高产植酸酶菌株的选育和培养条件的研究-微生物学专业论文

1、优秀毕业论文西北大学硕士学位论文高产植酸酶菌株的选育和培养条件的研究姓名：张卫兵申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：郭爱莲20040601精品参考文献资料摘要从200多个自然样品中，分离、筛选出一株产植酸酶的曲霉，其植酸酶产量为5868 IUml。经鉴定后定名为黑曲霉Px。 对黑曲霉Px原生质体的形成和再生条件进行了研究。结果表明：在液体培养条件下培养18小时的菌丝，用O3B一巯基乙醇与酶液同时处理，采用pH50 的混合酶(蜗牛酶：纤维素酶=7：3)；在34。C酶解25h；用O7molL的氯化钠为 渗透压稳定剂时，原生质体形成数和再生率均达到最高，分别为97X 105个rot和282。对

2、黑曲霉Px的粗酶液的性质作了研究：该酶作用的最适温度为45；最 适pH为5；该酶在55。C、pH为37时，相对酶活大于80；金属离子zn2+、 AL”、Mn2+、Cu2+等对该酶有较强的抑制作用，而M92+则有一定的激活作用。以黑曲霉Px为出发菌株，分别对其孢子和原生质体进行诱变，选育出高产菌株Py的植酸酶产量为9274 IUml，是出发菌株的158倍。利用PlackcttBurman设计筛选出黑曲霉Py培养基中的重要影响因素，然后利 用正交试验设计和响应面分析法对这些重要因素进一步优化，得出其优化培养基成分为：蛋白胨O3，葡萄糖257，州H4)2S04 0299，MgS047H20 005，

3、 MnS04 7H20 0003，FeS047H20 O003，KCl 005，植酸钠O236。在此基础 上对其产酶条件进行优化的结果为：pH 56，温度311，时间47d。经以上优化后， 黑曲霉Py的植酸酶产量为1573IUmL。植酸酶的去磷实验表明，粗酶液对植酸钠的去磷率在4小时时可达到88。关键词： 黑曲霉 植酸酶 原生质体He-Nc激光RSMPlackettburman设计蒜经作者、导师阋簟膏全文公措ABSTRACTAn Aspergillus strain with high yield of phytase was isolated and selected from more t

4、han 200 natural samples，the yield of phytase is 5868 IUmL，which was identified and named Aspergillus nige，PxSecondly,the formation and regeneration of the protoplast from Asperigitlus niger Px with hi曲yield of phytase was studiedThe highest yield of protoplast and the highest regeneration ratio were

5、 97x105m1 and 282，respectively，when the mycelia growing on the condition and liquid culture for 1 8 hours were dealt with 033-mercaptoethanola and compound enzyme together by using O7molL NaCI as the osmotic pressure stabilizer for 25 hours at 34。CThe compound enzyme was composed of snailase and cel

6、luase at the best concentration ratio of 7：3，pH value50The proprieties of enzyme solution were studied at the same timeThe optimal temperature and optional pH were 45C and 5，respectivelyWhen the enzyme isdisposed at temperature 55 6C or pH 30-70，the relative enzyme activity is above 80The enzyme act

7、ivity is greatly inhibited by Zn”、AL3+、Mn2+、cu2+but M92+ has activation effect on phytase activity at certain concentrationThe protoplasts and spores of the origin strain Px was treated by laser and UV radiation to obtain mutant strain with high phytase activityStrain Py was obtained and enzyme acti

8、vity ofphytase was 9274 IUmLwhich was about 158 times that ofthe original strainThenthemediaandfermentationconditionwerestudiedthroughplacketburman design and Response Surface AnalysisThe result shows that the optimalmedia were as follows：peptone 02，glucose 257，Sulfuric acetate O299，magnesium sulfat

9、e 005，manganese sulfate O，003，Ferrous sulphate 0003，potassiumi chloride 005，phytic sodium 0236On this condition，theIIoptimum culture condition of Aspergillus strain Py producing enzyme were as follows：temperature 311，fermentation period 47d，pH 56After the above optimum，the yield ofphytase is 1573IUm

10、LAt1astthephytasewasusedtohydmlyzesodiumphytateintheexperiment，the rate of removal is high up to 88at 4 hoursKey words：Aspergillus ngerphytaseprotoplasts He。Ne laserRSMPlackett-burman designY623823独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的 内容以外，本论文不包含其他人已发表或撰写的研究成果，也不包含 为获得西北大学或

11、其他教育机构的学位和证书而使用过的材料。与 我一起工作过的同志对本研究所做的贡献已在论文中作了明确地说 明并表示谢意。学位论文作者签名签名日期：加旧妒年6月易日第一部分前言植酸是植物性饲料中普遍存在的一种抗营养因子，植酸分子中的磷植酸磷难 于被猪和禽利用，植酸能和饲料中的矿物元素、蛋白质等结合成稳定的复合物， 从而降低这些营养成分的消化利用率，为了提高植物性饲料中磷的利用率，消除 植酸的抗营养作用，应用植酸酶作为一种新型饲料添加剂已F1益为人们所重视。1植酸的物理化学特性【1】植酸(phytic Acid or inositol hexakis-phosphate，缩写为PA或IP6)即肌醇六

12、 磷酸，是一种淡黄色粘稠状液体。易溶于水，95的乙醇、丙酮、丙二醇、甘油 等，但几乎不溶于无水乙醚、苯、乙烷、氯仿等；植酸的分子式为C6H6OPO(QH)：116， 分子量为6608，化学名称是环己六醇一1、2、3、4、5、6一六磷酸二氢酯，六个磷酸基团强大的络合能力，多与二价的阳离子结合在一起，形成化学性质稳定 的络合物，其作用与EDTA相似，但比之有更广泛的适应范围植酸是维生素B 族的一种肌醇六磷酸酯，其确切的结构式由Barre等确定为船式。植酸遇高温则 会分解，但在120。C以下短时间内大致是稳定的】。图1植酸的结构式 2食品及饲料原料中的植酸21存在形式植酸广泛地存在于植物体中，尤其是

13、在禾谷类和油料作物的种子中含量丰 富，植酸分子中有六个磷酸基团，它是植物籽实中磷的主要贮存形式。它在植物 体中一般不以游离形式存在，而是与钙、镁、钾、钠、铁等金属离子结合，以复 合盐类(与若干金属离子)或单盐(与一个金属离予)的形式存在，称之为植酸l盐(phytate)，植酸盐在多数植物中是以植酸钙、镁复盐，或称菲丁(phytin)的 形式存在，但在大麦中主要是以植酸钾镁盐的形式存在，芝麻中主要是植酸，小 麦中主要是以植酸铁盐的形式存在，复合盐类大多数不溶于水，植酸与钾、钠、 铁等形成的单盐通常呈水溶性，而植酸钙，植酸镁则不溶于水【41。22存在部位在小麦、稻谷和大麦等种子中，植酸集中于谷粒的

14、糊粉层与外壳1；玉米则 集中于胚芽。豆类籽实中的植酸则分别存在于整个种子的蛋白质络合物中，因此， 在谷物加工副产品和油产饼粕中植酸的含量高，谷物和豆类籽实中的含量相对较 低m】。23常用食品原料中植酸磷和总磷含量表1常用食品原料中的植酸磷和总磷o，3植酸的抗营养作用31植酸的难利用性旧131在植物性饲料中以植酸盐形式存在的有机磷化合物称为植酸磷。我国谷物、 油饼、糠麸等饲料中的植酸磷含量很高，般约占总磷的4080。其中谷类 的籽实中的占总磷的4464，豆类籽实中稍低，油料饼粕类的约占5670，2小麦麸占74，而米糠中可高达93【12。饲料中的植酸磷必须在消化道内水解 成无机磷的形式才能为动物所

15、利用。植酸磷的利用率因动物种类而不同。反刍动 物瘤胃中的微生物能产生植酸酶，可有效地水解植酸，因而反刍动物能够利用植 酸态的磷，其对植酸磷的利用率可一般为60，成年反刍动物可高达90，非 反刍动物如猪及家禽的消化道缺乏植酸酶，因而植酸磷的利用率低。猪对植酸磷 的利用率约为20-50，家禽对植酸磷的利用率略低于猪，但成年家禽，由于 胃肠道中植酸酶的活性较高，对植酸磷的利用率也可达到50左右。由于植物性饲料中绝大部分的磷不能被猪和家禽有效地利用，人们为了满足 猪和家禽的需要，必须在饲料中添加无机磷酸盐。但是另一方面，大量的植酸 磷又会从畜禽的粪便中排出，引起磷对环境的污染，这一问题目前已引起了人们

16、 的极大关注。32降低饲料中的矿物元素的利用率“1植酸在化学结构上具有很强的络合能力。植酸在pH3310之间时能与钙， 镁，锌，铜，铁锰等金属离子形成稳定的络合物，从而降低动物对这些矿物元素 的利用率，在pH74的条件下，植酸与下列离子形成的络合物的数量依次减少：cu2+、Zn2上、c02+、Mn2+、Fe3+、Ca2+；植酸与下列离子形成络合物的稳定性依次减弱：zn2+、Cu2+、NiH、C02+、Mn”、Ca2_。可见，植酸对矿质元素利用率影响最大的是锌。33降低饲料中蛋白质的消化率 植酸在消化道中可与蛋白质作用形成难溶性的复合物。植酸与蛋白质的这种相互作用与pH值关系非常密切。在低于蛋白

17、质等电点的pH条件下，植酸可 与蛋白质分子上的碱性基团(赖氨酸、精氨酸、和组氨酸残基)结合形成植酸一 蛋白质的二元复合物121。在高于蛋白质等电点的条件下，经钙、镁和锌等阳离子 作为桥梁形成植酸一蛋白质的一金属离子的三元复合物【l”，这种复合物是不可溶 的，且受蛋白质水解酶作用的程度小于同种单独蛋白质，因此导致蛋白质的消化 率降低。因而对蛋白质的消化也有一定程度的影响。34影响淀粉和脂肪的消化率It4j61植酸对淀粉酶的活性有抑制作用，饲料中的植酸存在会使动物对淀粉的消化 率降低体外试验证明【16】，植酸盐可抑制猪胰脂肪酶的活性。动物实验也表明，大鼠饲料中添加植酸钠时，脂肪的消化率也会降低。4

18、|直酸酶41植酸酶简介 植酸酶(或称肌醇六磷酸酶；Phytase)属于磷酸单酯水解酶，是类特殊的酸性磷酸酶，它能水解植酸丽释放出无机磷17,18】。42植酸酶的分类421广义的植酸酶 广义的植酸酶119,201包括：植酸酶和酸性磷酸酶。植酸酶只能将植酸分解为肌醇磷酸酯，不能彻底地分解成肌醇和磷酸。酸性磷酸酶能将肌醇磷酸酯彻底地分 解为肌醇和磷酸。植酸酶包括两种主要的成分，第一种成分最适pH在2,5左右， 我们称之为phytA，动物胃中pH在25左右，这种成分主要在胃中起作用。第二 种组分的最适pH在55左右，我们称之为phytB，动物肠道中的pH在55左右，这一组分主要在动物胃肠道中起分解植酸

19、的作用。酸性磷酸酶也包括两种组分，第一种组分的最适pH也在25左右，与动物 胃中的口H相近，它主要在动物胃中起作用，我们称之为Pa；第二种组分的最 适pH也在55左右，与动物肠道中的pH相近，它主要在动物肠道中起作用， 我们称之为PB，微生物的种类不同所产生的植酸酶的种类也不一样，有的只含 有phytA，有的只有phytB，有的四种都能产生。 422根据植酸酶对底物的作用方式21I(1)3一植酸酶(3-phytaseE3138)其系统命名为肌醇六磷酸3一磷酸水解 酶川，它作用于植酸时，首先从第三个碳位点开始水解酯键而释放出无机磷，然 后再依次释放出其它碳位点上的无机磷，最终酯解整个植酸分子。这

20、种植酸酶存 在于真菌、细菌和植物中，且需要二价离子镁参与催化过程。(2)6一植酸酶(6-phytaseE31326)其系统命名为肌醇六磷酸6一磷酸水解 酶。它首先在植酸的第6个碳位点上开始催化水解而释放出无机磷。这种植酸酶 只存在于植物(特别是种子)中。423根据植酸酶在细胞中的位置可以分为胞内酶和胞外酶。霉菌植酸酶多为胞外酶【23。43植酸酶的来源植酸酶的来源广泛在植物、动物、自然界的微生物和生物工程技术应用的 微生物中均发现植酸酶的存在“1。44植物源的植酸酶及其特点(1)植酸酶广泛地存在于植物中，凡是含有植酸的植物组织都伴有植酸酶存 在。据资料表明，黑麦，小麦，大麦，和小麦麸都具有很高的

21、植酸酶活性，而燕 麦，玉米，大豆饼，花生饼，菜籽饼和棉籽饼中的植酸酶活性很低25,26,27J。另外， 有些植物能从根部直接分泌植酸酶【27】。C2)特点：植物源的植酸酶及其酶活性的最适pH在486，0之间。在pH30 时活性显著下降，甚至失活。因此这类酶在动物胃中高酸性的条件下，难以发挥 其催化活性，至于它进入小肠后，在pH升至6，0-70的条件下能否恢复酶活， 目前还不清楚。植物源的植酸酶的耐热性不良，其酶活在温度为4752的范围内较为稳 定，在通常饲料加工的过程中温度为5570的情况下，小麦，大麦等的植酸 酶极易失活。表2植物内植酸酶的研究情况表125，26，27，28|酶源酶的最酶的最

22、酶的特性及酶活(Kin值)影响酶活性的因素适pH适温度小麦515450310-1toolL酶在M92+浓度为0002molL时可被激活酶受高浓度底物，F离子的抑制，但不豌豆5 201510。mol厂L受碘乙酰胺的抑制大显48302410。3宽叶香蒲80521710。cd+能促进其活力达120酶的分子量为76KDA。它是由两个玉米4849117um01凡38KDA的部分组成斯佩耳特6O35400umol几分子量为68KDA 小麦45微生物源植酸酶的来源及特点451来源自然界的许多微生物都能产生植酸酶，如细菌，霉菌，酵母等，特别是曲霉 菌属微生物，如黑曲霉(4niger)、无花果曲霉(爿fficu

23、mm)和米曲霉(Aoryzae) 等能产生活性较高的植酸酶291。452微生物源的植酸酶的特点l弼J1,3211)微生物源的植酸酶所耐受的pH的范围较大多数植物性的植酸酶要宽，一般 在2560的范围内【301。例如由Aniger和Afficumm高产株得到的的植酸酶有两个最适pH25和25， 因而这两种酶以植酸以植酸为底物时有两个活性高峰，这有可能是由于存在两种 植酸酶的同工酶所致。而通常猪和家禽的胃的pH值约为1535，小肠前端pH 值约为50-70。因而，这类植酸酶能较好地适应动物胃肠道的pH条件，从而 有效地发挥其催化作用。最近，据姚兵【37】报道，用黑曲霉菌株植酸酶有两个最适 pH值，

24、分别为1_8和57，并且在pHl8-57的范围内均能维持较高的酶活性。 这样就更适合于在饲料中使用。 2)微生物植酸酶的热稳定性相对于植物源的植酸酶要高31,32,331。大多数微生物植酸酶活性的最适温度在4570范围内，个别可高达77， 据报道，由某些曲霉(如Aficumm和Aniger)生产的植酸酶有较高的的热稳定， 在饲料制粒温度条件下仍能保持较高的酶活性。 3)微生物的植酸酶系较全【3引。大多数微生物所产的植酸酶中含有PhytA，PhytB，Pa，Pb中的几种。4)霉菌植酸酶的分子量一般在60一100Kdal之间【34蚓。453几种微生物源的植酸酶的基本特性的比较 表3几种微生物源的植

25、酸酶的基本特性的比较37，38，39，40，4酶的晟最适酶的来源适DH温度酶的特性及酶活影响酶活的因素土曲霉4560pH范围12-90无花果曲霉酶活11“mLAficuum WB4016EDTA，Zn”，Cd”，Ba”。枯草杆菌KM值为05umolL，酶cu“，Fe“，AL3+等对酶活606550BS1atton77活为87urag蛋白质有抑制作用，ca2+有促进酶活的作用 Km值为110M92+,NaF,NaN03，EDTA对青霉53和5510。m01几(作用底物为此酶无抑制作35植酸钙)，酶活为用，Cu2+,Zn2*M92+Fe2+有较3012ug干曲强的抑制作用黑曲霉30酶活为45Ou儋

26、干基Aspniger70无花果曲霉Kin为40umol，L48AspergillusFicuum分子量85100KDA无花果曲霉酶活105umLIAficuumNRRL313546动物源植酸酶及其特点 在动物中，植酸酶主要存在于脊椎动物的红细胞和血浆以及哺乳动物的小肠内30,331。动物胃肠道中的植酸酶来自于摄取的植物性饲料、肠道微生物区系和肠粘膜 分泌的内源性植酸酶。反刍动物瘤胃微生物产生的植酸酶能有效水解植酸盐，单 胃动物肠道粘膜中的内源性植酸酶及肠道微生物产生的植酸酶活性相当弱，至少 幼禽如此31,32。在某些动物组织中，植酸酶也是存在的，甚至有人提出证据表明：人体内也 存在植酸酶活性。

27、如某些有核红细胞中，但观察该酶活性的困难之处在于食物植 酸酶抑制剂的存在。47植酸酶的作用机理 植酸酶能将肌醇六磷酸(植酸)分解成为肌醇和磷酸1671。植酸酶将植酸分子上的磷酸基团逐个切下，形成中间产物P5，IP4，IP3，IP终产物为肌醇和磷酸。不同 来源植酸酶作用机理有所不同。微生物产生的3植酸酶作用于植酸时，首先从植 酸的第3碳位点开始水解酯键而释放出无机磷，然后再依次释放出其他碳位点的 磷，最终酯解整个植酸分子，此酶需要2价镁离子(M矿+)参与催化过程。来源于植 物的6一植酸酶，它首先在植酸的第6碳位点开始催化而释放出无机磷。19植酸完 全分解理论上可释放出无机磷2816mg。植酸酶只

28、能将植酸分解为肌醇磷酸酯， 不能彻底分解成肌醇和磷酸，要彻底分解肌醇磷酸酯，需酸性磷酸酶的帮助，酸性 磷酸酶可以将单磷酸酯、二磷酸酯彻底分解成肌醇和磷酸。大多数微生物源的植酸酶作用机理42,431如下：植酸一Dl，2，4，5，6一五磷酸肌醇+D1，2，3，4，5一五磷酸肌醇一l，2，5，6四磷酸肌醇一1，2，5-三磷酸肌醇或1，2，6一三磷酸肌醇一1，2一二磷酸肌醇一2磷酸肌醇。 48植酸酶的测定方法植酸酶活性的测定方法较多，但至今尚没有被世界普遍公认的植酸酶的定量 分析方法【82 83841。481钒一钼黄法该方法是利用植酸酶可以水解植酸磷释放出无机磷的原理。通过加入酸性钼 一钒试剂使水解反

29、应停止，同时与水解释放出来的无机磷产生颜色反应，形成黄色的钒钼磷络合物，在415nm波长下测定磷的含量。以标准植酸酶为参照物，间 接计算被测样品中植酸酶的含量。本法于1994年列NAOAC，我国也己将此法的 测定结果作为审批商品植酸酶注册许可证和验收进口产品的法定商检依据。 482硫酸亚铁钼蓝法该方法利用植酸酶可以水解植酸磷释放无机磷的原理，通过加入三氯乙酸使 水解反应停止，然后加入钼酸铵及硫酸亚铁的混合液使溶液显色，在720hm波长 下测定其吸收值，以标准酶为参照物，间接计算被测样品中植酸酶的含量。483Vc一钼蓝法 该方法是利用植酸酶可以水解植酸磷释放无机磷的原理，通过加入三氯乙酸使反应停

30、止，然后加入钼酸铵与Vc的混合液，使溶液显色，在820nm波长下测定 吸光度，再以标准磷溶液的吸光度及磷溶液浓度对应的酶活单位建立直线回归方 程，最后以待测样品吸光度代入方程，计算出酶活性。484丙酮一磷钼酸铵法 磷酸盐与过量的钼酸铵在酸性条件下混合后，可慢慢生成黄色磷钼酸铵，加入丙酮后将黄色物质提出来，在355nm波长处测吸光度，灵敏度增加lO倍。49植酸酶的应用119,20,21,22,231491食品加工过程中的植酸脱磷 用食品级的植酸酶处理粮食，以分解粮食中的植酸(盐)，减少植酸对微量元素的整合，提高粮食的营养价值19,20。在大豆加工中可对大豆蛋白进行酶催化改性，从而提高其营养和商品

31、价值。面包生产过程中添加植酸酶可以清除揉面中的 植酸，面包制作中用的植酸酶应该是安全无毒，高活性，ca2t依赖型的，最适pH 应在4550，并在30左右具有高反应速度。浸渍是玉米浆的生产程序之一，浸 渍是为了软化玉米粒，破碎细胞壁，从而获得玉米浆。微生物植酸酶能加速这一 过程，改良株胚的分离，获得高产量的淀粉和面筋，并能改善玉米浆的品质。食 品级的纯化植酸酶可以用于婴儿食品特别是豆奶制品中。以解除抗营养因子，生 产高档的婴儿食品。492饲料添加剂21，22】 将植酸酶添加到植物性饲料中，不但能提高植酸磷的利用率，还可降解植酸蛋白质络合物，减少植酸盐对微量元素的整合，提高动物对植物蛋白的利用率及

32、其植物饲料的营养价值。同时也减少动物排泄物中有机磷的含量，减少对大自然的污染。49-3生产肌醇磷酸盐或肌醇22,23 利用植酸酶降解米糠等农副产品中所含的植酸(盐)，从而生产肌醇磷酸盐或肌醇等产品，用于化工原料或医药。494用于谷物沉淀加工废弃物的处理 在谷物(玉米、小麦等)淀粉加工中处理废弃物，降低对环境的污染。5植酸酶高产菌株的选育51植酸酶高产菌株的研究进展 天然产植酸酶菌株产酶水平一般较低，无商业开发价值。目前都是以天然菌株进行改良获得的改良菌或通过基因工程技术获得的基因工程菌。现在对无花果 曲霉AspFicuum(NRRL3115)研究的较为详细。Madsa KCHELius等用紫外

33、照射 法对NRRL3115菌株进行改良，获得的突变菌株其植酸酶产量为野生型的33倍。 山西大学生命科学系诸西宁134,351等首次分离到一种产植酸酶的青霉菌一变灰青霉 (peicilium Canescens)，此菌产酶效果较好，植酸酶活性可达312Ug(-P曲)。赵允磷361等分离出一黑曲霉菌株(Aspniger 70)，并与国际上公认的植酸酶优良产 生菌：无花果曲霉NRRL31 15菌株的产酶特性进行了比较，发现NRRL3115培养 89d才达到产酶高峰，而黑曲霉口spniger 70)培养56d便可达到产菌高峰；用 固态培养法生产植酸酶的产酶水平前者蔓j45ug(干基)，而后者仅为52“

34、g(干基)。 陈红歌137,381以黑曲霉Ma02l口印”啦rma021)出发菌株，经紫外线、亚硝基胍单独处理和复合处理，获得株植酸酶高产菌株w1210，发酵108h其植酸酶活 力达至U29503015Uml，是原始出发菌株的3,6倍刘德忠139,40以无花果曲霉 2123154为出发菌株，用钴60照射诱变，获得两株产植酸酶活力较高的菌株， G21231574和C12315-64，在最适液态培养条件下，两株菌产酶活力均在 110uJmL以上，最高可达11，28umL，比出发菌株提高了16857，发酵时间从9d 缩短_Nsd，缩短了45左右。胥传来j4“4”等从黑曲霉口印niger)eP筛选出一

35、株产 植酸酶菌，在30。C下恒温培养4d，其最高酶活可达4797umL，酶的热稳定性较 好，温度提高N55 oc，菌液仍保持934的酶活。52激光诱变育种 几乎与激光器问世的同时，人们就以激光作为研究手段进行生物学研究。1961年LRSolon等发表了“激光的生理作用”，这是有关激光生物学的第一次报道。以后随着激光研究成果的发展，国内外近几十年来有关激光生物学方面的研 究报道越来越多。激光对各种生物均能产生生物学效应。一般公认，激光对生物 组织的效应有热，压力、光和电磁场四种H41。1热效应当激光照射细胞时，从微束照射观点分析，激光的光分子作用 于生物分子，后者吸收光子并被激活，被激活分子与其

36、他分子多次碰撞后转化所 获能量为热能。使被照物体温度升高，若温度上升持续时间较长，会使蛋白变性， 酶失活。即使时间很短，也能大大降低一些酶的活性。导致生物生理、遗传变异。2压力效应以能量密度高的激光照射生物体，可产生一次压力与二次压 力效应，当聚焦脉冲以激光作用生物体上某点时，其光能瞬时转化为热能，引起 该处组织内压强急剧升高，使得组织分裂，从而引起生理及遗传变异。3光效应光对于生物分子作用主要取决于分子的能级和波长。因吸收激 光被激活的生物分子，可将能量暂时贮存，进行光合作用。或用于提供异构作用， 聚合作用，及生物分子离解所需的自由能。一旦这些不同波长的激光被生物组织 细胞选择性地吸收，生物

37、分子内就会发生分子能级跃迁，出现激活或损伤，产生 相应的生物效应。4电磁场效应激光是强电磁波，其产生的电场，可使生物偶极子发生二 次或三次谐波。使生物组织细胞变性，产生自由基。强烈的反应对细胞内的染色 体，DNA及蛋白质造成刺激或损伤，从而引起生物体突变。1968年，匈牙利EMester提出小剂量激光辐射对生物有刺激效应，生物分子 吸收不同波长的激光，导致分子激活，产生新的化学反应或损伤，从而引起生物 体突变。在低功率激光中位于可见光范围内的氦氖(HeNe)激光是目前应用最广泛的激光。它的主要生物学效应在于：(11刺激及抑制作用，kapho曾通过实验证明，在一定能量密度范围内，He-Ne激光对

38、细胞I勾DNA合成有刺激作用，即加快细胞I勾DNA合成速率”“。 (2)诱变作用。HeNe激光可以诱发染色体畸变，破坏染色体，造成DNA分子损伤或突变。有报道表明用He。Ne激光处dEcoli造成DNA分子突变。 (3)He-Ne激光对生物体蛋白质的合成也有一定的影响。 激光生物学研究应用于农作物育种方面取得了显著成绩，近十几年来，微生物学者逐渐将其引入微生物育种领域。如为得到高产菌株，吴振昌曾用铜蒸气激 光辐照棘孢小单孢菌，得到发酵单位提高10的激光辐照株。同时在龟裂链霉菌 的激光照射中，得到发酵单位提高66以上的新菌株。迄今为止，在实验条件下 已育种成功的突变菌株【45，46，47，48，

39、49，5川有：白僵菌、纤维素酶产生茵、果胶酶产生 菌、赤霉素产生菌、龟裂链霉菌、黑曲霉、米曲霉、青霉素产生菌、啤酒酵母、 大肠杆菌等。常用的激光器有：染料激光、铜蒸汽激光、C02激光、He-Ne激光 等”1。诱变材料多为菌体、孢子，也有原生质体。53原生质体诱变育种 微生物在一定酶的作用下，脱去细胞壁，只能在高渗透压培养基中存活，并在合适的培养基中恢复细胞壁而再生。由于原生质体失去了细胞壁的屏蔽，故对 诱变剂更为敏感，诱变效果较传统方法理想。有关原生质体诱变育种的研究开始于1983年，Ryu511等人用NTG做诱变剂首 次诱变了小单孢菌(Micromonospore rosaria)的原生质体

40、，诱变后获得的营养缺陷 型比例为4。1985年，杜珠还等1用Uv与LiCl(O3)复合处理赖氨酸的产生菌：北京棒 杆菌ASl5390的原生质体，选出了一株产酸量高于原株65的菌株，经用菌体 细胞作诱变对照时，试验结果表明，原生质体的正变株大大高于菌体细胞，从其 产量变化幅度来看，原生质体的正变幅度也大于菌体细胞，说明了原生质体诱变 较菌体诱变效果好。1999年，郭爱莲等巧2 3用HeNe激光诱变黑曲霉sx的原生质体，得到生淀粉 糖化酶活力提高51优良菌株。2000年，李用芳等53 3用uv诱变面包酵母原生质体，得到产C02比出发菌株提高253，生物量提高37rag的突变菌株。 54同工酶技术“

41、同工酶，一词最早由Market和Moller提出，指具有相同的催化功能但其蛋白 质结构又不相同的一类酶H扪。现有的同工酶概念较广泛，主要指在同一种属中由不同基因位点或等位基因编码的多肽链的单体、纯聚体或杂聚体，其理化性质 不同而能催化相同反应的酶。无论动物，植物还是微生物，在同一物种的不同个 体，同一个体的不同器官及细胞或同一细胞的不同部位，以及生长发育的不同时 期和不同代谢条件下都有不同的同工酶分布。541同工酶的生物学意义同工酶谱是分子水平的指标，按照1个结构基因编码1个同工酶亚基的理论， 可以从同工酶的表现型变异直接推测其基因的变异。显然，它优于形态学的指标， 后者往往是多个基因的综合表

42、现。同工酶是分支代谢途径中广泛存在的现象，因此不同菌株间同工酶种类上的 差异可能反映出它们代谢途径的不同。而不同菌株间作用完全相同的酶，由于进 化的关系，其氨基酸顺序和组成上也有差异，这些差异间接反映了结构基因的不 同。因此，可以将酶谱分析看成是对微生物结构基因的比较，提高了分类的准确 性。此外，同工酶可以通过酶活力测定来鉴定，比非酶的蛋白质分析方便。 542同工酶电泳用于真菌分类及鉴定同工酶电泳用于真菌分类及诱变育种结果鉴定方面的文章较多，如 Fregresiev541报道了假丝酵母(C日讲由)的电泳。Yamazaki&komagata3比较 了红酵母属(Rhodotorula)羊ll红色冬

43、孢酵母属(Rhodosporidium)的酶电泳特性。卢乡怀1韦一能57 3魏艳敏1等近年来分别对裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的4种11株菌，热带假丝酵母(Candidatropilis)红酵母属(R odotorula)的同工酶电泳分析，结果均表明同工酶的差异可作为菌株分类鉴定有 效手段之一。6，实验目的及主要内容61实验目的植酸酶目前研究工作中存在的主要问题是植酸酶的酶活不高，本实验所要做 的主要工作是高产植酸酶菌株的筛选及应用研究的阶段性工作。其主要目的是筛 选性能优良的高产植酸酶菌株，即植酸酶活性较高-适于加工，贮存，提取容易，酶学 性质适合于应用开发的优良菌株

44、。通过诱变获得性能较好的突变株。再通过摇瓶 培养对其发酵条件进行初步研究，并通过模拟去磷，评价其去磷效果，为下一步实 验奠定基础。62主要研究内容1从自然界广泛取样，通过固体平板初筛，摇瓶复筛，由样品中筛选植酸酶 产量较高的菌株。2对所筛选出的菌株作鉴定及性能测定。对粗酶提取液的性质，包括最适温度，最适pH，热稳定性，pH稳定性，激活剂和去磷效果作初步研究。 3对所选菌株黑曲霉Px的原生质体制备和再生条件的研究，其中包括酶解时间，酶解温度，渗透压稳定剂的种类，渗透压稳定剂的浓度，酶浓度，菌龄等。4对所得菌株黑曲霉Px的原生质体和孢子分别进行紫外和激光诱变，以期获得植酸酶产量较高的突变株。 5对

45、所得突变株Py进行传代实验，研究其遗传稳定性。6将诱变株Py与出发菌株Px的酯酶和过氧化物同工酶进行聚丙烯酰胺凝胶 电泳，比较其酶谱变化，推测其基因的变异。7运用Plackettbumlan设计，正交设计，响应面分析等方法对所得菌株黑曲霉 Py的培养基和产酶条件进行初步优化，最后得出其优化培养基和在此基础上的优 化培养条件。8通过去磷实验验证植酸酶对植酸钠的中植酸磷的降解效果。第二部分实验内容1实验材料11菌种来源黑曲霉(本实验室筛选并保存) 12主要试剂和原料(1)蜗牛酶北京百泰生化技术公司(BR级) (2)B巯基乙醇华美生物工程公司 (3)麸皮粉(4)植酸钠(SIGMA公司)； (5)植酸

46、钙(湖南三鑫生物制品有限公司) (6)30丙烯酰胺(Arc)O8甲叉双丙烯酰胺(Bis)溶液称117309 Arc,no，89 Bis，用蒸馏水定容至100ml，于棕N瓶eoo-4低温避光 保存。(7)30丙烯酰胺(Arc)一25甲叉双丙烯酰胺(Bis)溶液诱；g7,109 Arc年n259 Bis，用蒸馏水定容至looml，于棕色瓶中04低温避光 保存。(8)低离子强度电极缓冲液(PH 83)称取69Tris和2889甘氨酸，加蒸馏水溶解，定容至1000ml，0-4低温保存， 用时稀释10倍，pH83(9)酯酶染色液 50mla一醋酸荼酯和50mgp醋酸荼酯溶解于2m1丙酮一水溶液(1：1)

47、中，再加100mg坚固兰。用O1mll pH65磷酸盐缓冲液稀释到150m1。(10)TEMED(N，N，N，N一四甲基乙二胺)(1 1)014过硫酸铵(AP)f12)过氧化物酶染液将联苯胺29在l 8m L冰醋酸中微热溶解后，再加入水72m1配制成联苯胺母 液。染色液含有维生素c 704mg，联苯胺母液20m1，06H20220ml，N,留z960 ml。13主要培养基131液体富集培养基f37J：葡萄糖15植酸钙O1，青霉素钠200Uml，MgS047H20 005，MnS047H20 O003，FeS047H20O003pH 55。132斜面种子培养基【38】：MgS047H20O05，

48、MnS047H20 O003，FeS047H20 O003，麸皮汁100ml，琼脂152，pH 55。133固体筛选培养基【40】： 葡萄糖15，植酸钙01，青霉素钠200Uml，MgS047H20 005，MnS04-7H20O003，FeS047H20 O003，琼脂152，pH 55。134液体产酶培养基I：蛋白胨O3，葡萄糖l，(NH4)zS04 O8，MgS047H20 005，MnS047H200003，FeS047H20 0003，KCI O05，pH 55。13 5液体产酶培养基II371： 蛋白胨03，葡萄糖15，可溶性淀粉2，MgS047H20 O05，MnS04 7H20

49、O003，FeS047H20 0003，(NH4)2804 O2，KCI O05，pH 55。13,6液体产酶培养基III：葡萄糖3，NaN030086，MgS047H20005，MnS047H200003， FeS04 7H20 0，003，KCl 005，植酸钠01，氯化钙0，02，pH 5，5。 137液体产酶培养基：淀粉4，蛋白胨0，5，硝酸铵O8，KCl005，MgS047H200,05，FeS047H20 O003pH 55。138再生培养基：酵母膏2，葡萄糖4，NaN03 03，KCl 105，MgS047H20 005，FeS047H20 0，001，KH2P04 O01，pH

50、60，上层含08琼脂，下层含2琼脂， 用06molLNaCl溶液100m1配$0。139低渗培养基：酵母膏2，葡萄糖4，NaN03 O-3，KClO05，MgS04-7H20O 05FeS047H20 0001，KHzP04 O01，pH60，上层含O8琼脂，下层含2琼脂，用蒸馏水100ml配制。1310菌丝生长培养基：蛋白胨03，葡萄糖15，MgS047H20 O05，MnS04720O003，FeS047H20 0003pH 55。1311察氏培养基：NaN03 02，K2HP04 O1，KClO05，MgS04 0,05，FeS04 0001，蔗糖3，琼脂2，pH自然。1，4主要仪器72 1型可见光分光光度计上海第三分析仪器厂恒温摇瓶机山东大学制造转速200ffmin 手提压力蒸汽消毒器YXQSG280上海医用核子仪器厂 絮外杀菌灯锦州市太和区光学医疗器械厂电热恒温水浴锅上海医疗器械三厂电热煮沸消毒器德兴医化器材厂 电光分析天平TG328A 托盘式扭力天平TN100B型上海第二天平仪器厂 电热鼓风干燥箱CSl01Z型重庆试验设备厂 恒温电热培养箱银川市金属制品厂台式离心机上海嘉定安亭科学仪器厂高速冷冻离心机日本Hitac