酶的分离纯化课件

1、1 l将酶从细胞或发酵液中取将酶从细胞或发酵液中取 出，再与杂质分开，获得出，再与杂质分开，获得 所需的酶产品。所需的酶产品。 l酶的分离纯化工作酶的分离纯化工作, ,是酶学是酶学 研究的基础研究的基础. . l酶的纯化过程就目前而言酶的纯化过程就目前而言, , 还是门实验科学还是门实验科学. . 2 酶的纯化过程与一般蛋白纯酶的纯化过程与一般蛋白纯 化过程相比有本身独有的特化过程相比有本身独有的特 点点: :一是特定的一种酶在细胞一是特定的一种酶在细胞 中含量很少中含量很少; ;二是酶可通过测二是酶可通过测 定活力的方法加以跟踪定活力的方法加以跟踪. . 1 1、建立一个可靠和快速的测活方法

2、；、建立一个可靠和快速的测活方法； 2 2、酶原料的选择；、酶原料的选择； 3 3、酶的提取；、酶的提取； 4 4、酶的提纯；、酶的提纯； 5 5、酶的纯度检验。、酶的纯度检验。 酶分离纯化的一般原则酶分离纯化的一般原则: : 3 第一节第一节 细胞破碎（细胞破碎（link)link)第二节第二节 酶的提取酶的提取 ( (link)link) 第三节第三节 沉淀分离沉淀分离( (link) link) 第四节第四节 离心分离离心分离 第五节第五节 过滤与膜分离过滤与膜分离 第六节第六节 层析分离层析分离 第七节第七节 电泳分离电泳分离 第八节萃取分离第八节萃取分离 第九节第九节 酶的结晶酶的结

3、晶 第十节第十节 浓缩与干燥浓缩与干燥 本章主要内容本章主要内容: : go 4 v一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎 或用超声波处理破碎。或用超声波处理破碎。 v植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶 等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的 提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能 达到目的。达到目的。 v细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的

4、 骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大 分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与 石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚 糖）。糖）。 5 l细胞的破碎方法：细胞的破碎方法： l一、机械破碎法一、机械破碎法 l二、物理破碎法二、物理破碎法 l三、化学破碎法三、化学破碎法 l四、酶学破碎法四、酶学破碎法 back 6 l原理：机械运动所产生的剪力作用于细胞原理：机械运动所产生的剪力作用于细胞 l1 1 机械捣碎法：捣碎机，机械捣碎法：捣碎机，100

5、0010000rpmrpm，实验、生产规模实验、生产规模 均可均可 l2 2 研磨法：研钵、石磨、球磨、细菌磨等研磨器械，研磨法：研钵、石磨、球磨、细菌磨等研磨器械， 效率较低效率较低 l3 3 匀浆法：匀浆器，用于颗粒细小的组织细胞匀浆法：匀浆器，用于颗粒细小的组织细胞 破碎程度高。对酶破碎少，难于工业化。破碎程度高。对酶破碎少，难于工业化。 Back 一、机械破碎法一、机械破碎法 7 包括包括: : 1 1、温度差破碎法、温度差破碎法; ; 2 2、压力差破碎法、压力差破碎法; ; 3 3、超声波破碎法、超声波破碎法; ; 二、物理破碎法二、物理破碎法 通过温度、压力、声波等各种物理因通过

6、温度、压力、声波等各种物理因 素的作用使组织细胞破碎素的作用使组织细胞破碎 8 1 1、温度差破碎法、温度差破碎法 冷冻冷冻 高温，用于脆弱易破菌，难以工业化高温，用于脆弱易破菌，难以工业化; ; 于冷藏库或干冰反复于零下于冷藏库或干冰反复于零下15152020使之冻固，然后缓慢使之冻固，然后缓慢 地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。 由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片 将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓

7、溶液，但 脂蛋白冻结变性。脂蛋白冻结变性。 或或: : 将材料投入沸水中，于将材料投入沸水中，于9090左右维持数分钟，立即置于冰左右维持数分钟，立即置于冰 浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。 9 高压冲击法高压冲击法 用活塞或冲击锤加高压冲击菌体细胞和冰晶石英用活塞或冲击锤加高压冲击菌体细胞和冰晶石英 沙等混合物。沙等混合物。 突然降压法突然降压法 加压至加压至3030MPMP以上，打开出口阀突然降为常压以上，打开出口阀突然降为常压 爆破性减压法爆破性减压法 用氮气或二氧化碳充压至几十至几百大气压。用氮气或二氧化碳充压至几十至几百大气压。 渗透压差法

8、渗透压差法 利用渗透压的变化而使细胞破碎，常用于从海洋利用渗透压的变化而使细胞破碎，常用于从海洋 微生物中提取某些酶。微生物中提取某些酶。 10 频率频率 1020 1020KHzKHz，功率功率100150100150W W，温度温度 010010o oC C， pH47 pH47，时间时间310310minmin，间隔多间隔多 次次; ;对数生长期细胞，细胞浓度和溶液粘对数生长期细胞，细胞浓度和溶液粘 度不宜太高。暴露于度不宜太高。暴露于9 910kHz10kHz声波或声波或1010 500kHz500kHz超声波所产生的机械振动，只要有超声波所产生的机械振动，只要有 设备该法方便设备该法

9、方便. .且效果也好，但一次处理且效果也好，但一次处理 量较小量较小; ;应用超声波处理时应注意避免溶应用超声波处理时应注意避免溶 液中气泡的存在液中气泡的存在; ;处理一些超声波敏感的处理一些超声波敏感的 蛋白质酶时宜慎重。蛋白质酶时宜慎重。 3 3、超声波破碎法、超声波破碎法 在超声波的作用下，细胞膜由于空穴作用而破碎。破坏程在超声波的作用下，细胞膜由于空穴作用而破碎。破坏程 度与输出功率、破碎时间密切相关，与频率关系不大度与输出功率、破碎时间密切相关，与频率关系不大。 操作条件操作条件 Back 11 三、化学破碎法三、化学破碎法 应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的结应用各种化学试

10、剂与细胞膜作用，使细胞膜的结 构改变或破坏。构改变或破坏。 有机溶剂（如甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）可使细胞膜的磷脂有机溶剂（如甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）可使细胞膜的磷脂 结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，再经提取可使膜结合酶结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，再经提取可使膜结合酶 或胞内酶等释出胞外。或胞内酶等释出胞外。 1 1、有机溶液、有机溶液 粉碎后的新鲜材料在粉碎后的新鲜材料在00以下加入以下加入5 51010倍量的丙酮，迅速倍量的丙酮，迅速 搅拌均匀，可破碎细胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合。蛋搅拌均匀，可破碎细胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合。蛋 白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末。用

11、少量乙白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末。用少量乙 醚洗，经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性。醚洗，经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性。 操作操作 12 表面活性剂表面活性剂( (溶于液体后，具有使表面张力显著降低作用的物质溶于液体后，具有使表面张力显著降低作用的物质)和和 细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构 破坏，增加膜的透过性。破坏，增加膜的透过性。 离子型表面活性剂会使酶的结构破坏，不用之。离子型表面活性剂会使酶的结构破坏，不用之。 常用的非离子型表面活性剂为：常用的非离子型表面活性剂为： Triton( Tri

12、ton(辛基酚聚氧乙烯醚辛基酚聚氧乙烯醚,聚乙二醇辛基苯基醚聚乙二醇辛基苯基醚 ); Tween( Tween(聚氧乙烯山梨醇酐聚氧乙烯山梨醇酐酯酯,吐温吐温,聚氧乙烯山梨醇酐聚氧乙烯山梨醇酐 三硬脂酸三硬脂酸酯酯 ) ) 用凝胶层析等方法除去表面活性剂，以便酶的进一用凝胶层析等方法除去表面活性剂，以便酶的进一 步纯化。对膜结合酶的提取特别有效。步纯化。对膜结合酶的提取特别有效。 2 2、表面活性剂、表面活性剂 Back 13 四、酶学破碎法四、酶学破碎法 在一定条件下，通过外加的酶或细胞本身存在的酶在一定条件下，通过外加的酶或细胞本身存在的酶 的作用，使细胞破碎。的作用，使细胞破碎。 简单原

13、理简单原理: :溶菌酶处理时，它能水解构成枯草溶菌酶处理时，它能水解构成枯草 菌等菌体膜的多糖类。能溶解菌的酶分布很广。菌等菌体膜的多糖类。能溶解菌的酶分布很广。 尤其卵白中含量高，而多易结晶化。尤其卵白中含量高，而多易结晶化。 1 1、外加酶、外加酶 14 1g1g菌体加菌体加1 110mg10mg溶菌酶，溶菌酶， pH6.2pH6.27.01h7.01h内完全溶菌。于生内完全溶菌。于生 理食盐水或理食盐水或0.2mol0.2mol蔗糖溶液中溶菌，虽失去细胞膜，但原形蔗糖溶液中溶菌，虽失去细胞膜，但原形 质没有脱出。质没有脱出。 蜗牛酶及纤维素酶蜗牛酶及纤维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞用

14、。也常被选为破坏细菌及植物细胞用。 革兰氏阳性菌：细胞结构和形状依赖于壁上的肽多糖，革兰氏阳性菌：细胞结构和形状依赖于壁上的肽多糖，溶菌溶菌 酶酶能专一性作用于肽多糖的能专一性作用于肽多糖的-1-1，4-4-糖苷键。糖苷键。 革兰氏阴性菌：除了革兰氏阴性菌：除了溶菌酶外，另加溶菌酶外，另加EDTAEDTA才有效。才有效。 酵母：其细胞壁的主要成分是酵母：其细胞壁的主要成分是-1-1，3-3-葡聚糖，需加葡聚糖，需加- -葡聚葡聚 糖酶糖酶； 霉菌：其细胞壁含有几丁质，可用霉菌：其细胞壁含有几丁质，可用几丁质酶几丁质酶； 植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶和果

15、胶酶。 15 将待破碎的鲜材料在一定将待破碎的鲜材料在一定pHpH和适当的温度下，利用自身的蛋和适当的温度下，利用自身的蛋 白酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来。白酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来。 自体融解时需要时间，需加少量甲苯、氯仿等。应防止细菌自体融解时需要时间，需加少量甲苯、氯仿等。应防止细菌 污染。于温室污染。于温室3030左右较早溶化。左右较早溶化。 自体融解过程中自体融解过程中PHPH显著变化，随时要调节显著变化，随时要调节pHpH。 自溶温度选在自溶温度选在0 044，因自溶时间较长，不易控制，所以制，因自溶时间较长，不易控制，所以制 备活性蛋白质时较少用。备活性蛋白质时较

16、少用。 适宜的自溶条件：温度、适宜的自溶条件：温度、pHpH值、离子强度等值、离子强度等 加入噬菌体感染细胞加入噬菌体感染细胞 电离辐谢电离辐谢 2 2、自溶法、自溶法 Back 16 l是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使 酶充分溶解到溶剂中的过程。也称酶的抽提。酶充分溶解到溶剂中的过程。也称酶的抽提。 l目的目的: : 让制备物充分溶解，并尽可能保持原来的天然让制备物充分溶解，并尽可能保持原来的天然 状态，避免因长久放置造成制备物的分解破坏状态，避免因长久放置造成制备物的分解破坏 l大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中。大部分

17、蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中。 因此蛋白质的提取一般以水为主。因此蛋白质的提取一般以水为主。 l稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，也稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，也 是提取蛋白质的最常用溶剂。是提取蛋白质的最常用溶剂。 17 盐溶现象盐溶现象: : 在一定浓度的盐存在下在一定浓度的盐存在下, ,酶的溶解度增加酶的溶解度增加. . 盐析现象盐析现象: : 当盐的浓度太高当盐的浓度太高, ,蛋白的浓度反而下降蛋白的浓度反而下降, ,从溶液中析出从溶液中析出. . 一般采用稀盐溶液，一般采用稀盐溶液，0.020.050.020.05mol/Lmol/L。 等渗盐溶液

18、尤以等渗盐溶液尤以0.020.020.05mol/L0.05mol/L磷酸盐缓冲液和碳酸磷酸盐缓冲液和碳酸 盐缓冲液常用。盐缓冲液常用。0.15mol/L0.15mol/L氯化钠溶液应用也较多。如氯化钠溶液应用也较多。如 6-6-磷酸葡萄糖脱氢酶用磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L0.1mol/L碳酸氢钠液提取等。碳酸氢钠液提取等。 一、酶提取的主要方法一、酶提取的主要方法 1 1、盐溶液提取、盐溶液提取 18 蛋白质提取液的蛋白质提取液的pHpH值首先应保证在蛋白质稳定的范值首先应保证在蛋白质稳定的范 围内，即选择在偏离等电点两侧。围内，即选择在偏离等电点两侧。 如碱性蛋白质则选在偏酸一侧，

19、酸性蛋白质选择偏如碱性蛋白质则选在偏酸一侧，酸性蛋白质选择偏 碱一侧，以增大蛋白质的溶解度，提高提取效果。碱一侧，以增大蛋白质的溶解度，提高提取效果。 酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好，宜用酸溶酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好，宜用酸溶 液提取。液提取。 2、酸溶液提取、碱溶液提取酸溶液提取、碱溶液提取 原则：原则： 19 如细胞色素如细胞色素C C属碱性蛋白质，常用稀酸提取；属碱性蛋白质，常用稀酸提取； 肌肉甘油醛肌肉甘油醛-3-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，用稀碱磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，用稀碱 提取；提取； 某些蛋白质或酶与其分物质结合常以离子键形式某些蛋白质或酶与其分物质结合常以离子键

20、形式 存在，选择存在，选择pH3pH36 6范围对于分离提取是有利的。范围对于分离提取是有利的。 20 与脂质结合比较牢固或分子中含非极性基团较多的酶需用有机与脂质结合比较牢固或分子中含非极性基团较多的酶需用有机 溶剂提取。溶剂提取。 有机溶剂提取用于提取蛋白质的实例至今是不多的。一些和脂有机溶剂提取用于提取蛋白质的实例至今是不多的。一些和脂 结合较牢或分子中非极性侧链较多的蛋白质，不溶于水、稀盐结合较牢或分子中非极性侧链较多的蛋白质，不溶于水、稀盐 或稀碱液中，可用不同比例的有机溶剂提取。或稀碱液中，可用不同比例的有机溶剂提取。 例例: 从一些粒线体（从一些粒线体（Mitochondria)

21、Mitochondria)及微粒体（及微粒体（Microsome)Microsome)等含多量等含多量 脂质物质中提取蛋白质时，采用脂质物质中提取蛋白质时，采用MortonMorton的丁醇法效果较好。的丁醇法效果较好。 因丁醇使蛋白质的变性较少，亲脂性强，易透入细胞内部，与因丁醇使蛋白质的变性较少，亲脂性强，易透入细胞内部，与 水也能溶解水也能溶解10%10%，因此具有脂质与水之间的表面活性作用，可占，因此具有脂质与水之间的表面活性作用，可占 据蛋白质与脂质的结合点，也阻碍蛋白质与脂质的再结合，使据蛋白质与脂质的结合点，也阻碍蛋白质与脂质的再结合，使 蛋白质在水中溶解能力大大增加。蛋白质在水

22、中溶解能力大大增加。 3、有机溶剂提取、有机溶剂提取 21 二、影响酶提取的主要因素二、影响酶提取的主要因素 1 1、温度、温度 为了防止酶变性失活，温度不宜高；为了防止酶变性失活，温度不宜高； 多数酶的提取温度在多数酶的提取温度在55以下；以下； 耐温较高的酶可适当提高温度，以提高酶溶解度和扩散速率。耐温较高的酶可适当提高温度，以提高酶溶解度和扩散速率。 少数对温度耐受性较高的蛋白质和酶，可适当提高温度，使杂少数对温度耐受性较高的蛋白质和酶，可适当提高温度，使杂 蛋白变性分离且也有利于提取和进一步纯化。蛋白变性分离且也有利于提取和进一步纯化。 如胃蛋白酶等及许多多肽激素类，选择如胃蛋白酶等及

23、许多多肽激素类，选择37375050条件下提取，条件下提取， 效果比低温提取更好。效果比低温提取更好。 22 2 2、pHpH值值 为了防止酶的变性，为了防止酶的变性，pHpH不宜过高或过低；溶液的不宜过高或过低；溶液的 pHpH值应远离酶的等电点，以增加酶的溶解度。值应远离酶的等电点，以增加酶的溶解度。 3 3、提取液的体积、提取液的体积 提取液的用量增加，可提高提取率；提取液的用量增加，可提高提取率； 过量，酶浓度降低，不利进一步纯化。过量，酶浓度降低，不利进一步纯化。 23 l从细胞中提取得到的生物大分子往往是不从细胞中提取得到的生物大分子往往是不 纯净的，含有大量杂质，必须进一步分离纯

24、净的，含有大量杂质，必须进一步分离 纯化，这一阶段可分为纯化，这一阶段可分为粗分级分离和细分粗分级分离和细分 级分离级分离两步进行。两步进行。 24 l蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特 异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。 性质性质 方法方法 l分子大小分子大小 透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤 l 溶解度溶解度 等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀 l电荷电荷 电泳、离子交换层析电泳、离子交换层析 l吸

25、附性质吸附性质 吸附层析（羟基磷灰石层析、疏水作用吸附层析（羟基磷灰石层析、疏水作用 层析）层析） l对配体分子对配体分子 亲和层析亲和层析 的生物亲和力的生物亲和力 25 主要是利用主要是利用盐析盐析法、等电点法、等电点沉淀沉淀、有机溶剂、有机溶剂 沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂 蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量 大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质， 但分辨率低但分辨率低. 1 1、粗分级分离、粗分级分离 26 l一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂一般蛋白质

26、样品经粗制分级后，体积较小，杂 质大部分被除去。进一步提纯，通常使用高分质大部分被除去。进一步提纯，通常使用高分 辨率的辨率的柱层析及电泳柱层析及电泳方法。方法。 l常用的柱层析方法有分子筛层析、离子交换层常用的柱层析方法有分子筛层析、离子交换层 析、疏水吸附层析、亲和层析。析、疏水吸附层析、亲和层析。 l常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电 聚焦电泳。聚焦电泳。 l另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一， 制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。 Back 27 改变某

27、些条件，使溶液中某种溶质溶解度降低，改变某些条件，使溶液中某种溶质溶解度降低， 从而从溶液中沉淀析出，达到与其它溶质分离。从而从溶液中沉淀析出，达到与其它溶质分离。 是酶分离纯化常用的方法之一。是酶分离纯化常用的方法之一。 其本质是降低溶液的溶解度。其本质是降低溶液的溶解度。 方法有盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、方法有盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、 复合沉淀等复合沉淀等,表表4-3. 28 在某一浓度的盐溶液中，不同的蛋白质和酶因溶解度各不相同在某一浓度的盐溶液中，不同的蛋白质和酶因溶解度各不相同 而分离。而分离。 盐为什么会改变蛋白酶的溶解度？盐为什么会改变蛋白酶的溶解度？ 盐在

28、溶液中离解为正负离子，反离子作用改变蛋白酶分子表面盐在溶液中离解为正负离子，反离子作用改变蛋白酶分子表面 的电荷；同时离子存在改变水活度使分子表面水化膜改变。的电荷；同时离子存在改变水活度使分子表面水化膜改变。 一、盐析沉淀法一、盐析沉淀法 盐溶盐溶是加盐使蛋白质融入水中，是加盐使蛋白质融入水中，盐析盐析是加盐使蛋白质是加盐使蛋白质 沉淀出沉淀出來來。两者所加的盐类不同，其作用机制也毫无关系。两者所加的盐类不同，其作用机制也毫无关系。 29 在低盐浓度下在低盐浓度下, ,蛋白质和酶溶解度随盐浓度升高而增加蛋白质和酶溶解度随盐浓度升高而增加 盐溶盐溶 30 盐析盐析 盐浓度升高到一定浓度后盐浓度

29、升高到一定浓度后, ,蛋白酶的溶解度又随蛋白酶的溶解度又随 着盐浓度升高而减少着盐浓度升高而减少, ,蛋白酶沉淀析出蛋白酶沉淀析出. . 一旦蛋白质溶液加入硫酸一旦蛋白质溶液加入硫酸銨銨，后者吸引了大量水分子，使水笼，后者吸引了大量水分子，使水笼 无法有效隔离蛋白质的非极性区，造成这些非极性区之间的吸无法有效隔离蛋白质的非极性区，造成这些非极性区之间的吸 引，因而沉淀下引，因而沉淀下來來。因此，分子表面上若有越多的非极性区域，。因此，分子表面上若有越多的非极性区域， 就越容易用硫酸就越容易用硫酸銨銨沉淀下沉淀下來來。 31 式中：式中： S S、SoSo：蛋白质或酶在离子强度为蛋白质或酶在离子

30、强度为I I和和0 0时的溶解度（时的溶解度（g/Lg/L） KsKs：盐析常数，取决于盐的性质和酶的结构盐析常数，取决于盐的性质和酶的结构 I I：离子强度离子强度, ,与离子浓度与离子浓度m mi i和离子价数和离子价数Z Zi i有关。有关。 I=1/2mI=1/2mi iZ Zi i2 2 酶在溶液中的溶解度与溶液中的离子强度的关系式：酶在溶液中的溶解度与溶液中的离子强度的关系式： 蛋白质和酶在溶液中的溶解度与蛋白质和酶在溶液中的溶解度与 溶液中的离子强度有密切的关系溶液中的离子强度有密切的关系 32 =LogSo =LogSo ：取决于酶的性质，也与温度和取决于酶的性质，也与温度和p

31、HpH有关。有关。 KsKs：主要取决于盐性质。与离子价数成正比，与离子半径与溶：主要取决于盐性质。与离子价数成正比，与离子半径与溶 液介电常数成反比。液介电常数成反比。 与与KsKs确定后，蛋白酶溶解度决定于确定后，蛋白酶溶解度决定于I I KsKs分段盐析分段盐析: : T T、pHpH一定下改变离子强度一定下改变离子强度 分段盐析分段盐析: : 一定盐和离子强度下，改变一定盐和离子强度下，改变T T、pHpH 常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、 磷酸钠等。磷酸钠等。 盐析所需添加饱和硫酸铵体积式：盐析所需添加饱

32、和硫酸铵体积式： 温度和温度和pHpH一定时，一定时，SoSo为常数，为常数， 33 l 不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极 性基团的种类、数目以及排布的不同，其水性基团的种类、数目以及排布的不同，其水 化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不 一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使 不同的蛋白质分别沉淀。如：不同的蛋白质分别沉淀。如： 血清血清 球蛋白球蛋白 清蛋白清蛋白 ( (NHNH4 4) )2 2SOSO4 4 50%50%饱和度饱和度 饱和饱和 析出析出 析出析出 分段盐

33、析分段盐析 34 l常用的盐析剂是硫酸铵，因为它的盐析能力强，常用的盐析剂是硫酸铵，因为它的盐析能力强， 在水中的溶解度大，价格便宜，浓度高时也不在水中的溶解度大，价格便宜，浓度高时也不 会引起蛋白质活性丧失。会引起蛋白质活性丧失。 l 盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活 性。性。 l蛋白质用盐析方法沉淀分离后，还需要脱盐才蛋白质用盐析方法沉淀分离后，还需要脱盐才 能进一步精提纯。脱盐常用能进一步精提纯。脱盐常用透析法透析法。 透析透析是将含有小分子杂质是将含有小分子杂质 的蛋白质溶液装在半透膜（的蛋白质溶液装在半透膜（ 玻璃纸、火绵纸等）制的透玻

34、璃纸、火绵纸等）制的透 析袋里放在蒸馏水中进行，析袋里放在蒸馏水中进行， 可不断更换蒸馏水，直至杂可不断更换蒸馏水，直至杂 质被除去。质被除去。 透析袋透析袋 蛋白质溶液蛋白质溶液 蒸馏水蒸馏水 35 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同 的两性电解质（如酶、蛋白质、氨基酸等）具有不的两性电解质（如酶、蛋白质、氨基酸等）具有不 同的等电点这一特性进行分离纯化的方法。同的等电点这一特性进行分离纯化的方法。 等电点时，分子表面的水膜仍然存在，使酶和蛋白等电点时，分子表面的水膜仍然存在，使酶和蛋白 质仍有一定的溶解度而沉淀不完全。故常用于粗酶质仍有

35、一定的溶解度而沉淀不完全。故常用于粗酶 液中除杂和与其它方法联系使用。液中除杂和与其它方法联系使用。 二、等电点沉淀法二、等电点沉淀法 36 图图 例例 37 介电常数介电常数 溶质分子之溶质分子之 间的引力间的引力 溶解度溶解度 有机溶剂有机溶剂 溶质分子周围的水膜破坏溶质分子周围的水膜破坏 酶和蛋白质的氢键破坏酶和蛋白质的氢键破坏 空间结构变化空间结构变化 形成疏水层形成疏水层 三、有机溶剂的沉淀法三、有机溶剂的沉淀法 利用酶等物质在有机溶液中的溶解度不同而使之分离的方法。利用酶等物质在有机溶液中的溶解度不同而使之分离的方法。 介电常数介电常数permittivity permittivi

36、ty 亦称相对电容率。是指在同一容器亦称相对电容率。是指在同一容器 中用某一物质为电介质和真空时的电容的比值。介电常数通常中用某一物质为电介质和真空时的电容的比值。介电常数通常 随温度和介质中传播的电磁波的频率而变。电介质的介电常数随温度和介质中传播的电磁波的频率而变。电介质的介电常数 越大，极化能力越强；介电常数越小，绝缘性能越好。用越大，极化能力越强；介电常数越小，绝缘性能越好。用rr 表示表示 38 （1 1）所析出酶沉淀比盐析法析出的易于）所析出酶沉淀比盐析法析出的易于 离心分离或过滤；离心分离或过滤； （2 2）不含无机盐，适于食品工业用酶制）不含无机盐，适于食品工业用酶制 剂的制备

37、；剂的制备； （3 3）易于除去或回收。）易于除去或回收。 优点：优点： 缺点：缺点： 易于引起酶的变性失活，需低温操作和沉淀易于引起酶的变性失活，需低温操作和沉淀 析出后尽快分离。析出后尽快分离。 39 酶酶+ +酶沉淀剂酶沉淀剂 复合物沉淀复合物沉淀 分离分离 从复合物中析出酶从复合物中析出酶 四、复合沉淀法四、复合沉淀法 常用的酶沉淀剂：常用的酶沉淀剂： 单宁（加入量为酶液的单宁（加入量为酶液的0.11%0.11%。）。） 聚丙烯酸（聚丙烯酸（3040%3040%）等高分子聚合物）等高分子聚合物 40 l使杂蛋白变性沉淀，而酶不受影响；使杂蛋白变性沉淀，而酶不受影响； l热稳定性好的，可

38、进行热处理；热稳定性好的，可进行热处理； l改变改变pHpH或加入某些金属离子使杂蛋白除去；或加入某些金属离子使杂蛋白除去； back 41 离心：借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大离心：借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大 小、密度的物质分离的技术；小、密度的物质分离的技术； 要根据欲分离物质及杂质的大小、密度和特性的不要根据欲分离物质及杂质的大小、密度和特性的不 同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。 42 1 1、常速离心机、常速离心机 最大转速最大转速80008000rpm(r/min),rpm(r/min),相对离心力相对离心力 (

39、RCF)10(RCF)104 4g g以下以下, ,用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等分离；用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等分离； 2 2、高速（冷冻）离心机、高速（冷冻）离心机 1 110104 4-2.5-2.510104 4rpmrpm，相对离心力，相对离心力 10104 410105 5g,g,用于沉淀、细胞器等分离；用于沉淀、细胞器等分离； 3 3、超速离心机、超速离心机 转速转速2.52.5-8-810104 4rpmrpm，相对离心力相对离心力5 5* *10105 5g g；用；用 于于DNADNA、RNARNA蛋白质及细胞器病毒分离纯化；检测纯度；沉降蛋白质及细胞器病毒分离纯化

40、；检测纯度；沉降 系数和相对分子量测定等。系数和相对分子量测定等。 l分制备用、分析用、制备及分析用三种。分析用超速离心机分制备用、分析用、制备及分析用三种。分析用超速离心机 装有光学检测系统、自动记录系统、数据处理系统；装有光学检测系统、自动记录系统、数据处理系统； 一、离心机的种类与用途一、离心机的种类与用途 43 台式高、台式高、 超速离心超速离心 机机 0.6-100.6-10万万 转转/ /分以分以 上上 离心机离心机 制备性制备性分析性分析性 分析性超速离心机分析性超速离心机 普通离心机普通离心机冰冻离心机冰冻离心机 台式（或地台式（或地 面式）普通面式）普通 离心机离心机 大容量

41、冰大容量冰 冻离心机冻离心机 小于小于0.60.6万万 转转/ /分分 高速冰冻高速冰冻 离心机离心机 0.6-2.50.6-2.5 万万 超速冰冻超速冰冻 离心机离心机 2.5-82.5-8万或万或 更高更高 ( (分析性超速离心主要用于分析性超速离心主要用于 检测大分子物质的沉降特检测大分子物质的沉降特 征和结构等征和结构等) ) 概述概述 44 45 46 47 所分离的颗粒大小和密度相差较大所分离的颗粒大小和密度相差较大: :常速、高速离心常速、高速离心; ; 若从样品液中分离若从样品液中分离2 2种以上大小和密度不同的颗粒：差速离心种以上大小和密度不同的颗粒：差速离心; ; 超速离心

42、超速离心: :差速离心法和密度梯度离心法，后者又分速率区带离差速离心法和密度梯度离心法，后者又分速率区带离 心和等密度离心。心和等密度离心。 二、离心方法的选用二、离心方法的选用 1、差速离心、差速离心 采用不同离心速度与时间，使不同沉降速度的颗采用不同离心速度与时间，使不同沉降速度的颗 粒分批分离；粒分批分离； 48 已破碎的细胞已破碎的细胞 沉淀（细胞核）沉淀（细胞核） 上清液上清液 沉淀（细胞膜碎片、沉淀（细胞膜碎片、 线粒体、溶酶体）线粒体、溶酶体） 上清液上清液 沉淀（核糖核蛋白体）沉淀（核糖核蛋白体） 上清液上清液 （可溶性组分）（可溶性组分） 500500g,10 10 0001

43、0 000g,10 100 000100 000g,3h 49 2、密度梯度离心、密度梯度离心 又称又称速率速率区带离心区带离心,沉降系数较接近的物质分离的方法；沉降系数较接近的物质分离的方法； 原理原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力 作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区 域上形成区带的方法。域上形成区带的方法。 介质梯度应预先形成，介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。 常用的有蔗糖、甘油；常用的有蔗糖、甘油； 密度

44、梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密 度梯度；度梯度； 操作：离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心形成区带。操作：离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心形成区带。 离心后不同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯离心后不同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯 度液中形成若干条界面清楚的不连续区带；度液中形成若干条界面清楚的不连续区带； 可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分 密度升高密度升高 50 3、等密度离心、等密度离心 原理原理

45、：当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下， 在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起， 一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成 区带，从而使不同浮力密度的物质得到分离区带，从而使不同浮力密度的物质得到分离； 区别区别:离心介质、密度梯度范围与密度梯度离心不同，离心介质、密度梯度范围与密度梯度离心不同，欲分离的颗欲分离的颗 粒密度处于离心介质密度范围内。粒密度处于离心介质密度范围内。 介质有：氯化铯、硫酸铯、溴化铯、三碘苯衍生物等。介质有：氯化铯、硫

46、酸铯、溴化铯、三碘苯衍生物等。 操作：介质溶液与样品液混合均匀，足够时间离心。操作：介质溶液与样品液混合均匀，足够时间离心。 介质梯度不需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样品混合后介质梯度不需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样品混合后 装入离心管，装入离心管，通过离心形成梯度通过离心形成梯度，让颗粒在梯度中进行再分配。，让颗粒在梯度中进行再分配。 常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。 密度梯度密度梯度 51 低速离心用低速离心用rpmrpm表示，表示， 高速、超高速离心用相对离心力（高速、超高速离心用相对离心力（RCFRCF）表示。表示。 三、离心条

47、件的确定三、离心条件的确定 1 1、离心力、离心力 离心力离心力 离心加速度离心加速度 相对离心力相对离心力 （RCF） 52 2 2、离心时间、离心时间 不同离心方法，离心时间的概念不同。不同离心方法，离心时间的概念不同。 对常数离心、高速离心、差速离心对常数离心、高速离心、差速离心, ,指颗粒完全指颗粒完全 沉降到离心管底的时间沉降到离心管底的时间, ,沉降时间或澄清时间沉降时间或澄清时间; ; 等密度梯度离心等密度梯度离心, ,指颗粒完全到达等密度点时平指颗粒完全到达等密度点时平 衡时间，衡时间，平衡时间平衡时间; ; 对密度梯度对密度梯度, ,指形成界限分明区带的时间，指形成界限分明区

48、带的时间，区带区带 形成时间形成时间; ; 53 沉降时间沉降时间 沉降系数已知颗粒沉降系数已知颗粒 效率因子效率因子K S S：沉降系数；：沉降系数；: :角速度；角速度； r1r1，r2:r2:转轴中心到液面与管底距离。转轴中心到液面与管底距离。 K K与转子半径和转速有关；与转子半径和转速有关； 实际操作中：实际操作中： 1 1，某一颗粒，某一颗粒S S定值，故定值，故K K小，小，t t也小，效率高（转子的选择）；也小，效率高（转子的选择）； 2,2,转子与离心机确定，具体颗粒而言，转子与离心机确定，具体颗粒而言，2 2t t是常数，故可调整是常数，故可调整 与与t t得相同效果。得相

49、同效果。 指颗粒从样品液面完全沉降到离心管底所需的时间指颗粒从样品液面完全沉降到离心管底所需的时间; ; 决定于沉降速度和沉降距离。决定于沉降速度和沉降距离。 54 一般为一般为4 4o oC C。 稳定性好的酶，可取室温；稳定性好的酶，可取室温； 超高速离心需冷冻。超高速离心需冷冻。 pHpH值应处于酶稳定的值应处于酶稳定的pHpH范围。范围。 3 3、温度和、温度和pH值值 55 过滤过滤 借助过滤介质将大小不同，形状不同的物借助过滤介质将大小不同，形状不同的物 质分离的技术质分离的技术 介质有滤纸、纤维、陶瓷、高分子膜等。介质有滤纸、纤维、陶瓷、高分子膜等。 以膜为过滤介质的过滤称以膜为

50、过滤介质的过滤称膜分离膜分离技术；技术； 微滤、超滤、反渗透、透析、电渗析都属微滤、超滤、反渗透、透析、电渗析都属 于膜分离技术于膜分离技术 56 表表4-4 4-4 过滤的分类与特性过滤的分类与特性 （P112P112） 类别类别 截留的颗粒大小截留的颗粒大小 主要物质主要物质 过滤介质过滤介质 粗滤粗滤22umum 酵母、霉菌、动植物细酵母、霉菌、动植物细 胞、固形物胞、固形物 滤纸、滤布、纤滤纸、滤布、纤 维、多孔陶瓷维、多孔陶瓷 微滤微滤0.220.22umum 细菌、灰尘细菌、灰尘微滤膜微滤膜 超滤超滤2020A0.2umA0.2um 病毒、生物大分子病毒、生物大分子超滤膜超滤膜 反

51、渗透反渗透2020A A 生物小分子、生物小分子、 盐、离子盐、离子 反渗透膜反渗透膜 57 截留颗粒直径大于截留颗粒直径大于2 2m,m,用于分离酵母、霉菌、动植物细胞、培用于分离酵母、霉菌、动植物细胞、培 养基残渣等。过滤介质有滤纸、滤布、多孔陶瓷等。养基残渣等。过滤介质有滤纸、滤布、多孔陶瓷等。 (1)(1)常压过滤常压过滤 以液位差为推动力，易操作，分离效果差，难成规模。以液位差为推动力，易操作，分离效果差，难成规模。 (2)(2)加压过滤加压过滤 以压力泵或压缩空气为推动力。效果较好，生产上应用广泛。以压力泵或压缩空气为推动力。效果较好，生产上应用广泛。 (3)(3)减压过滤减压过滤 真空过滤、抽滤。多用于粘性不大的物料。真空过滤、抽滤。多用于粘性不大的物料。 1 1、粗滤、粗滤 l微孔过滤微孔过滤, ,截留颗粒直径截留颗粒直径0.20.22 2m m，光学显微镜可见，光学显微镜可见