(动物传染病学实验课件)6 伪狂犬病抗体检测

1、( (动物传染病学实验课件动物传染病学实验课件)6 )6 伪狂犬病抗体检测伪狂犬病抗体检测间接间接ELISAELISA 酶标酶标单抗单抗血清血清？底物显色底物显色阻断阻断ELISAELISA l酶标板，酶标仪酶标板，酶标仪l包被缓冲液：包被缓冲液：0.025M pH9.60.025M pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液l猪伪狂犬病毒（猪伪狂犬病毒（PRVPRV） 抗原抗原l样品稀释液：样品稀释液： pH7.4 PBSpH7.4 PBS三、实验材料三、实验材料p 阴性对照（阴性对照（EPEP管中，已稀释）管中，已稀释）p 阳性对照（阳性对照（EPEP管中，已稀释）管中，已稀释）p 样品样品 待测

2、猪血清（待测猪血清（EPEP管中，已稀释）管中，已稀释）p 碱性磷酸酶标记猪碱性磷酸酶标记猪PRVPRV单抗单抗 酶标单抗（酶标单抗（EPEP管中，已稀释）管中，已稀释）p 洗涤液：含洗涤液：含0.05% Tween 200.05% Tween 20的的0.01M pH7.4 0.01M pH7.4 PBSPBS（青瓶）（青瓶）常用酶及底物常用酶及底物常用酶常用酶底物底物反应后颜色反应后颜色辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（HRPHRP）邻苯二胺（邻苯二胺（OPDOPD）棕黄色棕黄色碱性磷酸酶碱性磷酸酶（APAP）四甲基联苯胺四甲基联苯胺（TMBTMB）蓝色蓝色n底物缓冲液：底物缓冲液： pH5.

3、0pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液磷酸盐柠檬酸缓冲液n底物溶液：底物溶液：TMBTMB（四甲基联苯胺），底物缓冲液，（四甲基联苯胺），底物缓冲液，30% H30% H2 2O O2 2，新鲜配制新鲜配制n终止液终止液1.1.抗原处理：抗原处理：2.2.抗原包被：抗原包被：以洗涤液（以洗涤液（200L/200L/孔）洗涤孔）洗涤3 3次，次，3min/3min/次次四、实验方法四、实验方法3.3.加待测血清：加待测血清：标记各孔，加入相应液体标记各孔，加入相应液体100L/100L/孔孔1234阴阴性性待待测测阳阳性性待待测测4.4.加单抗：加单抗：3737，30min30min甩干孔内液体甩干孔内

4、液体以洗涤液（以洗涤液（200L/200L/孔）洗涤孔）洗涤3 3次，次，3min/3min/次次各孔加入酶标单抗各孔加入酶标单抗100L/100L/孔孔3737，30min30min5.5.显色：显色：甩干孔内液体甩干孔内液体以洗涤液（以洗涤液（200L/200L/孔）洗涤孔）洗涤3 3次，次，3min/3min/次次加入底物溶液加入底物溶液100L/100L/孔孔避光显色，避光显色，10min,10min,加终止液加终止液1 1滴滴6.6.观察结果观察结果取稀释好的被检血清取稀释好的被检血清2 2份和阴、阳性对照血清，每孔加入份和阴、阳性对照血清，每孔加入100l100l，置，置3737温

5、育温育3030分钟。分钟。洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200l200l，静置，静置3 3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复3 3次。次。每孔加酶标单抗每孔加酶标单抗100l100l，置，置3737温育温育3030分钟。分钟。洗板：同步骤洗板：同步骤2 2。显色与终止：每孔先加底物显色与终止：每孔先加底物A A液、再液、再B B液各液各1 1滴滴(50l)(50l)，混匀，室温，混匀，室温（18-25 18-25 ）避光显色）避光显色1010分钟后。分钟后。终止：每孔加终止液终止：每孔加终止液1 1滴滴

6、(50l) (50l) （0.25% 0.25% 氢氟酸），终止反应。氢氟酸），终止反应。1010分钟内测定结果。采用波长分钟内测定结果。采用波长630nm630nm的酶标仪测定的酶标仪测定ODOD值。值。结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均ODOD630630值与阳性对照孔值与阳性对照孔平均平均ODOD630630值之差值之差0.40.4。S=S=样品孔样品孔ODOD630630值，值，N=N=阴性对照孔阴性对照孔ODOD630630值值如果如果S/NS/N比值比值0.60.6，样品判定为，样品判定为PRVPRV抗体阳性抗体阳性; ;如果如果S

7、/NS/N比值比值0.70.7但但 0.6 0.6，样品可疑，样品可疑; ;如果如果S/NS/N比值比值 0.7 0.7，样品判定为，样品判定为PRVPRV抗体阴性。抗体阴性。五、结果与分析五、结果与分析n 阴阳性对照样品的阴阳性对照样品的ODOD630630 ? ?n S/NS/N? ?，被检血清是阴，被检血清是阴/ /阳性？阳性？n 结果与预期的不符，可能的原因是什么？结果与预期的不符，可能的原因是什么？l 阳性：无色阳性：无色l 阴性：蓝色阴性：蓝色1 2 3 4阳性阳性阳性阳性阴性阴性被检被检血清血清？底物显色底物显色被检被检？ ELISAELISA前血清样品前血清样品5656灭活灭活3030分钟。分钟。 在在ELISAELISA的整个操作过程中，洗涤非常重要的整个操作过程中，洗涤非常重要, ,应该用力应该用力力甩干力甩干, ,以除去未结合的抗原、抗体和酶标抗体以除去未结合的抗原、抗体和酶标抗体 。 加入底物液后应室温避光，结果判断须在加入底物液后应室温避光，结果判断须在1010分钟内。分钟内。 实验中保持安定，不要随意走动、讨论不相