高中生物 5.3《血红蛋白的提取和分离》教案5 新人教版选修1

1、课题3 血红蛋白的提取和分离课题课题3 血红蛋白的提取和分离备课时间上课时间总课时数课程目标知识与技能1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理过程与方法体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤情感态度与价值观初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神教学重点凝胶色谱法的原理和方法教学难点样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填教学过程二次备课一、情境导入蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化和物。对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取蛋白质呢？二、

2、授新课1基础知识蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。11凝胶色谱法（分配色谱法）：（1）原理：（图513a）分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。（3）分离过程：（图513b）混合物上柱洗脱大分子流动快、小分子流动慢收集大分子收集小分子洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。12缓冲溶液（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3NaHCO3，HCNaC，NaH2PO4

3、/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。13凝胶电泳法：（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。思考阅读教材后，填写下表：决定运动方向形成库仑力形成阻力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。2实验设计2.

4、1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。思考：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？不是。因为蛋白质的来源和性质不同，分离方法差别很大。2.2选择实验材料（1）你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高。（2）请阅读教材，认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。并思考回答下列问题：血液由 和 两部分组成。血细胞中 细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是 。该化合物是由 和 构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的 基团。2.3从红细胞中分离出血红蛋白的过程为

5、：洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。洗涤红细胞的目的是什么？除去血浆蛋白的杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。红细胞的洗涤过程为血液柠檬酸钠低速短时离心吸出上层血浆红细胞5倍体积生理盐水 缓慢搅拌10min低速短时离心吸出上清液反复洗涤直至上清液无黄色思考：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。思考：你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？加入蒸馏水，用玻璃棒快速搅拌一段时间。补充：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。此时，红细胞破碎

6、混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。怎样除去这些杂质呢？由于它们的密度不同，科学家采取了离心分离的方法：红细胞破碎混合液中速长时离心（2000c/min10min）滤纸过滤除去脂质分液漏斗分离出血红蛋白2.4如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？。透析。半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH7的磷酸缓冲液中。思考：为何使用pH7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。总结：通过以上四个基本过程，

7、红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等）。怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢？我们来研究蛋白质提取和分离的第二个步骤粗分离（凝胶色谱操作）。2.5凝胶色谱分离蛋白质包括：制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和洗脱。根据教材图519，说出制作色谱柱需要的材料。橡皮塞2个、打孔器、小刀、移液管、尼龙纱、尼龙网、玻璃管、尼龙管等。色谱柱的制作过程：准备材料加工橡皮塞安装色谱柱下面进行第二步凝胶色谱柱的装填。请阅读教材：色谱柱的装填过程。步骤操作要求操作要求色谱柱垂直固定在支架上计算称量凝胶根据色谱柱体积计算凝胶用量配制悬浮液凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀凝胶颗粒洗脱液沸水浴装

8、填悬浮液一次性缓慢倒入；轻轻敲打缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h样品加入和洗脱。其基本过程是：调节缓冲液面加入蛋白质样品调节缓冲液面洗脱收集分装蛋白质至此，血红蛋白即可得到粗分离。在整个操作过程中，应当注意以下事项：（1）红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。（2）凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡（3）色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。（4）色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。三、当堂反馈例1 利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来（ ）A.相对分子质量大的 B.溶解度高的C.相对分子量小的 D.所代电荷多的解析：凝

9、集色谱法使根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。答案：A例2 蛋白质提取和分离分为哪几步（ ）A.样品处理、凝胶色谱操作、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳B.样品处理、凝胶色谱操作、纯化C.样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定D.样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定解析：蛋白质的提取和分离分为样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定四步。A中凝胶色谱操作及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳为实验操作过程中的技术。答案：C四、课堂小结血红蛋白的取和分离凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴