 小时。5000 RPM，离心30 min，去除细胞碎片，得到含有SAM 的料液。2.1.2有机溶剂法 1 mL 发酵液 3500 r/min 离心 15 min，弃上清。加入 1.4 mL 乙酸乙酯及 0.5mL 蒸馏水，4破壁 2 h。取 1 mL 至 1.5 mL 离心管 13000 r/min 离心 15 min，HPLC进样测定 SAM 浓度。 2.1.3超声波法 1 mL 发酵液 3500 r/min 离心 15 min，

35、弃上清。沉淀用柠檬酸缓冲液重悬后置于冰浴中，在功率 700 W 下超声破碎 15 分钟。取 1 mL 至 1.5 mL 离心管 13000 r/min离心 15 min，HPLC 进样测定 SAM 浓度。2.1.4 pH 反复冻融法 1 mL 发酵液 3500 r/min 离心 15 min，弃上清，去离子水洗涤三次。用 2 mL pH 3.0 柠檬酸缓冲液重悬沉淀。将重悬后液体于-20反复冻融 3 次。取 1 mL 至1.5 mL 离心管 13000 r/min 离心 15 min，HPLC 进样测定 SAM 浓度。2. 1.5雷氏盐沉淀分离SAM 培养的酵母经破碎后，离心去掉细胞残余物，在

36、上清液中加入 2 倍体积含质量分数1%雷氏盐的3%过氯酸溶液，得微晶体沉淀，4过夜，过滤 ，用冷的雷氏盐(量分数0. 5%)水溶液洗 2 次，干燥后溶于适量的甲乙酮溶液中，离心后在上清液中加入一定浓度、适量的硫酸或对甲苯磺酸溶液对SAM进行萃取，低压冻干即得 SAM 粗品。此粗品可以经离子交换树脂进一步分离纯化。2.2 SAM在JKll0树脂上的静态交换容量的测定配置 pH 为5.0，浓度分别为2.61，3.68，4.98及8.92 g/L的SAM料液各l0 ml，将其加入到2 g 抽干水份的JKll0 树脂中，静态吸附8h后，由公式计算树脂的静态交换容量。在pH5.0 的条件下，2.61，3

37、.65，4.98及8.92 g/L的 SAM 料液在 JKl10 树脂上的静态交换容量分别为5.98，69.5，79.5及98.5 mg/g 湿树脂，由此能够大致预测 SAM 在填装 JKl10 树脂的离子交换柱中的交换过程。式中，q：树脂静态交换容量(mg/g湿树脂)；C0：溶液中产物的初始浓度(mg/ml）；c：平衡时溶液目标产物浓度(mg/ml)；u：溶液体积(ml)；w：湿树脂重量(g)。2.3动态离子交换实验定义当流出液中的SAM的浓度达到进料液样品浓度的10%时为穿透点。SAM料液上柱的同时收集流出液，每隔一定时间收集一管，HPCL测定其中SAM浓度，记C。树脂吸附容量q按照公式计

38、算：其中q：湿树脂的交换容量(mg/g湿树脂)；C0：料液中SAM的初始浓度(g/L)；u：所用sAM料液的体积流速(ml/min)；w：湿树脂的质量(g)。2.4SAM在JKl10树脂上的交换最佳条件测定实验研究了料液流速、浓度、pH对树脂饱和交换容量、穿透容量、离子交换速率的影响，得出了SAM在JKl10树脂上最佳吸附条件。2.4.1最佳流速的测定在C0=4.98 g/l，pH=5 的条件下，溶液分别以 1 VB/h、2 VB/h、3 VB/h、4 VB/h 流速加入到树脂柱中进行层析分离。2.4.2 SAM最佳浓度的测定在流速2 BV/h，pH 5.0 的条件下，将浓度分别为2.61、4

39、.98、8.96 g/l的SAM 溶液分别加入到 JK 110 树脂的层析柱中进行层析分离。2.4.3 pH测定在SAM料液浓度为4.98 g/L，流速为2 BV/ h 的条件下，pH 值分别为3.0、5.0、7.0 的SAM 料液加入到 JK 110 树脂柱中进行层析分离。2.5 最佳脱洗条件的测定层析分离后的树脂柱子，用5 BV 蒸馏水冲洗柱子，在脱洗速度为1 BV/h的条件下，分别用 0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.2 mol/L 浓度的 H2SO4 柱子进行洗脱。层析分离后的树脂柱子，用 5BV 蒸馏水冲洗柱子，在 H2SO4 浓度为0.1mol/L 的条件下，用1 BV

40、/h、2 BV/h 、3 BV/h的流速的 H2SO4 对柱子进行洗脱。洗脱效率的计算，SAM 上柱时，收集柱底流出液，测其体积与SAM 浓度，分别记为巧V1、C1；洗脱前，先用5BV 蒸馏水冲洗柱子，以除去树脂间残留的 SAM 料液，收集流出液，测其体积与SAM 浓度，分别记为V2、C2；在洗脱过程中，收集流出产物，测其体积与 SAM 浓度，分别记为V3、C3。按照公式计算洗脱效率。3设计3.1酵母不同破碎方法对SAM释放率的影响 酵母细胞的破碎方法很多，本实验选用酸细胞破碎法、超声波法、有机溶剂剂法、pH 反复冻融法和雷氏盐沉淀分离SAM。成熟的酵母菌细胞壁较坚厚，为提高破碎效率，在使用各

41、种方法进行实验前，选用相应量的乙酸乙酯对酵母菌进行45 min处理；在考察酵母不同破碎方法对SAM 释放率的影响时，SAM释放率以1.5 moL /L的高氯酸破壁处理1.5 h 的释放率为100% 作为对照。3.2 JK110树脂层析的最佳条件的测定实验研究了料液流速、浓度、pH对树脂饱和交换容量、穿透容量、离子交换速率的影响，得出了SAM 在 JK l10 树脂上最佳吸附条件。在C0=4.98 g/l，pH=5 的条件下，用不同流速的 SAM 溶液进行层析分离，制出流速对穿透曲线和离子交换速率的影响的坐标图，根据2.2的方法测定树脂的交换容量，根据不同流速时树脂的饱和时间、穿透容量、饱和交换

42、容量的相关数据确定最佳流速。在流速2 BV/h，pH5.0 的条件下，将浓度分别为2.61、4.98、8.96 g/l的SAM 溶液分别加入到 JK110 树脂的层析柱中进行层析分离。绘制出浓度对穿透曲线和离子交换速率的影响坐标图，根据2.2的方法测定树脂的交换容量，根据不同浓度时树脂的饱和时间、穿透容量、饱和交换容量的相关数据确定SAM的最佳浓度。在SAM料液浓度为4.98 g/L，流速为2 BV/h的条件下，pH值分别为3.0、5.0、7.0的 SAM 料液加入到 JK110 树脂柱中进行层析分离。绘制出pH对穿透曲线和离子交换速率的影响坐标图，根据2.2的方法测定树脂的交换容量，根据不同

43、浓度时树脂的饱和时间、穿透容量、饱和交换容量的相关数据确定SAM的最佳pH。3.3 JK110树脂层析脱洗的最佳条件的测定层析分离后的树脂柱子，用5 BV蒸馏水冲洗柱子，在脱洗速度为1 BV/h的条件下，分别用不同浓度的H2SO4 对 柱子进行洗脱。绘制出 H2SO4 浓度对脱洗曲线影响坐标图，根据不同浓度时洗脱体积和洗脱效率确定最佳H2SO4 浓度。层析分离后的树脂柱子，用5 BV 蒸馏水冲洗柱子，在 H2SO4 浓度为0.1 mol/L的条件下，用不同流速的H2SO4对柱子进行洗脱。绘制出 H2SO4 流速对脱洗曲线影响坐标图，根据不同流速时洗脱体积和洗脱效率确定最佳H2SO4 浓度。4分

44、析与展望4.1酵母不同破碎方法对SAM释放率的影响硫酸破壁可以使90%以上的 SAM 从酵母内释放出来，对其它的干扰物质释放量少，而且能较好地保持 SAM 的稳定性，有利于 SAM 的分离和纯化。超声波破碎法最佳破碎频率为24 Hz，最佳时间13 min，SAM 释放率为65%左右。超声波破碎时产生热，会影响 SAM 的稳定性,所以SAM 的释放率随着频率和时间的增大开始也增大，然后由于产生了较多的热而使部分SAM 分解，相当于降低了SAM 释放率。4.2JK110树脂层析的最佳条件随着流速的增加，穿透时间提前，穿透容量减小。这主要是因为流速增加时，料液中的 SAM 没有足够的时间与树脂达到离

45、子交换平衡。流速对饱和交换容量影响不明显，但随着流速的增加，树脂达到饱和所需时间明显缩短。考虑到树脂利用率、穿透容量以及SMA的稳定性(尽可能的缩短操作时间)，2 BV/h是合适的操作流速。当进料浓度增加时，穿透时间明显提前,树脂的饱和交换容量增大这主要是因为 SAM 浓度增加时，料液中的 SAM 没有足够的时间与树脂达到离子交换平衡。而且,流出曲线的形状变陡，交换速率增大。这主要是因为进样浓度增加，使得料液与树脂相中 SAM 浓度差增大，传质推动力变大，加快了离子交换过程的进行。要得到高浓度的SAM 料液，就必须在操作前期，对SAM 料液进行旋转蒸发浓缩，而在此过程中，较高的温度对SAM 的

46、稳定性十分不利，会造成一定损失，认为4.98 g/L的SAM 料液浓度是比较合适的。pH从3.0增加到5.0时，树脂的穿透时间推迟，穿透容量和饱和交换容量增大。这是因为，一方面在pH 3.0 时JK1l0树脂的解离度很低，与SAM发生离子交换反应效率很低；另一方面溶液中SAM 的离子价态随着 pH的升高而降低。pH值从5.0到7.0时，穿透时间提前，树脂穿透容量下降。所以认为 pH 为5.0是为最适。4.3 JK110树脂洗脱的最佳条件SAM 料液达到饱和状态后，考虑到 SAM 的稳定性，我们选择H2SO4溶液作为洗脱剂。H2SO4浓度对洗脱曲线影响很大，随着浓度的提高,洗脱峰变得更加集中，洗

47、脱液体积减少，峰高变大，流速对SAM的洗脱效果几乎没有影响。洗脱的最佳H2SO4浓度0.1 mol/L，流速为2 VB/h.5总结体会通过本次课程设计，让我对SAM的作用有了以定的了解，了解了它的新陈代谢过程和它对人体的重要性，了解到了一些重要的分离纯化的分离过程，对分离纯化的方法如机械法细胞破碎、非机械法细胞破碎、离子交换层析等方法进行了进一步的探究和了解。在设计过程中我遇到了几个难题，起初我对分离纯化的认识不是太全面，后来随着参考资料的进一步阅读和理解，还有和同学的讨论，最终提出和完成了自己的设计方案，此外在设计过程中和设计方案的书写过程中也遇到了问题，在什么是方法什么是设计，方法和设计之

48、间有什么区别，该如何书写方法和设计，这一问题让我很伤脑筋，最终通过和同学的讨论决定用本设计的书写方式。在书写论文的时候在排版格式和内容上和老师所给模板有所出入，经过再三的修订最终定稿。这门课程马上要接近尾声了，看着自己这些天通过奋斗设计的成果，在欣慰的同时也认识到自己的不足。这门课程设计对我来说是一次学习和提高的经历，他将会激励我今后更加努力得学习和丰富自己。在此次学习课程中，我将以往那些学到的专业知识得意加强和综合，更有助于我们下一步的学习。同时使自己在专业知识以及联系实际的理论方面都有所提高，以前课本上的知识是理论，没有机会结合并运用于实践中，借着这次课程设计，将一些理论与实际联系起来进行

49、了一定的结合，虽没真正实践，但也比之前有了更多经验，对这些知识有了更深刻的理解。这次课程设计不仅提高了我的专业知识，提高自己的思维动手能力，同时也提高了我的计算机水平。这次课设对我来说是一个非常难得的学习机会。对此我非常感谢学校给我们开设了这门课程和张晓宇老师对我们的悉心指导，晓宇老师严谨细致、一丝不苟的作风一直是我工作、学习中的榜样；感谢晓宇老师对我们的指导与批评，使我们在课程设计过程中学到更多东西，让我受益匪浅。也感谢我的同学在我设计过程中给予的帮助和支持，在此对他们表达我真挚的谢意！参考文献1 CantoniGL.The nature of the active methyl donor formed enzymatically from L-methionine and adenosine triphosphateJ. J Am C