NO38基因工程课件

1、NO38基因工程复习检查：复习检查：1.1.基因工程概念？原理？基因工程概念？原理？2.2.基因工程操作的基本工具有哪些？基因工程操作的基本工具有哪些？3.3.限制性核酸内切酶的来源？特性？作用部位？结果？限制性核酸内切酶的来源？特性？作用部位？结果？4.DNA4.DNA连接酶的分类？作用？连接部位？连接酶的分类？作用？连接部位？5.DNA5.DNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶的区别？聚合酶的区别？6.6.常用的运载体有哪些？作为运载体必须具备的条件常用的运载体有哪些？作为运载体必须具备的条件? ?7.7.基因工程的操作步骤？核心？基因工程的操作步骤？核心？8.8.基因文库？基因组文库？

2、部分基因文库？基因文库？基因组文库？部分基因文库？cDNAcDNA？9.PCR9.PCR技术扩增目的基因的原理？条件？前提？过程？技术扩增目的基因的原理？条件？前提？过程？10.10.基因表达载体构建的目的？基因表达载体的组成？基因表达载体构建的目的？基因表达载体的组成？11.11.目的基因导入植物细胞的方法目的基因导入植物细胞的方法? ?最常用方法及原理最常用方法及原理? ?1212导入动物细胞的方法导入动物细胞的方法? ?受体细胞是受体细胞是? ?导入微生物的方法导入微生物的方法? ?13.13.基因工程从分子水平检测可分别检测哪些对象基因工程从分子水平检测可分别检测哪些对象? ?如何检测

3、如何检测? ?从个体水平如何鉴定从个体水平如何鉴定? ?NO38基因工程考点一：基因工程的基本工具线性考点一：基因工程的基本工具线性【典例【典例1 1】 已知某种限制性内切酶在一线性已知某种限制性内切酶在一线性DNADNA分子上有分子上有3 3个酶切个酶切位点，如图中箭头所指，如果该线性位点，如图中箭头所指，如果该线性DNADNA分子在分子在3 3个酶切位点上都个酶切位点上都被该酶切断，则会产生被该酶切断，则会产生a a、b b、c c、d d四种不同长度的四种不同长度的DNADNA片段。现在片段。现在多个上述线性多个上述线性DNADNA分子，若在每个分子，若在每个DNADNA分子上至少有分子

4、上至少有1 1个酶切位点被个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后，这些线性经该酶切后，这些线性DNADNA分子最多能产生长度不同分子最多能产生长度不同的的DNADNA片段种类数是（片段种类数是（ ）A A3 B3 B4 4 C C9 D9 D1212【典例【典例2 2】镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因碱基序列发生】镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因碱基序列发生了改变。检测这种碱基序列改变必须使用的酶是了改变。检测这种碱基序列改变必须使用的酶是 （ ）A A解旋酶解旋酶B.DNAB.DNA连接酶连接酶C.C.限制性内切酶限制性内切酶D.DNAD.DNA聚合酶

5、聚合酶 【典例【典例3 3】下列有关基因工程中限制内切酶的描术，错误的是（）】下列有关基因工程中限制内切酶的描术，错误的是（）A. A. 一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B. B. 限制性内切酶的活性受温度的影响限制性内切酶的活性受温度的影响C. C. 限制性内切酶能别和切割限制性内切酶能别和切割RNA RNA D D、限制性内切酶可从原核生物中提取、限制性内切酶可从原核生物中提取线性线性DNA分子的酶切示意图分子的酶切示意图NO38基因工程【归纳点拨】【归纳点拨】1 1、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可、要

6、想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？产生几个黏性末端？2 2、如果把两种来源不同的、如果把两种来源不同的DNADNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？用同一种限制酶来切割，会怎样呢？3 3、大多数限制酶识别的序列由几个核苷酸组成？、大多数限制酶识别的序列由几个核苷酸组成？4 4、平末端是从识别序列的什么部位切开？、平末端是从识别序列的什么部位切开？5 5、Ecoli DNAEcoli DNA连接酶连接酶 T4 DNAT4 DNA连接酶在缝合的时候有什么不同？连接酶在缝合的时候有什么不同？6 6、DNADNA连接酶和连接酶和DNADNA聚合酶是一回事吗？聚合酶是一

7、回事吗？7 7、DNADNA水解酶和水解酶和DNADNA解旋酶的作用和上面两种酶有什么不同？解旋酶的作用和上面两种酶有什么不同？8 8、质粒有哪些特点？、质粒有哪些特点？2个，个， 4个个产生相同的黏性末端产生相同的黏性末端绝大多数绝大多数6个，少数为个，少数为4、5、8个。个。中心轴线中心轴线Ecoli DNA连接酶连接黏性末端连接酶连接黏性末端 ； T4 DNA连接酶连接黏性末连接酶连接黏性末端端 和平末端和平末端不是不是DNA水解酶水解磷酸二酯键将水解酶水解磷酸二酯键将DNA分子水解为游离的脱氧核苷酸；分子水解为游离的脱氧核苷酸；DNA解旋酶破坏解旋酶破坏DNA的氢键，使其变为单链结构。

8、的氢键，使其变为单链结构。 能自我复制能自我复制 有一个到多个限制酶有一个到多个限制酶识别位点识别位点 具有标志基因具有标志基因NO38基因工程【针对训练【针对训练1 1】以下说法正确的是】以下说法正确的是 （ ）A A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接外源基因连接D D、基因控制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来【针对训练【

9、针对训练2 2】不属于质粒被选为基因运载体的理由是（】不属于质粒被选为基因运载体的理由是（ ） A A、能复制、能复制 B B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C C、具有标记基因、具有标记基因 D D、它是环状、它是环状DNADNANO38基因工程考点二：基因工程的基本步骤考点二：基因工程的基本步骤【典例【典例3 3】为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱】为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。稻新品系。（1 1）获得耐盐基因后，构建重组）获得

10、耐盐基因后，构建重组DNADNA分子所用的限制性内切酶作用分子所用的限制性内切酶作用于图中的于图中的 处，处，DNADNA连接酶作连接酶作用于用于 处。（填处。（填“a”a”或或“b”b”）（2 2） 将重组将重组DNADNA分子导入水稻分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和化法和 法。法。（3 3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术。该技术的核心是技术。该技术的核心是 和和 。（4 4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的

11、素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要用作探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。 aa基因枪基因枪脱分化脱分化 再分化再分化目的基因目的基因一定浓度盐水浇灌一定浓度盐水浇灌植物组织培养技术植物组织培养技术NO38基因工程【归纳点拨】【归纳点拨】（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1.1.从基因文库中获取从基因文库中获取基因文库的构建方法（动手写出构建流程）基因文库的构建方法（动手写出构建流程）1 1）直接分离法：）直接分离法： 2 2）反转录法：）反转录法：某生物体中全部某生物体中全部DNADNA 限制酶限制酶许多许多DNAD

12、NA片段片段 与运载体连接与运载体连接 导入导入受体菌群受体菌群从中直接分离从中直接分离目的基因的目的基因的mRNAmRNA 反转录反转录单链单链DNADNA片段片段 合成合成双链双链DNADNA 与运载体连接与运载体连接 导入导入 受体菌群受体菌群NO38基因工程2.2.利用利用PCRPCR技术扩增目的基因：技术扩增目的基因：（1 1）PCRPCR技术概念：技术概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_ _ 的核酸合成技术的核酸合成技术 原理：原理：_（2 2）条件：）条件：_、_、_ _ _ 、 _._.前提条件：前提条件： _. （3 3）扩增过程：）扩增

13、过程：a a变性（变性（ ）：目的基因）：目的基因DNADNA受热变性后接连为单受热变性后接连为单链链b b退火（退火（ ）：）： 与单链相应互补序列结与单链相应互补序列结合合c c延伸（延伸（ ）：在）：在 的作的作用下进行延伸用下进行延伸TaqTaq酶的特点是酶的特点是 。聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外 特定特定DNA片段片段DNA双链复制原理双链复制原理原料：四种脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷酸 模板模板酶：热稳定的酶：热稳定的DNA聚合酶聚合酶 能量能量引物引物90955560 引物引物7075 热稳定热稳定DNA聚合酶聚合酶热稳定热稳定NO38基因工程PCRPCR技术与技术与DN

14、ADNA复制的比较：复制的比较：3.3.人工合成人工合成当基因较小，核苷酸序列已知时，可以用人工方法合成（例如，当基因较小，核苷酸序列已知时，可以用人工方法合成（例如，通过通过 直接合成）。直接合成）。PCRPCR技术技术DNADNA复制复制相相同同点点原理原理原料原料条件条件不不同同点点解旋方式解旋方式场所场所酶酶结果结果DNA双链复制双链复制四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸原料、模板、酶、能量原料、模板、酶、能量加热加热 解旋酶解旋酶体外体外 细胞内细胞内Taq酶酶 解旋酶、解旋酶、DNA聚合酶聚合酶目的基因扩增目的基因扩增 DNA数目加倍数目加倍DNA合成仪合成仪NO38基因工程NO38基因

15、工程（二）基因表达载体的构建（核心）（二）基因表达载体的构建（核心）1.1.过程：过程：用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切口，质粒，使其出现一个切口，露出露出_。用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_。将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）基因表达载体的组成：复制原点基因表达载体的组成：复制原点+ + + + 。+ + + + 。思考：思考：1 1、绘一个基因表达载体示意图：、绘一个基因表达载体示意图： 2 2、构建表达载体的目的是

16、什么？、构建表达载体的目的是什么？限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶相同黏性末端相同黏性末端切口切口DNA连接酶连接酶启动子启动子 目的基因目的基因终止子终止子 标记基因标记基因使目的基因在受体细胞中稳定存在，使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。并且可以遗传给下一代。NO38基因工程（三）将目的基因导入受体细胞（三）将目的基因导入受体细胞1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞（1 1）农杆菌转化法：）农杆菌转化法：转化：目的基因进入受体细胞内，并且在转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为受体细胞内维持稳定和表达

17、的过程，称为。农杆菌特点：农杆菌特点：在自然条件下能感染在自然条件下能感染植物和植物和 植物，对植物，对 植物没有感染力；植物没有感染力；TiTi质粒的质粒的 可以转可以转移至受体细胞，并整合到受体细胞的移至受体细胞，并整合到受体细胞的上。上。（2 2）基因枪法又叫）基因枪法又叫。（3 3）花粉管通道法：利用花粉管通道使目的基因进入）花粉管通道法：利用花粉管通道使目的基因进入，然后进入然后进入。2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞（1 1）方法：）方法：。（2 2）操作程序：目的基因的）操作程序：目的基因的提纯提纯取卵（受精卵）取卵（受精卵） 移植子宫内发育移植子宫内发育新性

18、状动物新性状动物3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞（1 1）原核生物的特点：）原核生物的特点：。（2 2）常用的受体细胞：）常用的受体细胞：。（3 3）转化：）转化：处理细胞处理细胞 细胞细胞表达载体与表达载体与感受态细胞混合感受态细胞混合感受态细胞吸收感受态细胞吸收分子，完成转化。分子，完成转化。转化转化双子叶双子叶 裸子裸子绝大多数单子叶绝大多数单子叶T-DNA微弹轰击法微弹轰击法花粉管花粉管受体细胞受体细胞显微注射技术显微注射技术表达载体表达载体采用显微注射仪进行显微注射采用显微注射仪进行显微注射繁殖快、多为单细胞、一遗传物质相对较少繁殖快、多为单细胞、一遗传物质

19、相对较少Ca2+感受态感受态DNA染色体染色体DNANO38基因工程 目的基因插入目的基因插入TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA上上 农杆菌农杆菌 导入植物细胞导入植物细胞 整合到受体细胞的染色体上整合到受体细胞的染色体上 目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达农杆菌特点：农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。易感染双子叶植物和裸子植物。TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA可转移至受体细胞的染色体上可转移至受体细胞的染色体上2.转转化化NO38基因工程（四）目的基因的检测与测定（四）目的基因的检测与测定1 1）检测转基因生物的）检测转基因生物的 上

20、是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测方法：检测方法： 技术，即将转基因生物的基因组技术，即将转基因生物的基因组DNADNA提取出来，在含有目的基因的提取出来，在含有目的基因的DNADNA片段上用放射性同位素等作片段上用放射性同位素等作标记，以此作为标记，以此作为 ，使探针与基因组，使探针与基因组DNADNA杂交，如果出杂交，如果出现现 ，就表明目的基因已插入染色体，就表明目的基因已插入染色体DNADNA中。中。（2 2）检测目的基因是否）检测目的基因是否 ：检测方法：检测方法： 技术技术（3 3）检测目的基因是否）检测目的基因是否 ，检测方法：检测方法： ，从转基因生物中提取蛋白质，从转

21、基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行检测，若有用相应的抗体进行检测，若有 出现，表明目的基因出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。已形成蛋白质产品。（4 4）进行）进行 水平的鉴定水平的鉴定染色体染色体DNADNA分子杂交分子杂交探针探针杂交带杂交带转录出转录出mRNA分子杂交分子杂交翻译成蛋白质翻译成蛋白质抗原抗原抗体杂交抗体杂交杂交带杂交带个体个体NO38基因工程NO38基因工程3.下表关于基因工程中有关基因操作下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是的名词及对应的内容，正确的组合是4 4、下列属于获取目的基因的方法的是、下列属于获取目的基因的方法的是( )( )利用

22、利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成从基因组文库中提取从基因组文库中提取从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术技术 利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合成A.A. B. B. C. C. D. D.NO38基因工程5.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测C增加质粒分子的分子量D便于与外源基因连接6.6. 有关基因工程的叙述正确的是有关基因工程的叙述正确的是A限制酶只在获得目的基因时才用

23、B重组质粒的形成是在细胞内完成的C质粒都可作为运载体 D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料NO38基因工程NO38基因工程1.1.下列关于基因工程的叙述，下列关于基因工程的叙述，错误错误的是（的是（ ）A A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B B限制性核酸内切酶和限制性核酸内切酶和DNADNA连接酶是两类常用的工具酶连接酶是两类常用的工具酶C C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D D载体上的抗性基因有利于筛选含重组载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNADNA的细胞和促进目的

24、基因的细胞和促进目的基因的表达的表达NO38基因工程3.DNA3.DNA测序工作中，需要将某些限制性内切酶的限制位点在测序工作中，需要将某些限制性内切酶的限制位点在DNADNA上定上定位，使其成为位，使其成为DNADNA分子中的物理参照点。这项工作叫做分子中的物理参照点。这项工作叫做“限制酶图限制酶图谱的构建谱的构建”。假设有以下一项实验：用限制酶。假设有以下一项实验：用限制酶HindHind，BamH IBamH I和二和二者的混合物分别降解一个者的混合物分别降解一个4kb(1kb4kb(1kb即即1 1千个碱基对千个碱基对) )大小的线性大小的线性DNADNA分分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，如下图所示：如下图所示：据此分析，这两种限制性内切酶在该据此分析，这两种限制性内切酶在该DNADNA分子上的限制位点数目是分子上的限制位点数目是以下哪一组以下哪一组? ?A A、HindlHindl