实验二微量凯氏定氮法测定总氮量

1、_实验二总氮量的测定一凯氏定氮法 一目的：学习凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理 掌握蒸惚、滴定操作技术二、原理生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，蛋白质的含氮量 约为16%,测出含氮量则可推知蛋白含量。消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮硫酸鞍。为加 快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸 点。廿氨酸的消化过程可表示如下：CH2NH2COOH+3H2SO4- 2CO2+3SO2十4出0十NH32NH3+H2SO4 一(NH4)2SO4蒸此 浓碱可使消化液中的硫酸钱分解，游离岀氨，借水蒸汽将产生的氨蒸 馆到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸

2、吸收氨后使溶液中的氢离子浓度 降低，(NH4)2SO4+2NaOH - 2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3-(NH4)2B4O7+5H2O滴定：用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原來的氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩尔数)计算出待测物中的总氮量。(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O一(NH4)2SO4+4H3BO3本法适用于0.2 2.0 mg的氮量测定。三、试剂 1、浓硫酸 2、粉末硫酸钾一硫酸铜混合物K2S04与CuS045H2。以3： 1配比研磨混合 3、30 %氢氧化钠溶液 4、2%硼酸溶液 5、标准盐酸溶液(0.0098 mol

3、 / L) 6、混合指示剂(田氏指示剂)由50mL0. 1 %甲烯蓝乙醇溶液与200mL0. 1%甲基 红乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色范围很窄且 灵敏。 7、样品一面粉lg五、操作方法 1样品处理固体样品：某一固体样品中的含氮量是用loog该物质（干重） 中所含氮的g数来表示（）。III 一般样品烘干的温度都采用105C,因为非游离的水都不能 在loo c以下烘干。在称量瓶中称一定量磨细的样品（如0.1 g左右的干燥面粉）， 然后置于105 C的烘箱内干燥4小时。用堆竭钳将称量瓶放人 干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。 每干燥1小时后

4、，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒 重。若样品为液体（如血清等），可取一定体积样品直接消化测定。2、消化取凯氏烧瓶标号。各加几颗玻璃珠;在1及2号瓶中各加样品O.lg,催化剂(K2S04+CuS04.5H20)200 mg,浓硫酸5 mLo在3及4号瓶中各加相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。每个瓶口放一漏斗，在通风橱内的电炉上消化。注意加样品时应直接送人瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并 放出SO?白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。定容：冷却后，加蒸憎水约1

5、0 mLo (注意慢加，随加随摇)。然后将瓶中溶物倾入50或100 mL的容量瓶中，并以蒸憎水洗烧瓶数次，将洗液并入容量瓶，用水稀释到刻度，混匀备用。蒸馆：改进型凯氏定氮仪结构特点：将蒸汽发生器、蒸馅器和冷凝器组成一个整体，体积小，安装容易，操作简便。 (1)水蒸汽发生器和反应室(2)冷凝器和通气室 (3)排水柱关键:搞清水管系统蒸憾器的洗涤1.接通冷凝水，先向蒸汽发生器中加入一定量的水（以排水口高度为宜）。2.水的自动喷出:将蒸馆水由加样室加入反应室，加样口水封，用酒精灯将其加热烧开将酒精灯移开片刻，反应室内水自动喷出到蒸汽发生器 打开蒸汽发生器出水口，放水。如此反复清洗35次。3清洗后在冷

6、凝管下端放一锥形瓶盛有5mL, 2%硼酸溶液和12滴指示 剂的混合液。打开冷凝水，进行蒸馆，如35min不变色则表明蒸馆装置内部 已洗涤干净。3蒸惚过程:准备：取50mL锥形瓶3个，各加入5mL2%硼酸溶液和12滴指示剂，溶液 呈淡紫色，用表面皿覆盖备用。打开冷凝水，置换成冷水。将一个盛有硼酸和指示剂溶液的锥形瓶放在冷 凝器下，并使冷凝器下端浸没在液体内。If丄M加样：用移液管取5 mL消化液（空白液和消化液分别做）,细心地加入反应室, 随后用小量筒加入30%NaOH溶液5mL,关闭自由夹，在加样漏斗中加 少量水做封口。蒸慟关闭自由夹，打开冷凝水（注意不要过快过猛，以免水溢出，实验过程中， 冷

7、凝水可一直打开）。点燃酒精灯，蒸憎开始，当观察到锥形瓶中的溶液由淡紫色变绿时（约 23分钟），开始计时，蒸馆3分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液 面约lcm,同时用少量蒸馆水洗涤冷凝管口外侧，继续蒸馆1分钟，取下 锥形瓶，用表面皿覆盖瓶口。蒸馅完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。如此35次。最后将 自由夹同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉，继续下一次蒸馆。待样品和空白消化液均蒸馆完毕，同时进行滴定。4滴定全部蒸馆完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示 剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。注意：使用前检査酸式滴定管漏不漏？漏的话，涂凡士林 滴定时一边滴一边摇，防止滴定过头！ 及时记录读数要求：空白消化液1次，样品消化液2次5 计算总氮量(%)=r(V1-V2)X0.014 X 100 X消化液量(ml) /滴定消耗用液量(ml) X w C为标准盐酸溶液摩尔浓度(0.0098M)； V为滴定样品消化液用去的盐酸溶液平均mL数; V?为滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均mL数； w为样品重量(lg),消化液量500ml,滴定消耗用液量 5ml。 14为氮的相对原子质量。样品蛋白质含