生物电化学系统合成甲烷和乙酸

1、生物电化学系统还原二氧化碳同时合成甲烷和乙酸1收稿日期Received:接受日期Accepted: *国家自然科学基金项目(No. 31270166，No. 51074149) Supported by the National Natural Science Foundation of China(No. 31270166，No.51074149)*通讯作者Corresponding author(E-mail:lidp)蒋 永1,3 苏 敏1,2 张 尧1,3 陶 勇1 李大平1*(1 中国科学院成都生物研究所 成都 610064)(2 四川大学生命科学学院 成都 610041)（3中国科

2、学院大学 北京 100049）摘 要 近年来，采用生物电化学系统还原二氧化碳合成有机物已成为环境微生物学研究热点。本研究构建了具有电活性微生物的生物电化学系统，混合菌群通过电极直接传递或电极电子转化为氢气两种方式获得电子同时产生甲烷和乙酸。在设定阴极电势为-1100 mV时，甲烷生成速率为17.3 mL h-1 L-1, 乙酸生成速率为13.9 mg h-1 L-1, 总库伦效率可达94.0%。生物阴极群落构成包括了醋酸杆菌属(Acetobacterium)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)和甲烷微粒菌属(Methanocorpusculum)等功能微生物。该研究表明生物电化学系

3、统中，基于混合菌构建的生物阴极可以将二氧化碳还原为多种有机物，并且其中微生物的电子获得方式也存在多样性。图 4 表 0 参 33关键词 生物电化学系统；生物阴极; 二氧化碳；甲烷；乙酸 CLCSimultaneously production of methane and acetate from carbon dioxide in bioelectrochemical systems*JIANG Yong1,3，SU Min1,2，ZHANG Yao1,3，TAO Yong1 & LI Daping1*（1 Chengdu Institute of Biology, Chinese Acad

4、emy of Science, Chengdu 610041,China）(2 School of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China)(3University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)Abstract In recent years, reduction of CO2 to organics with bioelectrical system has been a research area of environmental mic

5、robiology. This study describes the performance of bioelectrochemical systems(BESs), based on electrochemically active mixed culture, capable of reducing CO2 to CH4 and CH3COOH via abiotically produced H2 gas and/or direct extracellular electron transfer. CH4 and CH3COOH were produced at rates of 17

6、.3mL h-1 L-1 and 13.9 mg h-1 L-1, respectively (at potential of -1100 mV). The current capture efficiency reached to 94.0% in batch potentiostatic experiments. Microbial characterization revealed that the microbial populations were consisting of Methanobacterium palustre, Methanocorpusculum parvum,

7、and acetogen Acetobacterium sp. These results suggest that mixed culture in BESs show the ability to convert CO2 into various organic cmoupands by accepting electrons in different ways.Keywords Bioelectrochemical systems; Biocathode; Carbon dioxide; Methane; Acetate生物电化学系统（Bioelectrochemical systems

8、 ，BESs)是一种能够实现从污水处理过程中回收电能的新型装置1, 2。近年来，BESs已应用于更多的领域，包括重金属回收3-6、硝酸盐还原7-9以及卤代烃脱氯10, 11。它的另一个重要应用就是能源物质，如氢气12和甲烷13等的生产。其中，利用BESs还原二氧化碳生产能源物质及有机化学品引起了越来越多的科研工作者兴趣14-21。该工艺过程不仅可以减少二氧化碳排放，而且还能同时生产高附加值的产品22。研究表明，微生物可以直接从电极或以产生的氢气两种方式将二氧化碳分别地转化为甲烷和乙酸。Cheng等14研究发现在阴极极化电位低于-700 mV (vs. Ag/ACl)时，产甲烷菌可以将二氧化碳还

9、原为甲烷。他们的研究证明，甲烷是由微生物利用电流转化直接生成，而不是通过氢气的还原。另一个基于产甲烷混合菌群的BESs15可以在较高的库伦效率（大于80%）下将二氧化碳转化为甲烷。在这一研究中，混合菌群直接从电极以及在电子转化为氢气两种方式获得电子还原二氧化碳合成甲烷。纯菌研究表明,多种产乙酸菌，包括Sporomusa sp, Clostridium ljungdahlii, Clostridium aceticum, 和 Moorella thermoacetica等均能够消耗电流进行二氧化碳还原。其还原产物主要是乙酸，其次是丁酸以及甲酸16, 17。该研究中，一个重要而且有趣的发现是，产乙

10、酸菌Acetobacterium woodii不能消耗电流。这一现象显示醋酸杆菌属(Acetobacterium sp)的细菌可能不具备通过与电极的相互作用中直接从电极获得电子的能力。产甲烷菌和产乙酸菌通常共存于一个生态系统中23, 24。因此，利用混合菌构成的生物阴极可能还原二氧化碳同时产生甲烷和乙酸。本研究在构建了富含产甲烷菌和产乙酸菌的混合菌群的BESs基础上，重点考察了功能微生物在特定阴极极化电位势下的甲烷和乙酸同步生成能力。通过循环伏安扫描法分析了菌群的电化学活性。并对阴极上的细菌和古菌菌群结构以及潜在的反应机理进行了分析，以期探讨系统中富集的产甲烷菌和产乙酸菌获得电子的方式。1 材

11、料与方法1.1 材料1.1.1 实验装置本实验采用之前报道的双室生物电化学系统结构改进而来25，双室由阳离子交换膜隔开，阴阳两室体积均为245 mL（ 7.0 cm 7.0 cm 5.0 cm）。阴极电极为碳毡（7.0 cm7.0 cm），阳极电极为钛板（5.0 cm4.0 cm）,钛丝用来连接各部分。参比电极采用 Ag/AgCl 电极（218型，上海雷磁，相对于氢标准电极电位为+197mV）。在本文中，除特别说明外，所有电位数据均相对于Ag/AgCl 电极。生物电化学系统电流的监测采用电化学工作站（EC550，武汉）。1.1.2 菌种来源 来自成都市第一污水处理厂的活性污泥1.1.3 培养基

12、成分 阴阳两室采用相同的培养基(L-1)：K2HPO43H2O 3.0 g, kH2PO4 11.8 g, NaHCO3 6.0 g，NaCl 1.0 g, NH4Cl 1.0 g, CaCl2 0.2 g，MgSO47H2O 0.15 g ,微量元素溶液10 mL26, 微生素溶液10 mL17。1.2 方法1.2.1 培养条件 为了快速有效地筛选出具有电生物合成活性的功能微生物，本实验采用氢气与电极两种电子供体的环境压力下进行功能菌的筛选。在生物电化学系统阴极室中加入220 mL培养基，并接种20 mL活性污泥。同时在阳极室中加入240 mL相同的培养基。在阴极室中通入二氧化碳与氢气的混合

13、气体进行循环曝气，运行四个周期，每个周期10天。其中氢气的比例逐步下降（CO2:H2=6:4,7:3,8:2,9:1）。同时，设定阴极极化电位为-950 mV（vs. Ag/AgCl）做为另一个电子供体来提供电子。每个周期结束后，监测甲烷和乙酸的积累量并置换90%的阴极室液体运行下一周期。在四个周期结束后，置换100%的阴极室液体并继续通入纯二氧化碳进行循环曝气。在这一过程中，检测到氢气和甲烷产生说明功能微生物的筛选成功，阴极生物膜已经形成。在富集了功能微生物后，设定极化电势为-1100mV来测试菌群的产甲烷和产乙酸能力。此后，设定极化电势为-600mV，并运行较长周期（20天），并检测生物电

14、化学系统在较高极化电势下的产物生成情况以期进一步分析系统中发生的反应。同时，设置了非生物的对照实验，其运行和分析条件与实验组相同。1.2.2 氢气和甲烷测定 采用气相色谱仪分析气相组分中氢气、甲烷含量（Agilent 7890A GC system: 3m 碳分子筛填充柱;载气为氩气30 mL min-1; 柱温 30; 热导检测器 80）。1.2.3 乙酸的测定 采用高效液相色谱仪（Agilent 1260 infinity）分析液相组分中乙酸含量。Ultimate C18色谱柱( 4. 6X250mm, 5 Lm) , 流动相为甲醇:0. 01 mol L-1 K2HPO4 ( 3：97)

15、溶液，用磷酸调节pH 值至2. 0。流速为0. 8 mL min-1,进样量20 u L, 检测波长210 nm, 柱温35。1.2.4 循环伏安扫描 采用三电极体系，以阳极为对电极，阴极碳毡为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极（0.195 V，Vs. SHE，上海雷磁），扫描范围为-1.00.4 V，速率为 5 mV/s。1.2.5 扫描电镜分析 从阴极碳毡取样后，用4%的戊二醛固定1. 0 h；用 pH为7.4浓度为100 mM磷酸缓冲液冲洗三次，每次 10 min；分别用浓度为 40%、70%、90%和 100% 的乙醇进行脱水，每次 10min；最后用异戊酸酯脱水2次，每次10 mi

16、n；经二氧化碳临界点干燥（CPD030 Critical Point Dryer）和离子溅射仪喷金（SCD005 Sputter Coater）后，用扫描电子显微镜（FEI QUANTA 200，荷兰）观察、成像。1.3.6 PCR-DGGE菌群分析 剪取一小块阴极碳毡以收集菌体；用基因组DNA快速提取试剂盒（北京百泰克公司）进行总DNA提取；以总DNA为模板，采用细菌通用引物P341f（CCT ACG GGA GGC AGC AG）/P518r（ATT ACC GCG GCT GCT GG）进行细菌群落组成分析，采用古菌通用引物109f (ACKGCTCAGT AACACGT)/518R（A

17、TT ACC GCG GCT GCT GG）进行古菌群落组成分析；采用Bio-Rad公司DcodeTM的基因突变检测系统对PCR反应产物进行分离和指纹图谱分析。DGGE凝胶电泳采用的聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，变性剂浓度30%-60%，60V电压下60电泳15 hr；采用QuantityOne软件分析DGGE图谱结果。利用MEGA4软件, 以邻接法( Neighbor -Joining , NJ) 绘制系统发育树.1.3.6 电化学效率计算 阴极累积电量（eqi）、累积还原当量(eqp)以及库伦效率的计算参考Villano的方法15，并考虑到CH4 、H2 和CH3COOH的摩尔转化系数分别为8

18、 eq mol-1、2 eq mol-1和 8 eq mol-1。2 结果与分析2.1 功能微生物的产甲烷和乙酸性能从图1A中可以看出，在极化电势为-1100 mV时，整个过程中阴极电流约60 mA。实验组氢气积累量较少（小于4.3 mL）。在如此高的电流下仅积累少量氢气，可能是由于微生物不需要通过氢气来获得电子或是阴极微生物对氢气有极高的利用和转化效率。甲烷和乙酸逐渐积累，经过10小时的反应甲烷达42.4 mL，甲烷生成速率为17.3 mL h-1 L-1。乙酸达34.1 mg, 乙酸生成速率为13.9 mg h-1 L-1。反应终产物包括氢气、甲烷和乙酸，总库伦效率可达94.0%（图1B）

19、。空白对照组仅产生微量氢气（小于0.4 mL）。对照组产氢情况与已报道的研究结果相似12, 15，可能原因是均采用了无贵金属催化的阴极。当极化电势设定为-600mV时，经过20天的反应，没有氢气，甲烷或是乙酸的生成。极化电势为-600mV时，碳电极上的电子几乎不能被转化成氢气16。没有检测到乙酸或甲烷的生成，一个重要的原因是系统中产甲烷菌要在低于-700mV时才具有电化学活性14。还可以推断，系统中产乙酸菌也不能直接利用电子生成乙酸。图1 微生物在极化电势为-1100 mV的批式实验 (A) H2, CH4, CH3COOH 和电流的时间曲线 (B) 累积电子转移量，产物回收电量（H2, CH

20、4和CH3COOH）以及总还原产物的库伦效率.Fig.1 Bioelectrochemical experiment at V = -1100 mV with the enriched mixed culture. (A) Time course of H2, CH4, CH3COOH and current. (B) Cumulative electric charge transferred, equivalents recovered as H2, CH4, CH3COOH and total electron recovery.2.2 循环伏安扫描分析反应周期结束时，分别对具有生物阴极

21、的实验组和非生物的对照组进行循环伏安扫描分析，结果如图2所示。实验组较对照组的菌群表现出很更强的生物电化学活性。二氧化碳的还原峰出现在-0.7 V，表明采用廉价生物阴极构建的本电化学系统可以降低二氧化碳还原的过电位27。如果采用更好的生物相容性修饰电极，还原峰出现的位置可能更正28，循环伏安扫描图谱表明此生物电化学系统的性能较好，但还可以进一步优化。 图2 实验组(a)与对照组(b)循环伏安扫描Fig.2 Cyclic voltammograms of Experiment (a) and Contrast (b)2.3 扫描电镜分析批式实验完成以后，通过SEM观察生物阴极上的微生物形态（图3

22、）。SEM表明电极表面的微生物形态呈现多样性, 表明电极上有多种微生物富集。在Cheng等的研究中，生物阴极上紧密地覆盖了形态结构相对单一的产甲烷菌，其二氧化碳的还原产物也仅有甲烷被检测到14。本研究富集的混合菌群形态更加多样，大部分呈现长杆状或短杆状，二氧化碳的还原产物包括甲烷和乙酸。微生物的多样性可能导致代谢途径和代谢产物的多样性并会随着生物电化学系统的运行条件和参数的变化做出响应。图3 生物阴极表面的微生物形态SEM观察Fig.3 SEM observations of the bacteria growing on the surface of the biocathode2.4 PC

23、R-DGGE 菌群分析 采用PCR-DGGE技术对实验组和对照组生物电化学系统中的微生物群落结构进行分析，结果如图4所示。PCR-DGGE条带割胶克隆测序比对分析表明，生物阴极主要由产甲烷古菌Methanocorpusculum sinense和Methanobacterium alcaliphilum，以及产乙酸菌Acetobacterium wieringae和 Acetobacterium paludosum等菌群构成。共存的其它细菌有Wolinella succinogenes，Desulfovibrio aminophilus和Bacteroides uniformis等。混合菌群中

24、的主要产甲烷菌与Cheng等人的研究结果相同14，表明系统中富集的产甲烷菌可以通过直接从电极以及氢气两种方式获得电子。混合菌群中的产乙酸菌与Acetobacterium woodii为同一个属，根据Nevin等17以及本研究中的批式实验结果，可以推断系统中富集的产乙酸菌不能直接从电极得到电子，而只能利用氢气将二氧化碳转化为乙酸。图4 生物阴极表面微生物DGGE指纹图谱和N-J系统发育树Fig.4 DGGE proles of 16 S rRNA fragments amplied from biocathode(left) and Neighbor-joining phylogenetic t

25、rees generated from 16 S rRNA sequences derived from the excised DGGE bands(right).3 讨论相对于纯菌研究而言，采用混合菌来构建生物反应器在环境技术领域适用范围广泛，更具有工程应用价值。混合菌构建的反应器中，微生物群落结构相对复杂，代谢途径更加丰富，不同种群之间可能存在多种相互依存关系。本研究利用基于混合菌的生物电化学系统实现了在还原二氧化碳的过程中，甲烷和乙酸的同时生成。结果表明，本研究提供的技术可以将二氧化碳还原为多种有机物，并且其中微生物的电子获得方式也存在多样性。该项技术可为进一步开发二氧化碳生物电化学还

26、原技术做铺垫，对同类研究具有借鉴作用。根据批式实验结果，循环伏安扫描，菌群结构分析以及Nevin的纯菌研究测试17推断生物阴极中发生的反应包括：CO2 +8H+ +8e- CH4 +2H2O; (1)2H+ +2e- H2; (2)CO2 +4H2 CH4 +2H2O; (3)2CO2+4H2 CH3COOH+2H2O; (4)从处理污染物或废弃物的过程中获得可利用的能源物质，如甲烷，一直是环境技术领域的研究热点。生物电化学系统用于二氧化碳的固定和转化来获得能源物质是一个非常有前景的研究领域。在该类技术的开发过程中，研究者也持续关注目标产物甲烷的获得13-15。但在另一方面，甲烷是一种比二氧化

27、碳更具有温室效应的气体，甲烷的溢出将给环境带来潜在的隐患29。从长远角度出发，还原二氧化碳生产高附加值化学品的技术更有引吸力。近年来，研究者相继报道了利用生物电化学系统还原二氧化碳以获得多种有机化合物16, 18。在以氢气为目标产物的生物电化学系统中，研究者尝试通过多种手段来抑制甲烷的生成，包括控制电极电势，优化运行参数等12。本研究揭示了基于混合菌的生物电化学系统用于还原二氧化碳时，产甲烷菌和产乙酸菌竞争性利用电子（氢气）和二氧化碳的复杂现象。对同类研究工作有一定的启发作用，但同时也对二氧化碳生物电化学还原过程的调控提出了更高的要求。此外，为使该技术更具有实际应用价值，一些影响因素如极化电势

28、、甲烷抑制剂的添加（如2-bromoethanesulfonic acid, BES30)，有毒化合物（如sulfide31, 32）的存在等都需要进一步考查，以对该系统有更加深入的认识并实现对产物生成途径的调控。研究表明，基因工程改造微生物18,33，微生物共培养34以及修饰电极材料35等手段能够显著地优化生物电化学系统的性能。因此，这些优化手段有望对该技术的研究和开发产生极大的促进作用。References1. Rabaey K, Rodrguez J, Blackall LL, Keller J, Gross P, Batstone D, et al. Microbial ecology

29、 meets electrochemistry: electricity-driven and driving communities. The ISME Journal. 2007, 1 (1): 918.2. Liu H, Ramnarayanan R, Logan BE. Production of electricity during wastewater treatment using a single chamber microbial fuel cell. Environmental Science & Technology. 2004, 38 (7): 22812285.3.

30、Gregory KB, Lovley DR. Remediation and recovery of uranium from contaminated subsurface environments with electrodes. Environmental Science & Technology. 2005, 39 (22): 89438947.4. Tandukar M, Huber SJ, Onodera T, Pavlostathis SG. Biological Chromium(VI) Reduction in the Cathode of a Microbial Fuel

31、Cell. Environmental Science & Technology. 2009, 43 (21): 81598165.5. Li Y, Lu A, Ding H, Jin S, Yan Y, Wang C, et al. Cr(VI) reduction at rutile-catalyzed cathode in microbial fuel cells. Electrochemistry Communications. 2009, 11 (7): 14961499.6. Huang L, Chai X, Chen G, Logan BE. Effect of Set Pote

32、ntial on Hexavalent Chromium Reduction and Electricity Generation from Biocathode Microbial Fuel Cells. Environmental Science & Technology. 2011, 45 (11): 50255031.7. Clauwaert P, Rabaey K, Aelterman P, De Schamphelaire L, Ham TH, Boeckx P, et al. Biological denitrification in microbial fuel cells.

33、Environmental Science & Technology. 2007, 41 (9): 33543360.8. Puig S, Serra M, Vilar-Sanz A, Cabre M, Baneras L, Colprim J, et al. Autotrophic nitrite removal in the cathode of microbial fuel cells. Bioresource Technology. 2011, 102 (6): 44624467.9. Zhan G, Zhang L, Li D, Su W, Tao Y, Qian J. Autotr

34、ophic nitrogen removal from ammonium at low applied voltage in a single-compartment microbial electrolysis cell. Bioresource Technology. 2012, 116 (0): 271277.10. Aulenta F, Canosa A, Reale P, Rossetti S, Panero S, Majone M. Microbial Reductive Dechlorination of Trichloroethene to Ethene With Electr

35、odes Serving as Electron Donors Without the External Addition of Redox Mediators. Biotechnology and Bioengineering. 2009, 103 (1): 8591.11. Aulenta F, Reale P, Canosa A, Rossetti S, Panero S, Majone M. Characterization of an electro-active biocathode capable of dechlorinating trichloroethene and cis

36、-dichloroethene to ethene. Biosens Bioelectron. 2010, 25 (7): 17961802.12. Cheng S, Logan BE. Sustainable and efficient biohydrogen production via electrohydrogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2007, 104 (47): 1887118873.13. Villano M, Monaco G, Aulenta F, Majone M. Electroche

37、mically assisted methane production in a biofilm reactor. Journal of Power Sources. 2011, 196 (22): 94679472.14. Shaoan Cheng DX, Douglas F. Call, and Bruce E. Logan*. Direct Biological Conversion of Electrical Current into Methane by Electromethanogenesis. Environ Sci Technol. 2009: 39533958.15. Vi

38、llano M, Aulenta F, Ciucci C, Ferri T, Giuliano A, Majone M. Bioelectrochemical reduction of CO2 to CH4 via direct and indirect extracellular electron transfer by a hydrogenophilic methanogenic culture. Bioresource Technology. 2010, 101 (9): 30853090.16. Nevin KP, Woodard TL, Franks AE, Summers ZM,

39、Lovley DR. Microbial Electrosynthesis: Feeding Microbes Electricity To Convert Carbon Dioxide and Water to Multicarbon Extracellular Organic Compounds. mBio. 2010, 1 (2): e00103-00110-e0010300110.17. Nevin KP, Hensley SA, Franks AE, Summers ZM, Ou J, Woodard TL, et al. Electrosynthesis of Organic Co

40、mpounds from Carbon Dioxide Is Catalyzed by a Diversity of Acetogenic Microorganisms. Applied and Environmental Microbiology. 2011, 77 (9): 28822886.18. Li H, Opgenorth PH, Wernick DG, Rogers S, Wu TY, Higashide W, et al. Integrated Electromicrobial Conversion of CO2 to Higher Alcohols. Science. 201

41、2, 335 (6076): 15961596.19. Kpke M, Held C, Hujer S, Liesegang H, Wiezer A, Wollherr A, et al. Clostridium ljungdahlii represents a microbial production platform based on syngas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2010, 107 (29): 1308713092.20. Rabaey K, Rozendal RA. Microbial electros

42、ynthesis revisiting the electrical route for microbial production. Nature Reviews Microbiology. 2010, 8 (10): 706716.21. Rabaey K, Girguis P, Nielsen LK. Metabolic and practical considerations on microbial electrosynthesis. Current Opinion in Biotechnology. 2011, 22 (3): 371377.22. Markewitz P, Kuck

43、shinrichs W, Leitner W, Linssen J, Zapp P, Bongartz R, et al. Worldwide innovations in the development of carbon capture technologies and the utilization of CO2. Energy & Environmental Science. 2012, 5 (6): 72817305.23. Angela R. Moss J-PJaJN. Methane production by ruminants: its contribution to glo

44、bal warming Ann Zootech. 2000, 49 (3): 231253 24. Breznak JA, Kane MD. Microbial H2/CO2 acetogenesis in animal guts: nature and nutritional significance. FEMS microbiology reviews. 1990, 7 (3-4): 309313.25. Su W, Zhang L, Li D, Zhan G, Qian J, Tao Y. Dissimilatory nitrate reduction by Pseudomonas al

45、caliphila with an electrode as the sole electron donor. Biotechnology and Bioengineering. 2012, 109 (11): 29042910.26. Muyzer G, Dewaal EC, Uitterlinden AG. Profiling of complex microbial-populations by denaturing gradient gel-electrophoresis analysis of polymerarse chain reaction-amplified genes-co

46、ding for 16s ribosomal-RNA. Applied and Environmental Microbiology. 1993, 59 (3): 695700.27. Zhao H-Z, Zhang Y, Chang Y-Y, Li Z-S. Conversion of a substrate carbon source to formic acid for carbon dioxide emission reduction utilizing series-stacked microbial fuel cells. Journal of Power Sources. 2012, 217: 5964.28. Zhao H, Zhang Y, Zhao B, Chang Y, Li Z. Electrochemical Reduction o