微生物的分离、纯化、培养与初步生化鉴定

1、微生物的分离、纯化、培养与初步生化鉴定 摘要 此次实验主要是对微生物进行分离，纯化，培养与初步生化鉴定。通过实验了解培养基的配制及干湿灭菌的原理、方法。用简单单细胞挑取法和平板分离法分离纯化微生物，对其进行形态特征的观察并掌握平板菌落计数法的原理和方法。了解不同微生物对各种有机大分子的水解能力，不同微生物有不同的酶系统，掌握大分子实验在微生物鉴别中的作用，掌握糖发酵、IMVIC的原理、方法和在肠道细菌鉴定中的作用。关键词 培养基 灭菌 分离与纯化 鉴定 IMVIC前言 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养物质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。不同微生物选

2、用不同培养基，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、无机盐、生长因子等。 干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必须从中进行分离。分离纯化方法很多，基本原理相似，即将待分离样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落，常用方法有简单单细胞挑取法，平板分离法。微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。接种的关键是要严格的进行无菌操作

3、。 微生物的培养特征是指微生物在固体培养基、半固体和液体培养基中生长后所表现的群体形态特征。不同的微生物具有不同的培养特征，固体培养基又分为平板和斜面两种。不同来源的样品接种于平板培养基上，在适宜温度下培养，1-2d内会形成菌落。每一种细菌所形成的菌落有它自己的特点，如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。可通过平板培养来检测不同的材料中微生物的数量和类型。 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释后接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖形成肉眼可见的菌落，一个菌落应代表原样品中的一个单细胞，统计菌落数，根据

4、其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。 各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所能发酵的类型和最终产物也不一样。不同细菌对营养的要求不同也说明了它们有不同的合成能力。所有这些都反映了它们是有不同的酶系统， 有些细菌能分泌脂肪酶，有些细菌能分泌淀粉酶。 绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。因此糖发酵在肠道细菌的鉴定上有重要作用。酸的产生可利用指示剂来断定，气体的产生可由发酵管中倒置的德

5、汉氏小管中有无气泡来证明。 某些细菌（如大肠杆菌、志贺氏菌、产气杆菌等）分解葡萄糖产生多种有机酸，导致培养基PH值下降。可用甲基红作为指示剂，中性红色，酸性黄色。有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，就会形成红色的玫瑰吲哚。 某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧气氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V.P.（+）反应。 材料与方法 1培养基配制 1.1药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、可溶性淀粉 、 K2HPO4、 KH2PO4 、 蒸馏水、琼脂、1mol

6、氢氧化钠、花生油、葡萄糖、溴甲酚紫、中性红、乙醇 1.2器材：天平、药匙、瓷缸、玻璃棒、电炉、 PH试纸、试管、三角瓶、移液管、牛皮纸、棉花、线绳、高压锅。 1.3培养基的制备过程称量-溶解（加水，加热，搅拌）-调节pH值（NaOH）-过滤(土豆培养基)-分装及包扎-灭菌（高压蒸汽灭菌，含葡萄糖和乳糖的培养基在115灭菌，其它121灭菌） 所需培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（100ml）马铃薯培养基（200ml）油脂培养基（100ml）淀粉培养基（100ml）伊红美兰培养基（100ml）蛋白胨水培养基（100ml）糖发酵培养基（100ml）葡萄糖蛋白胨水培养基（250ml）三倍浓缩的乳糖发酵培养基

7、（350ml）普通浓度乳糖发酵培养基（150ml） 第二组配制：牛肉膏蛋白胨培养基（100ml）马铃薯培养基（200ml）伊红美兰培养基（100ml）葡萄糖蛋白胨水培养基（250ml）普通浓度乳糖发酵培养基（150ml） 2微生物分离纯化 1.1材料：牛肉膏蛋白胨培养基、土豆培养基、油脂培养基、淀粉培养基 1.2仪器：移液管、无菌水、接种环、酒精灯、土壤悬液、无菌培养皿、涂棒、恒温培养箱等。 1.3内容及方法： 1.3.1.采集土样，制备土壤悬液：1g土稀释到10-5 ，称取5克土样放入装有45ml无菌水和玻璃珠的三角瓶中，连续摇动30分钟，依次稀释至10-5 1.3.2倒平板：右手持盛培养基

8、的三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约25ml，加盖后轻轻摇动使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板 1.3.3涂布分离：将0.2m菌悬液小心的滴在平板培养基表面位置 ，右手拿无菌涂棒将菌悬液沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀 1.3.4恒温培养箱培养：土豆培养基板于25 倒置培养24h，牛肉膏蛋白胨培养基、油脂培养基、淀粉培养基于30 倒置培养24h后观察 1.3.5观察并记录菌落形态 1.3.6计算同一稀释度三个平板上的菌落平均数：每毫升中菌落形成单位（cfu）=同一稀释度三次重复的平均菌落数

9、稀释倍数5 3大分子物质水解试验 3.1材料：土壤分离菌 油脂培养基 淀粉培养基 接种环 鲁戈氏碘液 3.2方法与步骤： 3.2.1油脂水解试验：在油脂培养基中接种土壤分离菌，37度培养24h,取出油脂平板，观察平板表面长菌的地方，如出现红色斑点，说明脂肪被水解，为阳性反应。 3.2.2淀粉水解试验：在淀粉培养基上接种土壤分离菌，37度培养24h，取出淀粉平板，打开皿盖，加少量卢戈氏碘液于平板上，轻轻旋转平皿，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。透明圈的大小可初步判断该菌水解能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。 4糖发酵试验 4.1菌株：大肠杆菌 枯

10、草杆菌 土壤分离菌 4.1材料：盛有葡萄糖发酵培养基的试管（内置德氏小管）试管架 接种环 4.3步骤：取葡萄糖发酵培养基的试管4支，分别接种大肠杆菌，枯草杆菌。自制菌，阴性对照；于37度培养24h. 5吲哚、甲基红、伏普试验 5.1菌株：大肠杆菌 产气杆菌 土壤分离菌 5.2培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基 蛋白胨水培养基 5.3试剂：甲基红试剂 吲哚试剂 伏普试剂 5.4器材：接种环 酒精灯 恒温培养箱 5.5步骤： 5.5.1甲基红试验：于葡萄糖蛋白胨培养液中，各加入23滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色，即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“”

11、或“”表示。 5.5.2吲哚试验：取蛋白胨水培养物，加入40滴乙醚，摇动数次，静置5-10分钟，待乙醚上升后，沿管壁徐徐加入5滴吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛），在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应，记录为吲哚试验阳性结果（用“”表示）； 若无红色环状物出现者记录为吲哚试验阴性结果（用“”表示）。 5.5.3伏普试验：取葡萄糖蛋白胨水培养物，加入等量（20滴）V.P.试剂（40%的KOH和5%的-萘酚），摇匀，以使空气中的氧溶入，静置于37恒温箱中保温30min后，若培养液呈红色，记录为V.P.试验阳性结果（用“”表示）； 若不呈红色，仍未为黄中带蓝色者记录为V.P.试验阴性结果（用“”表

12、示）。 结果记录 1微生物的培养特征观察 牛肉膏蛋白胨培养基（土壤菌悬液）：乳白色，圆形或近圆形，边缘光滑，菌落较分散，大小不一，但大菌落较多； 土豆培养基（土壤菌悬液）：乳白色，圆形，边缘光滑，菌落密集，数目较多，菌落多比较小； 油脂培养基：菌落淡粉色，圆润，边缘整齐光滑，菌落密集，分布均匀，大小相差不大； 土豆培养基（空气微生物）：菌落密集，分布不均，大部分有菌毛，不同颜色，褐色、白色、绿色，大小不一。 2平板计数法计数微生物 牛肉膏蛋白胨培养基：1号42个，2号69个 1ml菌悬浮液形成菌落单位=（42+69）/2*105*5=2.775*107cfu 土豆培养基：1号58个, 2号76个 1ml悬浮液形成的菌落：（58+76）/2*105*5=3.35*107cfu 3生化鉴定 （1）大分子物质水解实验 “+”表示阳性；“-”表示阴性 菌名油脂水解实验淀粉水解实验土壤分离液 + (出现红色） + （无色透明） 分析：选取的土样中含有可分解淀粉的菌，在菌苔周围出现无色透明圈，但透明圈不是很明显，说明这些菌产生胞外淀粉酶的活性不是很高；油脂水解试验出现红色斑点说明土壤中含有分解油脂的菌。 （2）糖发酵实验 产酸产气：+ 产酸不产气：+ 不产酸不产气：菌名大肠杆菌枯草杆菌土壤分离液阴性对照现象 + + + + 分析：大肠