HPLC在药物分析中的应用

1、HPLC在药物分析中的应用 中国药科大学药物分析教研室 狄 斌 HPLC在药物分析中的应用n药品的质量控制n西药、中药n生物样本中药物浓度的测定药品的质量控制n药物分析方法的特点n方法的准确性、专属性、实用性nHPLC在新药质量控制中的应用n有关物质检查n含量测定n手性药物中对映体杂质的检查n中药分析有关物质的来源有关物质的来源n合成、制剂、贮藏、运输、使用，每一合成、制剂、贮藏、运输、使用，每一过程都有可能产生有关的物质，如生产过程都有可能产生有关的物质，如生产中可能带入起始原料、试剂、中间体、中可能带入起始原料、试剂、中间体、副产物和异构体等；在贮藏和运输过程副产物和异构体等；在贮藏和运输

2、过程中，可能产生降解产物、聚合物或晶型中，可能产生降解产物、聚合物或晶型转变等特殊杂质。转变等特殊杂质。初步判断能否用HPLC法进行有关物质检查n化合物结构：样品、已知或未知杂质n现有的设备条件：检测器、色谱柱n方法建立后的实用性示例N-甲基吡咯烷甲基吡咯烷n色谱条件 以电导检测器为检测器：柱子为内径4mm，长度5cm的不锈钢管，以每克含磺酸基0.3meq的5m的亲水性硅胶为填充剂；以稀硝酸(取300ml硝酸,加水稀释至100000ml)-乙腈(60:40)为流动相；柱温为35；流速为每分钟1.5ml,取对照液100L,重复5次进样,峰面积的相对标准偏差不得过5.0%；续上文n取氯化钠60mg

3、,置于100ml的容量瓶中,加入N-甲基吡咯烷溶液(取N-甲基吡咯烷125mg,溶于20ml的水中,加水至100ml，取4ml溶液，加上述稀硝酸至100ml；另取氯化钠60mg同前法配液，各取溶液100加入后溶液中，混匀，测定，其分离不小于2.0。.N-甲基吡咯.jpg选择有关物质检查的方法选择有关物质检查的方法n有关物质的量微小，故检测方法至关重有关物质的量微小，故检测方法至关重要，必须选择专属性强、灵敏度高、重要，必须选择专属性强、灵敏度高、重复性好的方法。复性好的方法。n首选的是色谱法：首选的是色谱法：TLC，HPLC及及GC等，等，必要时可采用必要时可采用HPLC/DAD、HPLC/M

4、S等联用技术，对有关物质进行定性定量等联用技术，对有关物质进行定性定量分析。分析。色谱条件的初步选择色谱条件的初步选择n文献调研.risedronate.docn色谱仪器的选择n色谱柱的选择METHOD-DEVEL.PPTn流动相的选择n检测波长的选择:待测样品、中间体、降解物n评价指标n信息反馈虚拟试验1.ppt研究方法的专属性研究方法的专属性n如有关物质为已知的某中间体、副产物或降如有关物质为已知的某中间体、副产物或降解产物，则可在原料药中加入该杂质适量进行解产物，则可在原料药中加入该杂质适量进行试验，以证明能达到分离；试验，以证明能达到分离；n如有关物质为未知，可用含有杂质的多批粗如有关

5、物质为未知，可用含有杂质的多批粗品进行试验，以证明能达到分离；品进行试验，以证明能达到分离；n将精制品经强光、高温、高湿、氧化剂或酸将精制品经强光、高温、高湿、氧化剂或酸碱等分别处理，使样品光解、分解、氧化或水碱等分别处理，使样品光解、分解、氧化或水解后进行试验，以证明能分离出杂质。解后进行试验，以证明能分离出杂质。n处理过程应定量处理过程应定量n.st.doc，信息反馈研究方法的灵敏度研究方法的灵敏度n在研究的方法具有专属性后，应考虑方在研究的方法具有专属性后，应考虑方法的灵敏度。一般使最低检出量相当于法的灵敏度。一般使最低检出量相当于基线噪音的基线噪音的3倍峰高时注入的样品量。倍峰高时注入

6、的样品量。n样品、已知杂质和中间体的灵敏度样品、已知杂质和中间体的灵敏度定性和定量的依据定性和定量的依据n已知对照品的方法已知对照品的方法n定性和定量有充分依据定性和定量有充分依据n自身对照法自身对照法n峰面积归一化法峰面积归一化法n若需采用峰面积归一化法若需采用峰面积归一化法色谱图的要求色谱图的要求要求要求1、n色谱图的基线应平稳，最好进样前进行色谱图的基线应平稳，最好进样前进行斜率测试斜率测试.基线及斜率基线及斜率.jpg要求要求2、n在在HPLC分析中，有关物质的保留时间可分析中，有关物质的保留时间可能在主成分峰之后出现，同时应视降解能在主成分峰之后出现，同时应视降解物或中间体的出峰位置

7、而定，故记录时物或中间体的出峰位置而定，故记录时间一般应比主成分峰的保留时间延长间一般应比主成分峰的保留时间延长23倍。倍。要求要求3、n应考虑样品配制浓度或进样量致使主成应考虑样品配制浓度或进样量致使主成分峰为一矩形峰，以确保样品中的有关分峰为一矩形峰，以确保样品中的有关物质能全部检出。应按照中国药典的要物质能全部检出。应按照中国药典的要求用对照溶液调节仪器灵敏度。求用对照溶液调节仪器灵敏度。要求要求4、n提供的图谱应有样品批号、数据采集时提供的图谱应有样品批号、数据采集时间、保留时间，文字说明，和各峰积分间、保留时间，文字说明，和各峰积分值。值。D:手动积分问题手动积

8、分问题n保证基线平稳积分、斜率合适n应尽量避免手动积分，以保证积分结果的真实性、原始性色谱图前后相关性色谱图前后相关性n样品研究中的有关物质与制订标准中的样品研究中的有关物质与制订标准中的有关物质应相关有关物质应相关n若合成工艺或制剂工艺改动应重新考察若合成工艺或制剂工艺改动应重新考察方法的专属性。方法的专属性。说明有关物质的个数及其总量说明有关物质的个数及其总量n在研究并确定了有关物质数和量的基础在研究并确定了有关物质数和量的基础上，应对若干批工艺稳定后的产品进行上，应对若干批工艺稳定后的产品进行分析，积累数据，对有关物质订出个数，分析，积累数据，对有关物质订出个数，并对主要有关物质、未知及

9、总的有关物并对主要有关物质、未知及总的有关物质分别订出限量，以保证产品质量。质分别订出限量，以保证产品质量。溶剂峰的问题溶剂峰的问题n进样阀的清洗n注入溶剂n流动相配制的样品是否有溶剂峰制剂中有关物质检查制剂中有关物质检查n首先，对制剂在筛选处方时，应考虑辅料与主首先，对制剂在筛选处方时，应考虑辅料与主药能否配伍，是否影响稳定性，有无干扰质量药能否配伍，是否影响稳定性，有无干扰质量检测；在制备过程中和贮藏期间是否会使主药检测；在制备过程中和贮藏期间是否会使主药降解、聚合或转晶等。由于影响因素较多，因降解、聚合或转晶等。由于影响因素较多，因此，对制剂一般应以原料药确立的有关物质检此，对制剂一般应

10、以原料药确立的有关物质检查方法，对其有关物质进行检查研究。查方法，对其有关物质进行检查研究。n如原料药较稳定，制剂经考察研究亦较稳定者，如原料药较稳定，制剂经考察研究亦较稳定者，可考虑该制剂不必再检查有关物质；但有些原可考虑该制剂不必再检查有关物质；但有些原料药稳定的药物，经加工制成制剂后，有关物料药稳定的药物，经加工制成制剂后，有关物质有增加；或有的原料药本身稳定性较差，对质有增加；或有的原料药本身稳定性较差，对其制剂则均应检查有关物质，并订出限量。其制剂则均应检查有关物质，并订出限量。含量测定方法的建立含量测定方法的建立方法验证的项目方法验证的项目n专属性n线性n范围n准确度n精密度n检测

11、限 LODn定量限 LOQn耐用性n系统适用性试验：理论板数、分离度、对称因子nICH3-7Q2B.PDF nICH3-7Q2A.PDF内标法与外标法的选择内标法与外标法的选择n原料药及其制剂目前一般选用外标法n生物样本多选用内标法n中药分析视情况而定含量测定与有关物质检查的关系n含量测定方法尽可能与有关物质检查方法一致n在严格控制有关物质的前提条件下，含量测定方法可不与有关物质检查方法一致n例.Finasteride.doc其他问题n含量测定的浓度n操作步骤的简化手性药物的分离和测定nHPLC的不可被替代地位n直接法n手性流动相法n手性固定相法n间接法n衍生化法例1、氧氟沙星对映体的分离n手

12、性流动相法n采用普通的C18柱，n氧氟沙星对映体.jpg例2、那格列奈中有关物质及异构体分析方法的研究 那格列奈.pptn酒石酸衍生物手性固定相酒石酸衍生物手性固定相HPLCHPLC法拆分那格列奈法拆分那格列奈其他方法色谱条件与系统适用性试验色谱条件与系统适用性试验nKromasil CHI-DMB(250mmKromasil CHI-DMB(250mm4.6mm4.6mm） n流动相流动相: :正己烷正己烷异丙醇异丙醇冰醋酸（冰醋酸（9550.19550.1）n流速流速0.5ml/min0.5ml/min，柱温，柱温2020 方法学研究方法学研究n线性关系考核线性关系考核L L- -那那格格

13、列列奈奈A4.60104C+8.121021.0126.027 g/mlr 0.9997Cis-Cis-那格列奈那格列奈A4.54104C+1.041031.0046.024g/mlr 0.9997回收率试验回收率试验L-L-那格列奈那格列奈 99.14% RSD(%)=1.76%Cis-Cis-那格列奈那格列奈 99.82% RSD(%)=2.52%n进样精密度试验进样精密度试验n检测限检测限n那格列奈中立体异构体及那格列奈中立体异构体及光学异构体杂质的检查光学异构体杂质的检查讨讨 论论n 流动相体系中适量的异丙醇的加入，可改善流动相体系中适量的异丙醇的加入，可改善峰形，提高分离度，但加入量

14、太多，分离度下峰形，提高分离度，但加入量太多，分离度下降。这是由于手性固定相结构中带有酰胺基团、降。这是由于手性固定相结构中带有酰胺基团、酯羰基和取代苯基，可以与对映体之间产生较酯羰基和取代苯基，可以与对映体之间产生较强的氢键作用和强的氢键作用和-电子相互作用，其中氢键电子相互作用，其中氢键作用对对映体的分离产生的影响较强。当加入作用对对映体的分离产生的影响较强。当加入适量异丙醇可使氢键作用达到最佳值，峰形改适量异丙醇可使氢键作用达到最佳值，峰形改善分离度提高，但随着流动相中的异丙醇量增善分离度提高，但随着流动相中的异丙醇量增大，它与固定相之间产生的氢键作用将抑制对大，它与固定相之间产生的氢键

15、作用将抑制对映体与固定相之间的相互作用，从而使对映体映体与固定相之间的相互作用，从而使对映体的保留减弱，容量因子和分离度同时减小。的保留减弱，容量因子和分离度同时减小。例例3 3 蛋白质类蛋白质类手性固定相手性固定相HPLCHPLC法拆分法拆分 1-1-乙氧甲酰基乙氧甲酰基-3-3-苯丙基苯丙基-L-L-丙氨酸丙氨酸 对映体的方法研究对映体的方法研究1-1-乙氧甲酰基乙氧甲酰基-3-3-苯丙基苯丙基-L-L-丙氨丙氨酸的结构式酸的结构式C CH H2 2C CH H2 2C CN NH HC CO OO OC C2 2H H5 5H HC CC CO OO OH HC CH H3 3H H色谱

16、条件的确立色谱条件的确立n流动相中缓冲盐类型及浓度对分离流动相中缓冲盐类型及浓度对分离的影响的影响n流动相流动相pHpH值对分离的影响值对分离的影响n有机溶剂的加入对分离的影响有机溶剂的加入对分离的影响n柱温对分离的影响柱温对分离的影响n流速对分离的影响流速对分离的影响n最佳色谱条件最佳色谱条件流动相中缓冲盐类型及浓度对流动相中缓冲盐类型及浓度对分离的影响分离的影响C Co on nc ce en nt tr ra at ti io on nT TR R- -（m mi in n）T TS S- -（m mi in n）5 50 0m mm mo ol l/ /L LN Na a2 2H HP

17、 PO O4 49 9. .6 63 35 51 10 0. .3 32 27 74 40 0m mm mo ol l/ /L LN Na a2 2H HP PO O4 49 9. .9 93 33 31 11 1. .4 43 35 53 30 0m mm mo ol l/ /L LN Na a2 2H HP PO O4 41 12 2. .2 21 13 31 14 4. .8 81 17 71 10 0m mm mo ol l/ /L LN Na a2 2H HP PO O4 41 13 3. .7 77 75 51 16 6. .5 54 42 21 10 0m mm mo ol l/

18、 /L LN Na a2 2H HP PO O4 4+ +1 10 0m mm mo ol l/ /L LN Na aH H2 2P PO O4 42 22 2. .0 08 87 72 26 6. .7 79 93 31 15 5m mm mo ol l/ /L LN Na a2 2H HP PO O4 4+ +5 5m mm mo ol l/ /L LN Na aH H2 2P PO O4 43 35 5. .9 97 78 83 38 8. .7 70 05 55 5m mm mo ol l/ /L LN Na a2 2H HP PO O4 4+ +5 5m mm mo ol l/ /L

19、 L N Na aH H2 2P PO O4 43 34 4. .7 78 84 41 1. .6 62 25 5流动相流动相pHpH值对分离的影响值对分离的影响p pH HT TR R- -（m mi in n）T TS S- -（m mi in n）5 5. .0 02 27 7. .2 29 98 8. .4 41 17 76 6. .0 00 01 17 7. .3 34 45 52 22 2. .0 04 45 56 6. .2 28 82 26 6. .9 93 32 23 32 2. .5 57 77 7. .0 00 02 28 8. .5 54 45 54 44 4. .1

20、17 73 3柱温对分离的影响柱温对分离的影响T Te em mp pe er ra at tu ur re e（）T TR R- -（m mi in n）T TS S- -（m mi in n）3 35 51 17 7. .0 07 75 52 20 0. .7 75 57 73 30 01 17 7. .1 16 67 72 21 1. .1 12 22 22 20 01 17 7. .3 34 45 52 22 2. .0 04 45 51 10 01 18 8. .2 24 42 22 23 3. .5 58 88 8最佳色谱条件最佳色谱条件 5mmol/L5mmol/L 磷酸二氢钠磷

21、酸二氢钠5mmol/L5mmol/L 磷酸氢二钠磷酸氢二钠（1 11 1，以磷，以磷酸调节酸调节 pHpH 至至 6.286.28） ；柱温为） ；柱温为 1010；流速为；流速为 1.0ml/min1.0ml/min样品浓度对分离的影响样品浓度对分离的影响讨讨 论论n 与通常固定相相比，蛋白质分子尺度大，对硅胶担体的与通常固定相相比，蛋白质分子尺度大，对硅胶担体的覆盖有限，再加上每一蛋白质分子含有的对映体选择性相互覆盖有限，再加上每一蛋白质分子含有的对映体选择性相互作用点的数目很少，所以其样品的负载量小。作用点的数目很少，所以其样品的负载量小。n 蛋白质手性固定相色谱类似于亲和色谱，对映体与

22、蛋白蛋白质手性固定相色谱类似于亲和色谱，对映体与蛋白质通过疏水作用力和库仑作用力相互结合，进行对映体的手质通过疏水作用力和库仑作用力相互结合，进行对映体的手性识别。对映体进入色谱柱后先以强的库仑作用力与蛋白质性识别。对映体进入色谱柱后先以强的库仑作用力与蛋白质固定相结合，而固定相结合，而S-S-体比体比R-R-体结合的更稳定，当蛋白质分子上体结合的更稳定，当蛋白质分子上有限的作用点被完全结合后，多余的有限的作用点被完全结合后，多余的R-R-体就以疏水作用力与体就以疏水作用力与蛋白质结合，当浓度增加时，超出了固定相的负载量的那一蛋白质结合，当浓度增加时，超出了固定相的负载量的那一部分单体的存在，

23、增加了体系的离子强度，使疏水作用力增部分单体的存在，增加了体系的离子强度，使疏水作用力增加因此这部分单体迁移时间缩短，出峰提前。加因此这部分单体迁移时间缩短，出峰提前。例4、某新药对映体的分离n采用环糊精柱.smd.jpgHPLC在中药分析中的应用n中药原料及制剂的质量控制n特点：峰的复杂性、峰数目的不确定性、峰面积的变化较大n含量测定、鉴别、纯品的制备示例n 复方中西药制剂中两种微量复方中西药制剂中两种微量西药成分的同时测定西药成分的同时测定喘喘息息灵灵胶胶囊囊是是一一种种止止咳咳，平平喘喘药药，为为复复方方中中西西药药物物制制剂剂, ,由由五五味味中中药药何何首首乌乌，甘甘草草，知知母母，

24、马马兜兜铃铃和和五五味味子子两两种种西西药药盐盐酸酸克克仑仑特特罗罗（4 46 6g g/ /0 0. .2 29 9g g）和和马马来来酸酸氯氯苯苯那那敏敏（0 0. .8 81 1. .2 2m mg g/ /0 0. .2 29 9g g）制制成成n要排除五味中药提取物对测定的干扰要排除五味中药提取物对测定的干扰n要准确测定药物中微量的盐酸克仑特罗要准确测定药物中微量的盐酸克仑特罗的含量的含量n要对两种含量相差要对两种含量相差200200倍的物质同时进行倍的物质同时进行定量测定定量测定难点难点条条件件的的选选择择n波长的选择波长的选择n流动相的选择流动相的选择n内标物的选择内标物的选择n

25、提取条件的确立提取条件的确立波长的选择波长的选择n流动相的选择流动相的选择流流动动相相条条件件色色谱谱图图中中分分离离情情况况乙乙睛睛- -0 0. .0 05 5m mo ol l/ /L L 磷磷酸酸二二氢氢钾钾溶溶液液（含含 0 0. .2 2% %三三乙乙胺胺， 0 0. .0 00 05 5m mo ol l/ /L L 己己烷烷磺磺酸酸钠钠，用用磷磷酸酸溶溶液液调调节节 p pH H 值值至至 3 3. .0 0） （6 60 0：4 40 0） ，只只能能测测定定马马来来酸酸氯氯苯苯那那敏敏乙乙睛睛- -0 0. .0 05 5m mo ol l/ /L L 磷磷酸酸二二氢氢钾钾

26、溶溶液液（0 0. .0 00 05 5m mo ol l/ /L L 己己烷烷磺磺酸酸钠钠，用用磷磷酸酸溶溶液液调调节节 p pH H 值值至至 4 4. .0 0） （2 20 0：8 80 0） ，出出峰峰晚晚，两两主主峰峰间间距距较较大大且且马马来来酸酸氯氯苯苯那那敏敏拖拖尾尾严严重重乙乙睛睛- -0 0. .0 05 5m mo ol l/ /L L 磷磷酸酸二二氢氢钾钾溶溶液液（含含 0 0. .5 5% %三三乙乙胺胺， 0 0. .0 00 05 5m mo ol l/ /L L 己己烷烷磺磺酸酸钠钠，用用磷磷酸酸溶溶液液调调节节 p pH H 值值至至 3 3. .0 0）2

27、 20 0：8 80 0，两两主主峰峰间间距距缩缩小小且且峰峰形形改改善善但但出出峰峰晚晚乙乙睛睛- -0 0. .0 05 5m mo ol l/ /L L 磷磷酸酸二二氢氢钾钾溶溶液液（含含 0 0. .5 5% %三三乙乙胺胺， 0 0. .0 00 05 5m mo ol l/ /L L 己己烷烷磺磺酸酸钠钠，用用磷磷酸酸溶溶液液调调节节 p pH H 值值至至 3 3. .0 0）2 29 9：7 71 1，出出峰峰提提前前，峰峰形形好好，且且能能与与辅辅料料干干扰扰物物完完全全分分离离内标法含量测定内标法含量测定n溶液配制溶液配制n线性关系考核线性关系考核n中药共存时线性关系的考核中药共存时线性关系的考核n进样精密度试验进样精密度