凝胶过滤层析gelfiltrationchromatography

1、凝胶过滤层析 gel filtration chromatogra phy 定义凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用, 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离 物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻 物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻 层析（size 层析（size exclusion chromatography）、分子筛 chromatography）、分子筛 层析（Molecular 层析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗 Chromat

2、ography）、凝胶渗 透层析（Gel 透层析（Gel Permeation Chromatography） Chromatography）应用凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多 肽、激素、多糖、核酸类等物质。 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一 凝胶床就可以完全将它们分开。 利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液 进行脱盐、去热源和脱色。 进行脱盐、去热源和脱色。原理凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每 个颗粒犹如一个筛子。 小分子进入 当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子 当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子 葡聚糖珠内 质量较大的物质沿着

3、凝胶颗粒间的孔 质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔 隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱； 相对分子质量较小的物质可自由地进 相对分子质量较小的物质可自由地进 大分子不 出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移 能进入珠 内，经珠 动速率慢而最后流出层析柱。 之间缝隙 中等大小的分子在大分子物质与小分 中等大小的分子在大分子物质与小分 流出 子物质之间被洗脱。 这样，经过层析柱，混合物中的各物 质按其分子大小不同而被分离。带网孔的 葡聚糖珠固定相（凝胶） 固定相（凝胶）三维空间网状结构小分子样品 流 动 相 大分子分子筛效应： 分子筛效应： 按分子大小不同, 按分子大小不同,在凝胶受到的 阻滞作用有差异 有

4、差异, 阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝 胶柱中的迁移速度不同得到分离。 胶柱中的迁移速度不同得到分离。小分子 被延滯固 定 相较快流出基本概念外水体积(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积， 外水体积(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒 (Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积 间液体流动相的体积。 间液体流动相的体积。 内水体积(Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积。 内水体积(Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积。 (Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积 基质体积(Vg)是指凝胶颗粒实际骨架体积。 基质体积(Vg)是指凝胶颗粒实际骨架体积。 (Vg)是指凝胶颗粒实际骨架体积

5、柱床体积 (Vt)就是指凝胶柱所能容纳的总体积。 柱床体积(Vt)就是指凝胶柱所能容纳的总体积。 (Vt)就是指凝胶柱所能容纳的总体积 洗脱体积(Ve) 洗脱体积(Ve)是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积 (Ve)是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分） 凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）分配系数（Kd）每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数Ve=Vo+Kd Ve=Vo+KdVi KdViVo， (1)Ve = Vo，Kd = 0 分子完全被排阻于凝胶颗粒之外 全部分布于流动相里 最先流出 Vi， (2)Ve = Vo + Vi

6、，Kd = 1 分子完全不被排阻 完全向凝胶颗粒内部扩散 在两相分配的比值为1, 1,最后流出 在两相分配的比值为1,最后流出 <1， (3) 0 <Kd <1，Ve = Vo +ViKd 为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩 散特点： 特点：与被分离物质分子的 大小和凝胶颗粒孔隙的大小 有关 Kd=0大分子量 小分子量0 0Kd<1 Kd=1洗脱体积典型的凝胶类型交联葡聚糖凝胶：Sephadex? 交联葡聚糖凝胶：Sephadex? 聚丙烯酰胺凝胶：Sephacryl ? 聚丙烯酰胺凝胶： 琼脂糖凝胶：Sepharose和Bio-Gel? 琼脂糖凝胶：Sepharose和B

7、io-Gel? 其它：有机凝胶Sepharon Sepharon， 其它：有机凝胶Sepharon，交联聚醚 Toyopeal，纤维素凝胶， Toyopeal，纤维素凝胶，改性刚性填料等葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶（Sephadex） 葡聚糖凝胶（Sephadex）具有 良好的化学稳定性， 良好的化学稳定性，是目前生 化产品制备中最常用的凝胶。 最常用的凝胶 化产品制备中最常用的凝胶。 基本骨架：葡聚糖（dextran）; 基本骨架：葡聚糖（dextran） 交联剂： ,2交联剂：3-氯-1 ,2-环氧氯丙 烷使葡聚糖之间通过醚键交联 聚合而成的三维空间网状结构 葡聚糖凝胶网孔大小可通过调 节交联剂和

8、葡聚糖的配比及反 应条件来控制。交联度越大， 应条件来控制。交联度越大， 网孔越小，吸水膨胀就越小。 网孔越小，吸水膨胀就越小。 交联度越小，网孔越大， 交联度越小，网孔越大，吸水 膨胀就越大交联葡聚糖凝胶的化学结构Sephadex G系列凝胶的分级范围 G10 <700 D G15 <1,500 G25 1,000 5,000 G-50 1,50030,000 G-75 3,00070,000 G100 4,000 150,000 G150 5,000 400,000 G200 5,000 800,000葡聚糖凝胶1理化性质 葡聚糖凝胶的外观为白色珠状颗粒。 它带有大量的羟基，亲

9、水性好，因此在水溶液或电解质溶液中极 易膨胀。 由于各种型号的葡聚糖凝胶的交联度不同，致使如下理化性质 理化性质在 理化性质 水中的有明显的差异： 膨胀度(床体积) 膨胀度 吸水量(每克干凝胶在水中充分膨胀时所需的水量) 吸水量筛孔的大小 分级范围 葡聚糖凝胶的型号不同，其 性质亦不一样分类以G型葡聚糖凝胶(经水溶液膨胀)作为固定相，以水 溶液作为流动相，对水溶性物质 水溶性物质 水溶性物质进行分离的层析方法 称为葡聚糖凝胶过滤层析 葡聚糖凝胶过滤层析。 葡聚糖凝胶过滤层析 以LH型葡聚糖凝胶(经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或N、N二甲基甲酰胺等有机溶剂膨胀)作为固定相，以有机 有机 溶剂为流动相，对

10、脂溶性物质 脂溶性物质 溶剂 脂溶性物质进行分离的层析方法称 为葡聚糖凝胶渗透层析 葡聚糖凝胶渗透层析。 葡聚糖凝胶渗透层析2稳定性 葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中 是稳定的、不溶解的，而且很少产生化学降解。 在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温(120)消毒0.5h，其 性质并不改变。 在0.1molL HCl溶液中浸泡12h，甚至在0.02molL HCI溶液中 浸泡6个月以上，对分离效果无明显的影响。 当暴露于强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂，因此， 要避免与其接触。 葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如氯仿、 0.05NaN3或20

11、乙醇等，不然微生物将生长。3吸附性 葡聚糖凝胶系弱酸性物质， 葡聚糖凝胶系弱酸性物质，这是由于其每克干胶中含 10-20g当量的羧基基团所致。 10-20g当量的羧基基团所致。 羧基基团能与分离物中电荷基团 尤其是碱性蛋白质) 羧基基团能与分离物中电荷基团 (尤其是碱性蛋白质) 发生吸附作用。 发生吸附作用。 这种吸附作用可以借助提高洗脱液的离子强度得以克 这种吸附作用可以借助提高洗脱液的离子强度得以克 服。 当离子强度大于0 05时 一般对弱碱性蛋白质就无 当离子强度大于0.05时，一般对弱碱性蛋白质就无 吸附力了 吸附力了。 因此，常用含有NaCl的缓冲液作洗脱液。 因此，常用含有NaCl

12、的缓冲液作洗脱液。琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose)琼脂糖是从琼脂中分离出来的。 琼脂糖是从琼脂中分离出来的。 在制备过程要将其中含硫酸根和羧基基团的琼脂胶除 在制备过程要将其中含硫酸根和羧基基团的琼脂胶除 去，得到不带电荷基团的琼脂糖。 得到不带电荷基团的琼脂糖。 琼脂糖是由D 半乳糖和 琼脂糖是由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接构成 脱水的L 半乳糖连接构成 的多糖链。 多糖链。 这种多糖链在100 左右时呈液态， 这种多糖链在 100 左右时呈液态 ， 当温度下降到 45以下时呈固态。 45以下时呈固态。 它们之间以氢键方式相互连接就成了线性的双链单环 它们之间以氢键方式相互

13、连接就成了线性的双链单环 的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。 的琼脂糖，经凝聚即 呈束状的琼脂糖凝胶。该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵 该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵 抗力， pH4 抗力，在pH4.0-9.0的缓冲液中是稳定的。 的缓冲液中是稳定的。 琼脂糖凝胶室温保存， 琼脂糖凝胶室温保存，其物理稳定性超过了聚丙烯酰 胺和葡聚糖凝胶。 胺和葡聚糖凝胶。 琼脂糖凝胶在干燥状态下保存时易破裂， 琼脂糖凝胶在干燥状态下保存时易破裂，故一般存放 在含防腐剂的水溶液中，同时还要避免剧烈的搅动。 含防腐剂的水溶液中 同时还要避免剧烈的搅动。 琼 脂 糖 凝 胶 按 其

14、 浓 度 来 分 有 Sepharose 2B(2 ) 、 B(2 4B(4)和6B(6)。 B(4 B(6 Sepharose 6B 的机械强度大于 2B ， 但是筛孔小于 的机械强度大于2 2B。琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝 胶好。用琼脂糖凝胶进行柱层析时，流速可以快些 流速可以快些。 流速可以快些 大孔凝胶， Sephadex的上限 大孔凝胶，工作范围的下限几乎是 Sephadex的上限 可分离MW40万以上 MW40万以上的物质 可分离MW40万以上的物质 可用来分离核酸及病毒三、聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶的商品名称为Bio-gel。 它是以甲撑双丙烯酰胺 甲撑双丙

15、烯酰胺(双体)作交联剂 交联剂，以过 甲撑双丙烯酰胺 交联剂 硫酸铵作催化剂， 硫酸铵 在N,N,N,N,- 四甲基乙二胺(TEMED TEMED)加速剂 TEMED 的作用下， 丙烯酰胺(单体)聚合而成的。 将丙烯酰胺 丙烯酰胺 当改变单体浓度时，就可得到吸水率不同的产 物。凝胶过滤层析实验技术1、凝胶的选择 2、凝胶的预处理 3、装柱 4、样品的准备 5、上样 6、洗脱和收集 7、凝胶的再生及保存凝胶过滤层析实验技术1、凝胶的选择选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。 选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取 何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质， 何种凝胶

16、及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括 凝胶的分离范围 渗入限与排阻限）、理化稳定性、强度、 分离范围（ ）、理化稳定性 凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）、理化稳定性、强度、 非特异吸附性质等 非特异吸附性质等。 对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。一种是只将 对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。 分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类 分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类 分子量相差不很大的物质加 分离或组分离。另一类则是要将分子量相差不很大的物质 分离或组分离。另一类则是要将分子量相差不很大的物质加 以分离， 如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做

17、分级分离 分级分离。 以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。后 者对实验条件和操作要求都比较高。 者对实验条件和操作要求都比较高。类分离目的是分开样品中分子量悬殊的“较大分子组”和“较小分子组” 目的是分开样品中分子量悬殊的“较大分子组” 较小分子组” 两类物质， 两类物质，并不要求分离分子量相近的组分 选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限， 选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小 大分子组的分子量大于其排阻限 Kd=0， 分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd=0 分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd=0， 小分子

18、的Kd Kd 这样能取得最好的分离效果。 小分子的Kd1。这样能取得最好的分离效果。例题：从某蛋白质溶液（ 例题：从某蛋白质溶液（MW=5500D）中除去无机盐，应选择下 ）中除去无机盐， 列哪种凝胶最合适？ 列哪种凝胶最合适？A. Sephadex G-15（分级范围， <1,500 D） （分级范围， ） B. Sephadex G-25（分级范围，1000-5000 D） （分级范围， ） C. Sephadex G-150（分级范围， 5,000-400,000 D） （分级范围， ）凝胶粒度的影响凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说，细粒凝胶柱 凝胶粒度的大小对分离效

19、果有直接的影响。一般来说，细粒凝胶柱 对分离效果有直接的影响 流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析 精制分离或分析等 流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒 凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离 粗制分离， 凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐 等。 在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70m左右较合适。 在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70m左右较合适。对于在水中 70m左右较合适 保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150m左右。 150m左右 保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150m左右。凝胶颗粒大小 要均匀，这样流速稳

20、定， 要均匀，这样流速稳定，效果较好同一流速下不同粒度的Sephadex G-25柱的洗脱效果 同一流速下不同粒度的Sephadex G-25柱的洗脱效果2、凝胶的预处理溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡24 小时以上或将干胶加入水里，边加边搅，然后放到 沸水浴中加热接近100，保持数个小时。根据干凝 胶的填充体积计算所需的干凝胶量 平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起 始缓冲液 相同（使凝胶溶胀状态稳定）3、装柱一般选 用细长的层析柱作凝胶过滤。进行类分离（如脱盐）时，柱高 一般选用细长的层析柱作凝胶过滤。进行类分离（如脱盐） 50cm比较合适 分级分离时，100cm较为

21、合适 比较合适； 50cm比较合适；分级分离时，100cm较为合适 具体步骤为： 具体步骤为： 将层析柱垂直固定 一般是先在柱内装入约1/3高度的水或缓冲液排走空 垂直固定， 1/3高度的水或缓冲液 将层析柱垂直固定，一般是先在柱内装入约1/3高度的水或缓冲液排走空 气； 将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至1/4 1/3高时打开 1/4将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至1/4-1/3高时打开 下端出口，让溶剂慢慢流出，继续倒入凝胶至沉降到所需高度。 下端出口，让溶剂慢慢流出，继续倒入凝胶至沉降到所需高度。 倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使凝胶介质充分平衡 起始缓冲液走

22、柱 平衡， 用3-5倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使凝胶介质充分平衡，柱床稳定 若第一步采用起始缓冲液排空气则该步骤略）。 （若第一步采用起始缓冲液排空气则该步骤略）。层析柱 自制简易层祈柱（ （ a ） 自制简易层祈柱 （ 1 玻璃 橡皮塞； 尼龙网） 管；2.橡皮塞；3尼龙网）； 普通商品柱； （b）普通商品柱； 双底板层析柱（ （c）双底板层析柱（1.洗脱液进 出口 ； 2. 多孔底板 ； 3 柱床 ； 恒温水进口； 恒温水出口； 4 恒温水进口 ； 5 恒温水出口 ； 6可调节的塞子） 可调节的塞子）4、样品的准备样品的粘度： 样品的粘度：粘度大产生介质吸 粘度 一般要求样品粘度小于 附

23、，一般要求样品粘度小于 0.01Pas 0.01Pa s 样品的浓度：样品浓度以不大于4 样品的浓度：样品浓度以不大于4 浓度 不大于 为宜， 为宜，样品浓度过大往往导致 粘度增大。如果样品浑浊，应先 粘度增大。如果样品浑浊， 过滤或离心除去颗粒后上柱 样品的体积：分析用量一般应低 样品的体积：分析用量一般应低 体积 于总柱体积的5% 5%， 于总柱体积的5%，制备用量一般 15%或更多 20-30%） 或更多（ 为15%或更多（20-30%）。样品黏度对洗脱曲线的影响5%， （1）加葡萄糖2 000，使终浓度为5%，相对粘度 加葡萄糖2 000，使终浓度为5% 2.5%， 11.8;（ 加葡

24、萄糖2 000，使终浓度为2.5% 11.8;（2）加葡萄糖2 000，使终浓度为2.5%，相对 粘度4.2; 加葡萄糖2 000，使终浓度为1%. 粘度4.2; （3）加葡萄糖2 000，使终浓度为1%.5、上样具体步骤为： 打开层析柱下端出口，使缓冲液流出至刚好达到凝胶 胶面 沿柱壁缓慢加入样品，打开下端出口，使样品溶液流 出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱 壁 加样时 应尽量减少凝胶床面的搅动。加样的方法可以 是直接将样品加到层析床表面，或可用微量泵控制6、洗脱和收集打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。 打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。 用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。 用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管洗脱时应注意的问题