菌种保存、传代、使用、销毁管理规程-操作规程

1、菌种治理制度1、目的 建立菌种储存、传代、使用、销毁标准操作规程，规范微生物学检定用菌种的治理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳固性，从而确保微生物学检验结果的精确牢靠；2、适用范畴本规程适用于检定用菌种的治理，包括菌种的购买、储存、传代、使用及销毁等；3、定义.标准菌株是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏治理中心供应的冷冻干燥菌；.传代用菌种是指用标准菌株制备的采纳特定储存方法长期固定储存的菌种，用于传代及制备工作用菌种；.工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至一般琼脂斜面培育后，作为日常工作使用的菌种；.菌种的代是指将其接种至一新奇培育基上或培育基内，每萌发一次即称为

2、一代， 从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代；4、职责4.1 部门主管负责菌种的申购、接收、储存分发；4.2 微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁；5、规程5.1 菌种的申购部门主管依据菌种的使用情形，提出年度购买方案（包括暂时检验需要），填写申购流程，经审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌株）或传代用菌种，购买时，需确定菌种的代数，以便掌握传代代数；5.2 菌种的接收菌种到达试验室后， 由部门主管接收菌种， 检查其名称和数量， 以及每一支的完整性， 同时将菌种的全部信息，填写在标准菌株库存记录上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原

3、就编号） 、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于 48冰箱中，在一周内必需完成转种；5.3 菌种的储存5.3.1 工作用菌种的储存工作用菌种采纳斜面低温储存法；将菌种接种在相宜的琼脂斜面培育基上， 待菌生长充分以后，转移至 48冰箱中储存；此法仅用于工作用菌种的短期储存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情形，发觉反常情形，经应灭活处理后销毁；储存时间依据菌种种类而不同，细菌：每个月转种一次；酵母菌及芽胞：36 个月转种一次；丝状真菌每年转种一12 / 9次；5.3.2 传代用菌种的储存采纳甘油冷冻管保藏法或液体石蜡储存法；5.3.2.1 甘油冷冻管储存法用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增

4、菌后并接种至平板或琼脂斜面的菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中的无菌纯化水中，调整菌液浓度，使其等同于10 号比浊管，向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油（浓度20%），即为 10%甘油菌悬液，轻轻振摇，使内容物充分混合，分装于无菌小试管，在-30冷冻条件下储存；此甘油冷冻管为第2 代（g2）；可以每隔 2 年转种一代；使用时，取出一支放至室温，转种增菌培育或接种至琼脂斜面复苏，挑取纯菌落传代或工作用；此种方法主要适用于需氧细菌和酵母菌的保藏（如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌）；5.3.2.2 液体石蜡储存法5.3.2.2.1 无菌液体石

5、蜡的制备： 选用优质化学纯液体石蜡， 将液体石蜡分装加塞， 用牛皮纸包好，在 121灭菌 30 分钟,置 40恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用；5.3.2.2.2 液体石蜡管的制备： 将菌种穿刺接种于半固体高层培育基中， 在相宜条件下培育终止后，在层流台下用无菌吸管吸取上述无菌液体石蜡至培育好的菌种管内，并使石蜡高出菌种表面约 1cm 使菌体与空气隔绝，并将试管直立，置于-20冷冻或 28冰箱中储存；此法主要适用于霉菌、厌氧菌、放线菌、芽孢杆菌的储存（如枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌等） ；5.3.3 各菌种的储存方法、条件及期限，见下表1表 1 传代用菌种储存方法、储存温度、储存期限菌

6、种名称储存方法储存温度储存期限大肠埃希菌 cmccb44102金黄色葡萄球菌 cmccb26003铜绿假单胞菌（ cmc（c b） 10104）枯草芽孢杆菌 cmccb63501乙型副伤寒沙门菌 cmccb50094白色念珠菌 cmccf98001黑曲霉菌 cmccf980035.4 菌种的处理和保藏5.4.1 标准菌株的复苏、确认、传代5.4.1.1 标准菌株的复苏甘油冷冻管- 302 年液体石蜡管2- 81 年5.4.1.1.1 物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及 75%酒精棉球；5.4.1.1.2 培育基.改良马丁琼脂培育基：用于黑曲霉复苏、复壮；.液体硫乙醇酸盐培育基：用

7、于生孢梭菌复苏、复壮；.养分肉汤培育基：用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮；.改良马丁培育基：用于白色念珠菌复苏、复壮5.4.1.1.3 标准菌株的复苏操作步骤： 以下操作均在生物安全柜内进行；a) 在安瓿的外表面用 75%的酒精擦拭并让其自然风干；b) 用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开 （开启安瓿时必需当心， 由于安瓿遇热时可能会破裂） ；c) 以无菌方法用一无菌吸管从已预备好的上述液体培育基中移取0.50.8 ml 到安瓿中；d) 轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培育基充分混合并完全溶解；e) 用无菌吸管将

8、安瓿内菌液全部转接到相应的液体培育基；f) 依据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培育于相应的温度（细菌培育温度 30 35， 培育 1824 小时；真菌培育温度2328，培育 35 天；观看是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长； 如不浑浊， 细菌应延长培育时间至7 天，真菌应延长培育时间至 14 天， 如仍未浑浊，灭菌处理；g) 如黑曲霉为菌悬液，就先放置室温待菌悬液融解后用无菌吸管吸取管内液体12 滴滴在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布匀称，置23 28培育 57 天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接近菌层培育基略带黄色；确认后用含有 0.05%（ ml/ml ）的吐温

9、 -80 的 0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中；h) 取经复苏后的上述细菌菌液 8-10ml 至液体培育基中按 f）项操作对菌种进行复壮； 以无菌技术向复壮后的菌种中加入 100ml20%的无菌甘油混匀， 12ml/管，分装于冻存管；每个菌种制备 10 支，按次序进行编号，最终一支做为质控管进行质量掌握，即进行相应的确认，其余作为储备管在 -30冷冻条件下储存；黑曲霉按 g）项下方法进行复壮， 制成复壮后的孢子悬液20ml；以无菌技术向复壮后的菌种菌悬液中12ml/管加石蜡高出菌种表面约 1cm 使菌体与空气隔绝，并将试管直立，封存于冻存管，置于-20冷冻或 28冰箱中储存；制备 10

10、支，按次序进行编号，最终一支做为质控管进行质量掌握，即进行相应的确认；其余作为储备管； 将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签； 内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、 制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等；i) 储备菌种管制备胜利，储存于30，有效期为两年；5.4.1.2 标准菌株的确认a) 用无菌接种环取上述培育物接种到胰酪大豆胨琼脂（tsa）培育基（细菌）或沙氏葡萄糖琼脂培育基（真菌和酵母菌）平板上，或相应的宜于该菌生长的鉴别培育基平板上；b) 然后在 30 35下培育 3 天（细菌）； 2025下培育 5 天（真菌和酵母菌）；c) 培育后， 第一观看其是否具有典型的菌落形状， 然后挑取

11、生长旺盛的单一的纯菌落， 划线于平皿培育基， 每种菌划 4 个平皿， 以便收集较多的生长旺盛的典型单菌落， 进行储存和鉴定；d) 鉴定时作革兰氏染色、 镜检，观看其染色特性及形状特点； 必要时再做生化试验以进一步鉴定该菌种；e) 如在该平板上发觉有其它菌落生长，就说明操作有污染或菌种不纯，应将此被污染了的培育物灭活处理，并查找缘由；应依据其缘由实行措施重新分别选择纯菌落；g各菌种的复活、划线用培育基、培育条件，见菌种复活、划线用培育基、培育条件（附件 2）；f) 菌种的确认结果，记录在菌种鉴定记录上；5.4.1.3 菌种的传代5.4.1.3.1 标准菌株的传代a) 按菌种说明书要求复溶菌粉，转

12、种于相宜的增菌培育基内，称第1 代（g1），复壮后转接至平板上，并在适当温度下培育适当时间，分别单个纯种菌落，此为第2 代（ g2）；b) 菌种确认后， 挑取平板上纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管或液体石蜡管，作为储存菌种（ g2），也称传代用菌种，同时挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作用菌 种，此为第 3 代（ w3）；c) 将第 2 代（g2）菌种管冷冻储存，将工作用菌（ w3）于适当温度下培育适当时间后用于日常检验；d) 取一支冷冻储存的第 2 代（ g2）菌种转种于平板和斜面培育基上；平板上的菌种制成冷冻储存管第 3 代（g3）；斜面培育基的菌种经适当温度下培育适当时间后用作工作

13、用菌种，此仍为第 3 代（ w3）；e) 将第 3 代菌种（ g3）冷冻或低温储存，将生长、转种后的第2 代（ g2）菌种经高温灭活处理后丢弃；f) 按上述规程操作，直至 g4 转为 w5 为止，需重新开启冷冻干燥菌种，重复上述规程操作，储存和使用菌种；g) 当工作用菌种代数小于 5 时，在规定储存期限内， 可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种；5.4.1.3.2 传代用菌的传代将购回无反常的传代用菌种（一般为第3 代），依据日常检验工作的需要量，挑取纯菌落转接斜面菌种数支， 作为工作用菌种 为第 4 代，同时， 结合菌种的代数和最长储存期限，挑取纯菌落制成浓菌悬液按 “5.3.2传代

14、用菌种（仍为第3 代）；5.4.1.3.2.1 传代用菌的传代操作步骤”的方法制备甘油冷冻管或液体石蜡管数支，作为. 从冰箱冷藏室（ 28）中取出菌种斜面后，应温室放置约30min；. 将装有新奇配制的培育基和传代菌种一并移入生物安全柜内，打开紫外灯照耀 1 小时；. 关闭紫外灯；酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种环， 将接种环烧红约 30s，5.4.1.3.2 工作用菌种的传代当工作用菌种代数小于5 时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种；取在冰箱 48储存的工作用菌种用一般琼脂斜面传代，并将新传代的培育物替代原有的菌种，作为工作用菌种；也可取用“甘油冷冻管保

15、藏法或液体石蜡掩盖保藏法”储存的菌种， 进行复苏，直接作为工作用菌种；细菌每1 个月传代一次；酵母菌每 2 个月传代一次；霉菌及芽胞每 3 个月传代一次；当超过 5 代，须用传代用菌种传代；5.4.4 留意事项：传代时留意无菌操作，使菌株不死亡，不污染、不丢失；同时试验人员也要实行有效的预防措施进行自我爱护，如工作时必需穿工作服，佩带无菌手套，试验完成以后消毒试验进行的区域、试验仪器和器具；如发生意外，如菌种泄漏或人员受伤，微生物学检验人员应立刻向部门主管报告以便准时进行处理；5.4.5 传代后， 按检定菌种的编号原就编号， 并在每一支菌种管上贴上标签， 标签内容包括： 名称、编号、代数、传代

16、日期、操作人、有效期；交部门主管统一保管；同时准时填写菌种传代记录（附表 2）；5.5 检定菌种的编号采纳字母加数字表示：英文缩写字母 代次 传代日期 次序号菌种的英文缩写字母：大肠埃希菌（ e.c）、金黄色葡萄球菌（ s.a）、枯草芽孢杆菌（ b.s）、白色念珠菌（ c.a）、黑曲霉菌（ a.n ）、乙型副伤寒沙门菌（ s.p）代数用一位带有下标数字 的字母表示： 传代用菌种用 g 表示；工作用菌种用 w 表示；如 g3 表示传代用菌种第 3 代； w3 表示工作用菌种第 3 代；传代日期用 6 位数字表示：年份取最终两位数，月、日分别用两位数；如：2021 年 1 月 12日传代的第一支大

17、肠埃希菌作为传代用菌种的编号为e.c-g3-120212-01；5.6 检定菌种的保管5.6.1 检定菌种设专人加双锁保管， 并对所储存的菌种建立 检定菌种储存、 领用登记台账（附表 3）；5.6.2 检定菌种的定期检查与鉴定在菌种的储存期间，工作日应每天检查储存菌种冰箱的温度、必要时检查菌种管的塞子是否松动，是否染杂菌等，并准时填写检定菌种观看记录 （附表 4），如有反常应准时处理；菌种在储存期内均应依据菌种的特性（工作用菌种每转种两代一次、传代用菌种每三个月一次）检查其菌落性状、革兰染色、显微镜下菌体形状，必要时检查生化特性等项目，如发觉与原菌种变异较大，应重新分别、纯化、鉴定、再加以储存

18、，并做好检定菌种鉴定记录（附表 5）；5.6.3 所保管的菌种，不能随便转让其他单位和个人，需要时应有单位证明和批准手续方可供应；5.7 检定菌种的使用5.7.1 微生物学检验人员依据检验需要，需到部门主管领取工作用菌种或传代用菌种，同时填写检定菌种储存、领用登记台账 ；5.7.2 微生物学检验人员从部门主管领取工作用菌种或传代用菌种，用于日常检验或验证试验，使用后准时填写检定菌种使用登记台账（附表 6），以便追踪菌种使用历史；5.7.3 菌液的制备：将新奇的斜面菌种培育物用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数为10-100cfu/ml 的菌悬液，置于 04冰箱冷藏，用于阳性对比试验

19、，使用期 24h，浓菌液放冰箱可储存一周；5.8. 检定菌种（废弃）的销毁5.8.1 以下情形的菌种或培育物或被污染的器具等， 必需采纳 121、45 分钟湿热灭活处理：a、新一代菌种制备胜利后的上一代菌种；b、使用完后的菌种和带有标准菌株的器具和培育物； c、超过有效期的菌种；d、凡被污染、变异、可疑等反常情形菌种； e、其他应废弃的菌种；5.8.2 废弃菌种的销毁由微生物检验员提出申请，交部门主管批准后，进行灭活处理，并有其他人在场监督，并填写废弃菌种（物品）销毁处理记录（附表 7）；6、相关文件：初始污染菌检查标准操作规程 、纯化水检测标准操作规程 、中国药典标准操作规程等；7、留意事项

20、：8.1 、微生物检验人员最好生物相关专业，要经过培训，取证上岗；8.2 、购买菌种要保留相关证明，最好让药检所开个证明，说明购买菌种的名称、菌种代数、数量等，把这个证明附在菌种接受记录后；8.3 、菌种的传代、使用在阳性操作间，为爱护菌种和人员，最好使用生物安全柜；8.4 、菌种常用的是 10-100cfu/ml 的菌悬液，可依据预试验，确定制备方法；假如是细菌：可参照麦氏标准管进行估算；从孵育 18-24 小时的非选择性培育基上，挑取3-5 个菌落，直接用肉汤或盐制成悬液作为接种，一般将浊度调整至麦氏比浊标准管10 号对应浓度，然后稀释；麦氏比浊管配制方法：0.048mbacl 21.17%w/vbacl 2 2h2 o 、0.36nh2so41%v/v将二液混合，置螺口试管中，放室温暗处储存，用前混匀；有效期为6 个月；应用时，可目测或使用比浊仪即可；0号管对应的菌浓度为30108cfu/ml ，稀释一般用无菌生理盐水（ 0.9%氯化钠溶液）；8、附表附表 1：检定菌接收记录附表 2：检定菌种传代记录附表 3：检定菌种储存、领用登记台账附表 4：检定菌种观看记录附表 5：检定菌种鉴定记录附表 6：检定菌种使用登记台账附表 7：废弃菌种（物品）销毁处理记录附表 1：检定菌接收记录：鉴定