组织DNA的提取与纯化

1、组织组织DNADNA的提取与纯化的提取与纯化检验系生化教研室 陈宁 讲课内容概述概述1 试验原则试验原则2 实验操作及相关试剂介绍实验操作及相关试剂介绍3注意事项注意事项4一、概述 DNA在生物组织中以核蛋白的形式存在于细胞核中。 单倍体人类DNA平均相对分子量为61010 道尔顿，相当于1.3105kb。DNA的分类有：的分类有：真核真核DNA细菌细菌DNA病毒病毒DNA质粒质粒DNADNA样品的来源：样品的来源： 组织组织 肝脏、赘生物、肌肉、培养细胞肝脏、赘生物、肌肉、培养细胞 血液血液 细菌细菌 培养细菌、质粒培养细菌、质粒二、实验原则 保证保证DNA一级结构的完整性一级结构的完整性

2、排出其他干扰性分子的污染排出其他干扰性分子的污染干扰分子干扰分子l 对酶有抑制作用的物质对酶有抑制作用的物质l 样品中存在的其他生物大分子样品中存在的其他生物大分子有机溶剂、高浓度的金属离子等有机溶剂、高浓度的金属离子等蛋白质、多糖和脂类蛋白质、多糖和脂类应尽量将此类物质的浓度降低到最小程度应尽量将此类物质的浓度降低到最小程度l 相应抽提对象之外的核酸污染相应抽提对象之外的核酸污染DNA抽提时，应避免抽提时，应避免RNA干扰干扰相关因素对于核酸的影响：相关因素对于核酸的影响：机械剪切力、高温剧热环境机械剪切力、高温剧热环境过酸、过碱的反应体系过酸、过碱的反应体系各种核酸酶降解效应各种核酸酶降解

3、效应物理因素物理因素化学因素化学因素生物因素生物因素操作轻柔，切忌剧操作轻柔，切忌剧烈混匀、震荡；控烈混匀、震荡；控制实验温度制实验温度pH 410EDTA缓冲液缓冲液避免干扰因素的解决方法避免干扰因素的解决方法 简化操作步骤，缩短提取过程，减少各类因素对核酸的降解。三、实验操作及相关试剂介绍【实验方法】 物理方式：玻璃珠法 超声波法 研磨法 冻融法 化学方式：异硫氰酸胍法 酚-氯仿抽提法 碱裂解法 生物方式：酶法酚酚-氯仿抽提法氯仿抽提法提取组织提取组织组织匀浆组织匀浆水相水相(DNA,RNA)絮状沉淀絮状沉淀(DNA,少量蛋白质少量蛋白质,RNA)DNA裂解液裂解液苯酚苯酚-氯仿氯仿离心离

4、心离心离心离心离心氯仿氯仿-异戊醇异戊醇5mol/L NaCl冰无水乙醇冰无水乙醇75%乙醇乙醇TE1. 裂解液裂解液0.1mol/L NaCl1% SDS （十二烷基磺酸钠）（十二烷基磺酸钠）10mmol/L Tris-HCl pH8.01mmol/L EDTA pH8.0阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。 抑制抑制DNA酶活性酶活性pH值适宜值适宜DNA游离游离至水相，避免降解。至水相，避免降解。2. 苯酚苯酚

5、-氯仿氯仿（3:1，V:V） Tris-HCl 饱和饱和 操作时，应将移液管伸至试剂瓶底部，吸取下操作时，应将移液管伸至试剂瓶底部，吸取下层试剂。层试剂。 苯酚与氯仿均为表面变性剂，能够有效地去除苯酚与氯仿均为表面变性剂，能够有效地去除水溶液中的蛋白质，使其变性后沉淀。水溶液中的蛋白质，使其变性后沉淀。3. 氯仿氯仿-异戊醇异戊醇（24:1，V:V） 经酚氯仿试剂第一次抽提后的水相中有残留经酚氯仿试剂第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性残余的蛋白质，同时一起将酚带走。变性残余的蛋白质，同时一起将酚带走。 加入异戊醇能

6、降低分子表面张力，所以能减加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。同时异戊醇有助于分少抽提过程中的泡沫产生。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。下层有机溶剂相维持稳定。 4. 5mol/L NaCl 使水溶液中的使水溶液中的DNA易于聚合，从而形成钠盐易于聚合，从而形成钠盐沉淀。沉淀。 反应体系为反应体系为pH 8.0时，时，DNA分子所带的电荷分子所带的电荷为负电荷。加入为负电荷。加入NaCl溶液后，溶液后，Na+能够中和能够中和DNA外周的负电荷，减少外周的负电荷，减少DNA分子

7、之间因同种电荷产分子之间因同种电荷产生的排斥力，使得生的排斥力，使得DNA分子相互靠拢。分子相互靠拢。5. 冰无水乙醇冰无水乙醇冰：冰：低温条件能降低分子运动，避免低温条件能降低分子运动，避免DNA破坏，破坏，而易于沉淀出而易于沉淀出DNA。 DNA不溶于乙醇不溶于乙醇 。 乙醇可以吸附水分子（极性相同），使得溶液中乙醇可以吸附水分子（极性相同），使得溶液中相对的水分子减少，增大了相对的水分子减少，增大了DNA在水中的相对浓度。在水中的相对浓度。 乙醇沉淀乙醇沉淀DNA需要盐离子，用金属离子屏蔽需要盐离子，用金属离子屏蔽DNA上磷酸的负电荷，降低上磷酸的负电荷，降低DNA分子间的斥力，才能沉淀

8、分子间的斥力，才能沉淀完全。完全。 所以，之前须加入所以，之前须加入5M NaCl。6. 75%乙醇乙醇 洗涤作用，去除残余的金属离子。同时，洗涤作用，去除残余的金属离子。同时，保护保护DNA完整性，避免降解；抑制核酸酶活完整性，避免降解；抑制核酸酶活性。性。7. TE缓冲液缓冲液 TE缓冲液是缓冲液是Tris + EDTA缓冲液，一般用作缓冲液，一般用作溶解剂或保持剂，主要是调控溶解剂或保持剂，主要是调控pH。 TE缓冲液是弱碱性缓冲液是弱碱性,对对DNA的碱基有保护性。的碱基有保护性。 DNA在在TE提供的环境中稳定性较好提供的环境中稳定性较好,不易破坏其不易破坏其完整性或产生开环及断裂。

9、包括提取好的完整性或产生开环及断裂。包括提取好的DNA也也要放在要放在TE缓冲液中保存。缓冲液中保存。【操作】抽提组织加入裂解缓冲液制成匀浆抽提组织加入裂解缓冲液制成匀浆加入等体积的苯酚加入等体积的苯酚-氯仿试剂，缓慢颠倒氯仿试剂，缓慢颠倒5min后，后，2500rpm离心离心10min吸取上清液至干净离心管吸取上清液至干净离心管加入等体积氯仿加入等体积氯仿-异戊醇，摇匀异戊醇，摇匀5min，2500rpm离心离心10min记录上清液体积，记录上清液体积，吸取上清液至玻璃管吸取上清液至玻璃管，加入，加入5mol/LNaCl,并稀释至并稀释至0.3mol/L,再加入再加入2.5倍体积冰无水乙醇，

10、缓慢摇匀，出现絮状沉淀倍体积冰无水乙醇，缓慢摇匀，出现絮状沉淀2500rpm离心离心10min，弃去上清液，弃去上清液加入加入1ml 75%乙醇混匀，乙醇混匀，2500rpm离心离心5min。弃去上清液后再重复一次。弃去上清液后再重复一次沉淀沉淀DNA去除多余乙醇后，在快干时（半透明状）加入去除多余乙醇后，在快干时（半透明状）加入2ml TE缓冲液缓冲液检测检测DNA浓度、纯度浓度、纯度START加入等体积的苯酚加入等体积的苯酚-氯仿试剂，缓慢颠倒氯仿试剂，缓慢颠倒5min后，后，2500rpm离心离心10min 苯酚苯酚-氯仿试剂具有挥发性，对人体有毒。氯仿试剂具有挥发性，对人体有毒。故，使

11、用完毕后及时盖上试剂瓶盖，保持实验室故，使用完毕后及时盖上试剂瓶盖，保持实验室良好的通风。良好的通风。 如果发生试剂溅滴至皮肤、粘膜，务必及时如果发生试剂溅滴至皮肤、粘膜，务必及时用流动水冲洗。用流动水冲洗。记录上清液体积，吸取上清液至玻璃管，加入记录上清液体积，吸取上清液至玻璃管，加入5mol/LNaCl,并稀释至并稀释至0.3mol/L,再加入再加入2.5倍体积冰无水乙醇，缓慢摇匀，出现絮状沉淀倍体积冰无水乙醇，缓慢摇匀，出现絮状沉淀5mol/LVNaCl=0.3mol/L(V上清液上清液+VNaCl)VNaCl= （3V上清液上清液 ） / 47检测检测DNA浓度、纯度浓度、纯度 取完全

12、溶解后的取完全溶解后的DNA原液进行原液进行1:100稀释，稀释，即即1l原液原液 + 99l水，混匀。水，混匀。紫外分光光度计检测：紫外分光光度计检测： A260 = ? A280 = ? DNA纯度鉴定纯度鉴定A260 / A280 1.6 1.8 2.0酚、蛋白质污染酚、蛋白质污染视为纯度较视为纯度较高的高的DNARNA污染污染DNA浓度鉴定浓度鉴定DNA (g/ml) = A260 稀释倍数稀释倍数 50 1/光径光径DNA在在260nm处存在吸收峰处存在吸收峰检测时对于原检测时对于原液的稀释程度液的稀释程度1OD相当于：相当于：50 g/ml DNA40 g/ml RNA20 g/ml 寡核苷酸寡核苷酸四、注意事项l 组织抽提前应保存于液氮中，以免组织抽提前应保存于液氮中，以免DNA受到破坏；纯受到破坏；纯化时应时刻注意抑制核酸酶的污染，使用化时应时刻注意抑制核酸酶的污染，使用EDTA等防止等防止DNA降解。降解。l 剧烈振荡可使剧烈振荡可使DNA断裂，故操作时应尽量轻柔、缓慢断裂，故操作时应尽量轻柔、缓慢地颠倒混匀。地颠倒混匀。l 要获得高纯度要获得高纯度DNA，可加入蛋白酶，可加入蛋白酶K降解蛋白质。降解蛋白质。l DNA在在260nm处有一吸收峰，而蛋白质在处有一吸收峰，而蛋白质在280nm