琼脂糖凝胶电泳

1、实验目的：实验目的：学习和掌握琼脂糖凝胶电泳的学习和掌握琼脂糖凝胶电泳的原理原理和和基本操作基本操作。实验原理：实验原理：1.琼脂糖凝胶电泳是琼脂糖凝胶电泳是最常用最常用的鉴定的鉴定DNA的方法，的方法，它简便易行，只需少量它简便易行，只需少量DNA。2.琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的脂糖的浓度浓度。3.DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷电荷效应效应与与分子筛效应分子筛效应。DNA分子的迁移速率与分子的迁移速率与其相对分子质量的对数

2、成反比。其相对分子质量的对数成反比。4.观察琼脂糖凝胶中观察琼脂糖凝胶中DNA的最简便方法是利用的最简便方法是利用荧光染料荧光染料溴乙锭（溴乙锭（EB）染色，）染色，EB在在紫外紫外灯照灯照射下，发射下，发红色红色荧光。荧光。实验器材：实验器材：移液器移液器水平电泳槽水平电泳槽一次性手套一次性手套微波炉微波炉紫外检测仪紫外检测仪水平仪水平仪tip量筒量筒锥形瓶锥形瓶实验器材：实验器材：实验试剂：实验试剂：1.pH8.0 TAE缓冲液缓冲液2.凝胶上样缓冲液：凝胶上样缓冲液：0.2%溴酚蓝，溴酚蓝，50%蔗糖蔗糖3.琼脂糖琼脂糖4.1mg/ml EB溶液溶液5.Marker6.PCR扩增特异扩增

3、特异DNA片段片段操作：操作：1.琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备称取称取0.45g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30ml TAE缓冲液，保鲜膜封口，置微波炉加热至完全澄清透缓冲液，保鲜膜封口，置微波炉加热至完全澄清透明取出摇匀，琼脂糖的浓度为明取出摇匀，琼脂糖的浓度为1.5%。待琼脂糖凝。待琼脂糖凝胶溶液冷却至胶溶液冷却至50，再加入，再加入1.5ml溴乙锭，使其终溴乙锭，使其终浓度为浓度为0.5微克微克/毫升。毫升。2.凝胶板的制备凝胶板的制备用制胶器将紫外透光凝胶盘固定好，采用水平用制胶器将紫外透光凝胶盘固定好，采用水平仪调整平衡使凝胶盘位于同一水平面。仪调整平衡使

4、凝胶盘位于同一水平面。将适宜的梳子垂直架在凝胶盘内槽的一端，使将适宜的梳子垂直架在凝胶盘内槽的一端，使梳齿距玻璃板之间尚有梳齿距玻璃板之间尚有0.5-1mm的距离。的距离。将冷到将冷到50左右的琼脂糖凝胶，缓缓倒入凝胶左右的琼脂糖凝胶，缓缓倒入凝胶盘内槽，厚度适宜（盘内槽，厚度适宜（注意不要有气泡注意不要有气泡）。）。3.点样点样待凝胶凝固后，小心取出梳齿，将凝胶盘放入待凝胶凝固后，小心取出梳齿，将凝胶盘放入电泳槽內。加入足够的电泳槽內。加入足够的TAE电泳缓冲液，使液电泳缓冲液，使液面略高出凝胶面。面略高出凝胶面。取取5微升微升PCR扩增产物，向其中加入扩增产物，向其中加入1微升的上微升的上

5、样缓冲液，混匀后用移液器将其加入加样孔，样缓冲液，混匀后用移液器将其加入加样孔，记录样品点样次序与点样量。记录样品点样次序与点样量。4.电泳电泳接通电泳槽与电泳仪的电源，调节电压接通电泳槽与电泳仪的电源，调节电压90V,当当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止处，停止电泳。电泳。5.观察观察在紫外灯下观察凝胶，有在紫外灯下观察凝胶，有DNA处应显出橘红色处应显出橘红色荧光条带。记录电泳结果。荧光条带。记录电泳结果。注意事项：注意事项：1. 倒胶时把握好胶的温度，不要高于倒胶时把握好胶的温度，不要高于60 ，否，否则温度太高会使凝胶盘变形。则温度太高会使凝胶盘变

6、形。2. 胶一定胶一定要凝固好才能拔梳子要凝固好才能拔梳子，方向一定要，方向一定要竖直竖直向上向上，不要弄坏点样孔。，不要弄坏点样孔。3.点样时枪头下伸，点样孔内点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡不能有气泡。4.EB有毒有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔，紫外线照射不宜太久。勿乱扔，紫外线照射不宜太久。作业：作业：画出电泳图，分析观察到的结果。画出电泳图，分析观察到的结果。4.观察琼脂糖凝胶中观察琼脂糖凝胶中DNA的最简便方法是利用的最简便方法是利用荧光染料荧光染料溴乙锭（溴乙锭（EB）染色，）染色，EB在在紫外紫外灯照灯照射下，发射下，发红色红色荧光。荧光。