重组蛋白制备

1、如何获得重组蛋白？重组蛋白制备l重组表达载体构建l目标蛋白重组表达l最高效的蛋白分离纯化方法亲合纯化重组表达载体构建基因克隆基因克隆(Gene Cloning):亦称分子克隆技术。将某特定基因或DNA片段插入到载体分子中,并筛选获得纯化(克隆)重组子的技术。基因克隆程序1）目的基因片段获得2）目的载体的获得3）目的基因与载体DNA的限制性酶切4）酶切目的基因与载体DNA片段的连接重组5）连接重组质粒转化大肠杆菌6）含目的基因插入片段的重组子鉴定基因克隆所需通用材料l需要克隆的目的目的DNADNA片段片段。l克隆载体克隆载体，用于接入目的DNA片段。l限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶，消化目的D

2、NA片段与克隆载体，产生连接反应所需要的DNA粘性末端。lDNADNA连接酶连接酶，将目的DNA片段与克隆载体连接在一起，构建重组载体。l大肠杆菌感受态细胞感受态细胞，用于筛选含有插入目的DNA片段的阳性克隆。基因克隆流程图一、目的基因片段获取1）聚合酶链式反应PCR2）反转录-聚合酶链式反应RT-PCRPCRPCR：Polymerase Chain Reaction多聚酶链式反应美国Kary B.Mullis1985年建立 (1993诺贝尔化学奖获得者)PCR反应的三个基本步骤l模板双链DNA的变性：94l引物与单链模板的退火：55l引物的延伸：70一个PCR循环(PCR cycle)包括变

3、性退火延伸三个步骤；理论上可使靶序列数量增加一倍。30个循环后，可获得106个靶分子PCR循环PCR反应五要素lDNA聚合酶：影响PCR反应的产量l引物：影响PCR反应特异性的关键因素ldNTP：影响PCR反应扩增效率的关键因素l模板：决定PCR反应成败的关键环节之一lMg2+：影响PCR反应扩增的特异性和产量RT-PCRl以RNA作为模板，反转录酶合成互补DNA（cDNA）l以cDNA作为模板，PCR指数扩增目的基因片断。与普通PCR相同。反转录反应l反应原理：反转录酶以RNA为模板指导互补DNA链合成。l反应组分：polyT引物，dNTPs，mRNA模板l反应特点：特异性以mRNA作为模板

4、。l注意事项：防止核酸酶A（RNase A）污染 ，RNase A会降解RNA模板，使反转录反应失去模板而失败。l与PCR区别： 1）PCR反应为链式反应，产物以指数方式扩增；反转录为线性扩增，且只能合成一条与RNA互补的DNA链。 2）PCR为热循环反应，DNA聚合酶具有热稳定性；反转录为常温反应，反转录酶不具有热稳定性，高温使反转录酶失去酶活性。二、限制性酶切反应l反应原理 限制性内切核酸酶识别双链DNA的特异性序列，并在此特异性序列处或附近切断双链DNA。l反应特点 切割位点具有碱基序列特异性，只在特定碱基序列处切断双链DNA。l注意事项a 不同限制性内切核酸酶反应缓冲液有很大差别，b

5、一部分限制性内切核酸酶活性受DNA识别序列甲基化修饰影响三、克隆载体质粒质粒的相关概念l可以在宿主细胞内进行复制的环形DNA分子。l不同质粒在宿主细胞内的分子数(拷贝数)不同。l在体外不能复制、传代；但DNA可长期保存生命活力。微生物基因组DNA不再具有生命活力。l根据宿主细胞差异，质粒分为多种类型。l根据用途差异，质粒分为:克隆载体和表达载体。l人工构造的质粒具有的必需功能元件：复制起始区、抗性筛选标记、多克隆位点。pUC18质粒图谱 pUC18多克隆位点四、DNA连接反应l反应原理：DNA连接酶催化DNA分子3羟基（3-OH）与5磷酸基团（5-P）间形成磷酸二酯键l反应组分：DNA连接酶及

6、相应辅基，DNA分子。lDNA连接种类： 1）ATP作辅基的DNA连接酶，例如T4DNA连接酶，pfu DNA 连接酶 2）NAD作辅基的DNA连接酶，例如大肠杆菌DNA连接酶l应用： 1）DNA重组构建重组质粒 2）DNA连接反应检测单核苷酸多态性 连接反应获取重组环状DNA分子五、DNA转化反应lDNA转化原理在某些特殊生理条件下，宿主细胞可以高效吸收外源DNA，从而将外源DNA转入特定宿主菌。lDNA转化方法 1）化学转化：用某些二价金属离子，例如50mM CaCl2，处理宿主细胞，使宿主细胞处于高效吸纳外源DNA的生理状态，称之为感受态。之后将外源DNA转化进入宿主菌细胞。 2）电转化

7、：高电压瞬时处理（电击）宿主菌，可使宿主菌处于极高效吸纳外源DNA的生理状态。电转化效率是化学转化效率的10100倍。l主要应用 将可自我复制的外源DNA，如各种质粒，转入宿主菌，并在宿主菌内繁殖这些质粒，实现相应质粒的大规模制备。六、重组质粒鉴定方法1）PCR鉴定 利用目的基因特异性的引物，重组质粒作为模板，利用PCR进行鉴定。若能扩增出DNA产物，则重组质粒含有目的基因；反之不含目的基因，为空质粒。2）限制性酶切鉴定 利用插入目的基因时所用的限制性内切核酸酶消化重组质粒，若能产生对应大小的DNA片段，重组质粒含有目的基因；反之不含目的基因，为空质粒。3）DNA序列测定鉴定 将重组质粒进行D

8、NA序列测定，在碱基序列水平验证插入片段的存在。蛋白诱导表达蛋蛋白白诱诱导导表表达达一、重组蛋白表达系统l原核表达系统： 表达载体中的重组蛋白表达元件是原核生物特有的，表达宿主也是各种原核生物，例如大肠杆菌。l真核表达系统： 重组蛋白表达元件是真核生物特异性的，表达宿主为各种真核生物，例如啤酒酵母、昆虫、哺乳动物细胞。l无细胞翻译系统： 不需要宿主细胞，只需要把目的蛋白的mRNA加入无细胞翻译系统，37度保温一段时间即可合成出毫克级的目标蛋白质。优势主要是目标蛋白纯化简便。原核表达系统 根据原核表达载体中用于表达重组蛋白的必需元件的差异，主要是启动子、识别并结合启动子的RNA聚合酶、诱导物的差

9、异，常用的原核表达系统有:lT7-lacI表达系统 由T7RNA聚合酶结合在T7启动子上，转录合成目标蛋白的mRNA分子。诱导物为isopropyl-D-thiogalactoside（IPTG，异丙基-b-D-硫代半乳糖苷 ），无诱导物时，T7启动子控制的外源基因的转录受lacI蛋白抑制。代表：PET系列载体表达载体含有一个启动子序列,能有效地促使插入的目的基因进行转录,进而翻译出该插入基因编码的蛋白产物的载体。表达载体的启动子通常与其受体同源,如以大肠杆菌为受体的表达载体,其启动子来源于大肠杆菌系统;在痘苗病毒中表达的启动子则来源于痘苗病毒。 表达质粒构成元件l复制起点l抗生素选择标记基因

10、l多克隆位点l用于DNA序列测定的区域l重组蛋白表达元件 1）启动子（promotor）：RNA聚合酶结合位点，负责转录合成外源插入基因的mRNA分子。 2）S-D序列：核糖体结合位点（ribosome binding sequence，RBS），核糖体结合在mRNA分子的RBS上，起始蛋白翻译，合成重组蛋白质。 3）阻遏蛋白编码基因（repressor） 4）转录调控序列（阻遏蛋白结合序列） 5）转录终止序列（terminator） 6）纯化标签编码序列l阿拉伯糖表达系统： 大肠杆菌RNA聚合酶负责转录pBAD启动子控制的外源基因转录。属于严紧型表达系统，目标蛋白mRNA分子的转录过程可以通

11、过诱导物的调控来达到严格的开放/关闭状态，诱导物L-阿拉伯糖(L-arabinose)浓度连续变化实现外源重组蛋白表达水平的连续调控。无诱导物时，pBAD启动子控制的外源基因的转录受araC蛋白抑制。l色氨酸lacI表达系统（Trp-lac）： 大肠杆菌RNA聚合酶转录Ptrp启动子控制的外源基因转录。诱导物为IPTG，无诱导物时，外源基因的转录受lacI蛋白抑制。真核表达系统l酵母表达系统 啤酒酵母，可表达在啤酒酵母细胞内的表达载体上编码的重组蛋白；甲醇酵母，表达的重组蛋白的编码基因与各种必需的表达元件已整合到甲醇酵母基因组中。l昆虫表达系统 具有昆虫特异性的启动子，外源基因处于启动子下游。

12、l哺乳细胞表达系统 哺乳细胞病毒特异性启动子，外源基因处于该启动子下游，调控外源基因转录过程。l生物加工厂 转基因动物，基因组中整合了目标蛋白的编码基因与表达元件，转寄因鸡、猪、牛、羊等无细胞翻译系统l大肠杆菌无细胞翻译系统 即大肠杆菌细胞裂解液。大肠杆菌细胞有一定要求，一般是核酸酶与蛋白酶缺失突变株，核酸酶缺失大大降低了mRNA的降解，而蛋白酶的缺失降低了合成的目标蛋白的降解，从而提高目标蛋白产量。一般用于表达原核生物蛋白。l兔网织红细胞无细胞翻译系统 一般用于合成真核生物蛋白，可以保证有效的进行蛋白翻译后的各种修饰。蛋白纯化重组蛋白纯化标签l6XHis：6个连续组氨酸 lGST：谷光甘肽转

13、移酶 lChtin Binding Domain：几丁质结合结构域lMaltose Binding Protein：麦芽糖结合蛋白lBiotinated peptide：生物素化多肽链 lStep Tag II：短肽序列，生物素功能类似物lFLAG（DYKDDDDK）：短肽序列，lS tag：短肽序列，结合S tag 抗体lT7 tag：短肽序列，结合T7 tag 抗体选择亲和标签时需考虑的因素l亲和标签是否会影响目标蛋白的结构和功能（小）l蛋白质的稳定性l亲和标签所融合的位置（N端，C端）l是否需在变性条件下进行亲和纯化（标签适合否）l亲和标签对表达水平的影响（标签、蛋白、系统）l是否需标签

14、具有鉴定功能l亲和洗脱的条件（不使蛋白变性）l亲和介质和缓冲液的费用l是否在亲和纯化后去除标签His标签和金属螯合亲和层析l金属螯合层析原理：基于蛋白质表面的一些特定的氨基酸残基侧链，尤其是组氨酸，在中性和弱碱性条件下可以和固定化的金属离子相互作用，如Ni2+、Zn2+和Co2+，从而分离蛋白质。lHis标签是目前应用最为广泛的亲和标签。His标签优缺点l优点：标签分子量小，一般不影响目标蛋白的功能；可用于变性/非变性纯化；免疫原性相对较低，可直接用于抗体制备；可应用于多种表达系统，纯化条件温和；可和其它亲和标签共同构建双亲和标签。l缺点：融合蛋白易形成包涵体，包涵体蛋白难于溶解；包涵体溶解后

15、不能正确复性；层析时螯和的金属离子容易泄漏；非特异性结合会造成制品纯度不高。谷胱甘肽巯基转移酶蛋白标签(GST)l最早使用的亲和标签。l目标蛋白加于GST的C端，再利用谷胱甘肽亲和介质进行纯化，或固定在亲和介质上进行蛋白质-蛋白质互作研究。l因GST分子量较大，且以二聚体的形式存在，一般都需要去除融合标签。l此系统必须依赖于GST的正确折叠。lGST融合蛋白常用来免疫动物生产抗体，及作为载体蛋白进行一些蛋白的结晶。几丁质结合肽lIMPACT系统使用几丁质结合肽（来源于环状芽胞杆菌）作为融合标签，表达的融合蛋白可以用几丁质亲和层析纯化，利用内含肽（intein）的特异性原位剪切直接获得目标蛋白。

16、l最大优点：不需使用蛋白酶来去除融合标签。l包括以下几类：l巯基诱导的N端剪切系统；l巯基诱导的C端剪切系统；lpH诱导的C端剪切系统；l可用于蛋白质环化的双内含肽系统。基于几丁质与几丁质结合结构域的亲合纯化麦芽糖结合蛋白（MBP）l此系统使用交联直链淀粉的亲和介质纯化，用麦芽糖进行竞争性洗脱。l优点：MBP不含有半胱氨酸残基，不会干扰目标蛋白形成正确的二硫键；使用的介质价格低廉；可在温和条件下洗脱融合蛋白；加上其分泌信号，可以进行分泌表达在细胞周质；这一系统最显著的特点是与MBP进行融合表达可以改善目标蛋白的溶解性，促进正确折叠，提高活性蛋白的回收率MBP标签亲合纯化重组蛋白制备SDSPAG

17、E图谱与抗生物素蛋白特异结合的亲和标签l生物素-抗生物素蛋白（Avidin-Biotin）是目前最强的亲和作用之一。lStrep Tag 系统是通过筛选噬菌体随机肽库得到的短肽（含9个氨基酸残基），将其进行目标蛋白的C端融合可模拟生物素和链霉抗生物素蛋白特异性相互作用，使用亚胺生物素洗脱。这一系统不能进行N端融合，而且变性剂会影响亲和相互作用。后发展的8氨基酸Strep tag 标签，本身并不能生物素化，却可模拟生物素的功能和链霉抗生物素蛋白变体Strep-Tactin特异性的相互作用，可加在蛋白的N端和C端，使用便宜的脱硫生物素进行洗脱，且Strep tag 和Strep-Tactin相互作

18、用不受变性剂的影响，可在变性条件下纯化。基于亲合素与生物素的亲合纯化FLAG标签，T7标签和S标签lFLAG肽序列（DYKDDDDK）亲水性很强，片段小，且具有肠激酶的酶切位点，一般不会影响目标蛋白活性。昂贵。lT7 标签：T7 基因10蛋白的最前面11个氨基酸，通过免疫亲和层析进行纯化。lS标签：15 个氨基酸的多肽标签，可以特异性的和S-蛋白介质结合。由于S标签和S-蛋白结合形成有活性的核糖核酸酶，可灵敏的定量检测融合蛋白。亲和标签亲和标签分子大小分子大小结合配体结合配体融合部位融合部位洗脱条件洗脱条件注释注释谷胱甘肽巯基转移谷胱甘肽巯基转移酶酶(GST)(GST)220aa谷胱甘肽N 端

19、还原型谷胱甘肽pGEX, pET41, pET42,可进行表达蛋白检测融合蛋白形成二聚体几丁质结合结构域几丁质结合结构域(CBD)(CBD)56aa几丁质N 端或C端诱导剪切pTYB,pTWIN麦芽糖结合蛋白麦芽糖结合蛋白(MBP)(MBP)396aa直链淀粉N 端或C端麦芽糖pMAL可分泌表达,可改善溶解性PinPointPinPoint( (可生物素化蛋白可生物素化蛋白) )13 kDaavidinN 端生物素PinPoint可进行表达蛋白检测Strep tag Strep tag ( (非生物素化亲和非生物素化亲和) )8aaStreptavdinN 端或C端脱硫生物素pPR-IBA,

20、pASK-IBA可进行分泌表达可进行表达蛋白检测, 可进行目标蛋白固定化,可在变性条件下纯化组氨酸标签组氨酸标签(Poly His)(Poly His)6,8,10,18aa螯和Ni2+N 端或C 端咪唑/低pHpET, pHAT, pQE可在变性条件下纯化FLAGFLAG标签标签8aa单抗M1/M2M1: N 端M2:N端/C 端M1: EDTA M2:低pH或合成的FLAG肽p-FLAG,p3FLAG已具有肠激酶酶切位点S S 标签标签15aaRNase A的S片段N 端或C 端低pHpET可进行表达水平的监测T7 T7 标签标签11aa单抗N 端低pHpET可增强表达水平可在弱变性条件下

21、纯化亲和标签的去除l三种情况不必去除标签：目标蛋白作为免疫原用来产生和纯化抗体；目标蛋白的生物活性不受融合标签的影响；目标蛋白用来直接固定化在介质上。l去除法：化学法（廉价，缺乏选择，反应剧烈） 酶法（温和，特异性强，成本较高）剪切方法剪切方法剪切位点序列剪切位点序列注释注释 化学法化学法溴化氰Met需70%甲酸，室温羟胺AsnGlypH9，需加热，甲酸AspPro70%甲酸，需加热酶法酶法肠激酶Asp-Asp-Asp-Asp-Lys内切酶赖氨酸后为脯氨酸不能剪切其它碱性氨基酸残基后有非特异性剪切具有活性的pH范围为4.5到9.5，温度范围4到45凝血因子a蛋白酶Ile-Glu/Asp-Gly

22、-Arg内切酶精氨酸后为脯氨酸和精氨酸不能剪切在Gly-Arg后为非特异性剪切凝血酶Leu-Val-Pro-ArgGly-Ser牛来源内切酶存在非特异性剪切生物素化后可用链霉抗生物素蛋白亲和层析清除PreScission 蛋白酶Leu-Glu-Val-Leu-Phe-GlnGly-ProGST融合的鼻病毒蛋白酶，内切酶具有最优活性rTEV蛋白酶Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-GlnGly重组的烟草蚀纹病毒蛋白酶，内切酶具有8个氨基酸识别位点高特异性宽温度范围里具有活性与His-tag融合后，酶切后使用金属螯合亲和层析清除二肽基氨基肽酶(Xaa)2nXaa-Pro, (Xaa)2nXaa

23、- Xaa Pro, (Xaa)2nLys/Arg/Gln外切酶终止氨基酸为Gln时，可在谷氨酰胺环转移酶和焦谷氨酰胺肽酶作用下去掉Gln，可产生天然目标蛋白质特异性强l亲和层析：最高效的分离纯化方法 基于蛋白质和亲和配体的特异性相互作用。 用于亲和层析的配体可以是针对抗原的抗体、针对蛋白质分子的受体、酶的底物或抑制剂、针对糖分子的凝集素、活性染料、金属离子、天然或改造过的相互作用多肽等等。 利用DNA重组技术，进行目标蛋白的融合表达，再用亲和层析进行分离纯化，已成为蛋白质表达纯化的常用手段。其它蛋白纯化技术l分子筛分离：过滤、凝胶阻滞分离l离子相互作用力：离子交换色谱l疏水性相互作用：疏水相

24、互作用层析l等电聚焦：等电聚焦纯化层析技术在分离纯化中的应用l凝胶过滤层析（分子筛层析）： 基于液相的分离，凝胶包裹的内环境形成固定相，凝胶的外环境形成流动相，蛋白质分子越大越不容易渗透进入固定相。l离子交换层析： 基于蛋白质与离子交换介质电荷间的相互作用。高于等电点，蛋白质带负电荷，低于等电点蛋白质带正电荷，不同的蛋白质在一定的pH条件下与介质上的离子之间相互作用不同，而产生不同的选择性。l疏水层析：基于蛋白质表面的疏水区和介质疏水配体间的相互作用。高盐条件下，蛋白质的疏水区表面的水分子被盐离子破坏而释放，裸露的疏水区与疏水配体相互作用而被吸附；随着盐浓度降低，相互作用也降低，水化层又形成，

25、蛋白质最终解吸附。疏水层析的选择性依赖于疏水配体的结构。l等点聚焦层析：基于蛋白质等电点不同的分离。以阴离子交换剂为固定相为例，两性电解质缓冲液和离子交换基团相互作用形成pH梯度，蛋白质在pH 大于其等电点时吸附，在pH低于其等电点时解吸附。由于蛋白质区带后部所处微环境的pH总是低于其前部所处微环境的pH，后部区带的蛋白质先于前部开始移动，产生聚焦效应。可分离等电点仅差0.02的蛋白质。层析方法层析方法亲和层析亲和层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析 离子交换层析离子交换层析 疏水层析疏水层析分离机制分离机制特异性亲和大小电荷疏水性选择性选择性非常高中等高高中等载量载量高低高高纯化速度纯化速度中等中等低高高生物相容性生物相容性好非常好好中等好目标蛋白得率目标蛋白得率高低低中等