超声-酶-碱法提取啤酒废酵母-葡聚糖的研究

1、超声-酶-碱法提取啤酒废酵母3 -1,3-葡聚糖的研究 摘 要： 采用超声 -酶-碱法从啤酒废酵母中提取 3 -1,3- 葡聚糖，在超声波预处理和酶解最 佳条件的同时，利用 响应曲面法研究分析 NaOH 浓度、温度、用量和时间对 3 -1,3- 葡聚糖得率、纯度和蛋白质 含量的影响。试验结果表 明，超声波处理后破壁率为 94.22 %；酶解后蛋白质去除率为62.82 %；当加入 2.05 %的 NaOH 30.50 mL , 74 C处理 5.7 h ， 3 -1,3- 葡聚糖的得率为 10.21 % ，纯度为 88.14 % ，蛋白质含量为 1.19 % 。超声- 酶-碱法处理工艺具有3 -

2、1,3- 葡聚糖得率、纯度高、蛋白质含量低及提取时间短的特点。 响应曲面法 关键词： 综合利用； 超声-酶-碱法； 啤酒废酵母； 3 -1,3- 葡聚糖； Resarch on the Extraction of3 -1,3-glucan from Waste Beer Barm by Ultrasonic-enzyme-alkali Method beer barm by Abstract:3 -1,3-glucan was extracted from waste effects of NaOH ultrasonic-enzyme-alkali method. In addition to

3、 the research on the optimum conditions of ultrasound pretreatment and zymolysis, the concentration, temperature, use level and reaction time on the yield, the purity and protein content of3 -1,3-glucan were studied by response surface method. The results showed that the broken rate of barm cells by

4、 ultrasound was 94.22 %, the removal rate of protein after zymolysis was 62.82 %, when 30.50 mL 2.05 % NaOH was added for 5.7 h treatment at 74 C, the yield of 3 -1,3-glucan was 10.21 %, the purity was 88.14 %and protein content was 1.19 %. The ultrasonic-enzyme-alkali method had the advantages incl

5、uding high3-1,3-glucan yield and high purity, low protein content as well as short extracition time. Key words: comprehensive utilization; ultrasonic-enzyme-alkali method; waste beer barm; 3 -1,3-glucan; response surface method 酵母 3 -1,3- 葡聚糖是一种良好的生物效应调节剂 BRMS， 在增强机体抗辐射和促进伤口愈合等方面有 显著作用 1 。 酵母 3 -1,3

6、- 葡聚糖除因不溶性使其在抗肿 瘤等临床应用上受到限制外，抗氧化、保湿、无刺激和免 疫调节等特点，使其在食品、化妆品和医学方面有广泛 应用 2 3 。 据统计， 2007 年中国啤酒产量为 3931.4 万 t ， 产生废酵母约 58.97 万 t （干重），而 3 -1,3- 葡聚糖含量 达到酵母细胞壁的 29 % ，开发潜力巨大。 目前，提取 3 - 1,3- 葡聚糖的方法主要有酸 -碱法、酶 -碱法和自溶 -酶- 碱法 4 5 。 其中，酸 - 碱法对环境污染严重，酶 - 碱法试剂 用量较大，而自溶 -酶-碱法虽能得到得率和纯度较高的 3 -1,3- 葡聚糖，但提取时间过长。 本文主要研

7、究的是超声 -酶-碱法提取啤酒废酵母 3 -1,3- 葡聚糖工艺，即在常规的酶 -碱法之前，对酵母进 行了超声波预处理，使细胞壁松散、破碎，增大溶剂作用 面积，以缩短提取时间和提高提取率。 首先对超声波破 壁和酶解除蛋白效果进行研究，再采用响应曲面法优化 碱溶条件（NaOH浓度、温度、用量和时间），建立碱溶与 3 -1,3- 葡聚糖之间的数学模型，以期获得最优的工艺参 数，为啤酒废酵母综合利用提供理论数据。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 实验材料：新鲜啤酒废酵母（广西南宁 限公司提供） ；木瓜蛋白酶（食品级） （分析纯）。 实验仪器：丹麦 FOSS 自动定氮仪； 青岛啤酒有 ;NaOH无

8、水乙醇等 美国贝克曼超 速离心机；日本岛津 UV-2051PC 紫外可见分光光度计； 96 真空冷冻干燥机。 1.2 提取 3 -1,3- 葡聚糖工艺流程 啤酒废酵母7预处理7超声波处理7酶解7碱溶7醇洗、水 洗7真空冷冻干燥7 1.3 工艺要点 1.3.1 预处理 新鲜啤酒废酵母置于 （上清液）后过 200 3 -1,3-葡聚糖 0 C冷水中絮凝， 回收啤酒 目标准筛，制得水分含量为 20 % 25 %的净酵母，40 C烘箱鼓风干燥后磨粉，待用。 1.3.2 超声波处理 取干酵母 5 g ，加入 15 mL 水，在功率为 140 W 、频 率为 42 kHz 的条件下，处理 1080 min

9、 ，再加入同体积 的无水乙醇于 70 C恒温提取，离心后测定上清液海藻 糖和蛋白质含量。 1.3.3 酶解 取破壁后的酵母残渣 5 g ，先加入 50 mL 水，再添加 208 u/g 底物的木瓜蛋白酶，于50 C、pH6.0条件下酶解 8 h ，离心后测定沉淀蛋白质含量。 1.4 碱溶响应曲面优化试验 采用 Box-Behnken 设计，选取 NaOH 浓度（ x 1 用量（ x 3 )和时间( x 4 ) 4 个因素为自变量，以 3 - 葡 聚糖的纯度( Y 1 i )、 2 ) 3 ) 蛋白质含量 ( Y 和得率 ( Y 为响应 值。按照方程 x i =(X i -X o )/ X对自变

10、量进行编码。式中, x i 为自变量的编码值， i 为自变量的真实值， 0 为试验 中心点处自变量的真实值， X为变量的变化步长。 1。 验因素的水平编码见表 设该模型通过最小二乘法拟合的二次多项方程为： Y=3 + 4 i = 1 4 i=1,j Mi 2X 2 3 ii X 2 ij 其中： 3 为常数项， 3 i 为线性系数， 3 ij 为交叉项系数， 3 ii 为二 次项系数。 1.5 分析方法 用 FOSS 自动定氮仪测定蛋白质含量，蒽酮- 硫酸 法测定多糖含量 6 。 得率 = 成品质量 原料质量 X 100 % 纯度 = 多糖质量 成品质量 X 100 % 2 结果与分析 2.1

11、 超声波处理 超声波主要通过空化效应， 使液体中产生空化泡， 空化泡长到一定程度或强烈震荡将发生崩溃，会在局部 小区域内产生高温高压， 形成微射流及高速剪切力，使 细胞壁破裂，内容物泻出。 海藻糖和蛋白质作为细胞内 主要内容物，能用来评价超声波破壁的效果。 试验结果 见图 1 。 由图 1 可知，海藻糖提取率和蛋白质含量随着超声 辅助提取时间的加长而迅速上升， 到 60 min 后达到稳 定， 海藻糖最大提取率和蛋白质含量分别达到 94.22 % 和 5.27 % ，说明超声波处理达到了破壁的目的。 2.2 酶解试验 蛋白酶能够去除酵母残渣中大量的蛋白质，为后续 提纯分离 3 -1,3- 葡聚

12、糖奠定基础；同时，可以回收营养 丰富的氨基酸、多肽蛋白液，提高酵母综合利用水平。 研 究表明，取破壁后的酵母残渣 5 g ，加入 50 mL 水，添加 208 u/g 底物的木瓜蛋白酶，在50 C、pH6.0条件下酶解 8 h ，蛋白质去除率达到最大值 62.82 % ，且回收到 0.348 g/L 的蛋白液。 2.3 碱溶响应曲面优化试验 2.3.1 试验结果 影响3 -1,3-葡聚糖品质的指标有纯度、蛋白质含量 和得率，结果见表 2 。 从表2可以知道，纯度的变化范围为 60.27 % 90.40 %，蛋白质含量变化范围为1.15 %2.99 %，得率 变化范围为 8.98 % 12.10

13、 %， 其中纯度变化趋势较明 显。 2.3.2 方差分析 用统计软件 SAS9.1.3 对表 2 中的数据进行方差分 析，结果见表 3表 6。 回归参数方差分析和回归模型误 差分析主要用来判断所得方程是否能预测相关指标走 向，并分析各因素对目标指标的影响。 由表 3 表 4 可知， Y 1 ，Y 2 和 Y 3 回归方程的一次 项、 Y 1 的二次项以及失拟项显著性检验都是极其显著的 (PV 0.01 )。Y 2 的二次项是显著的(0.01 0.05 )。Y 1 合系 的模型检验极显著， 拟 ；Y 0.9347 2 为 模型 2 的 2 为 1 0 1 NaOH (%) x 1 1.5 2 2

14、.5 60 70 80 NaOH (mL) x 30 45 60 （h） x 4 X 4 5 6 7 图 1 超声波处理时间对酵母破壁的影响 马 森，卢家炯，高俊永，初兰娜，杜林繁超声-酶-碱法提取啤酒废酵母3 -1,3-葡聚糖的 研究 97 酿酒科技 2009 年第 2 期（总第 176 期）-LIQUOR- MAKING SCIENCE当浓度为2.02 %、温度为 88.87 C、用量 为 102.27 mL 和时间为 9.41 h 时，蛋白质理论含量最小 值为 0.72 % 。 因此，为了得到高纯度、低蛋白质含量、合 适的得率以及节约试剂和便于控制等问题，选取浓度为 2.05 %、温度为

15、 74 C、用量为 30.50 mL 和时间为5.7 h 进行分析是合适的。 此时，实际测定 3 次，得纯度平均值 为 88.14 % ，于预测值相比，相对偏差为 1.04 % ;蛋白质 含量为 1.19 % ，得率为 10.21 % 。 3 -1,3- 葡聚糖的工 响应曲面分析法研究 3 -1,3- 葡聚糖的影响， 通 3 结论 提出了超声 -酶-碱法提取酵母 艺。 采用 Box-Behnken 设计， NaOH浓度、温度、用量和时间对 底物的木瓜蛋白酶，在 蛋白质去除率达到最大值 浓度为 2.05 % 的 NaOH， 葡聚糖的得率为 10.21 % 50 C、 74 C ，纯度 1.19

16、% 。 该方法工艺简单，耗 3 - 并建立了纯度和蛋白质含量的二次多项式回归模型。 过相关方差分析证明模型是合理可靠的，能够较好地预 测啤酒酵母 3 -1,3- 葡聚糖的评价指标。得到最优工艺条 件为：功率为 140 W 的超声波处理 60 min 后，破壁率达 到 94.22 % ;添加 208 u/g pH6.0 的条件下酶解 8 h ， 62.82 % ; 加入 30.50 mL 处理 5.7 h ，最终 3 -1,3- 为 88.14 % ，蛋白质含量为 时短，成品得率、纯度较高，且蛋白质含量低，是提取 1,3- 葡聚糖的理想方法。 参考文献： 1 Kogan G. (13,16) -

17、 3 -D-glucans of yeasts and fungi and their bilolgical activityJ.Studies in Natural Prodiucts Chemistry,2000,23 ：107-152. 2 Volman J J,Ramakers J D, Plat J. Dietary modulation of immune function by 3 -glucansJ.Physiology and Behavior, 2008,94(2) ：276-284. 3 Santipanichwong R,Suphantharika M,Carotenoids as colorants in reduced-fat mayonnaise containing spent brewers yeast 3 -glucan as a fat replacerJ.Food Hydrocolloids,2007,21(4) 565-574. 4 Byron A