细胞培养基培训资料--比较全面,可以有个初步了解

1、lYOCON公司成立于公司成立于2006年，经过年，经过5年时年时 间的发展，在微生物分离、培养、鉴定、间的发展，在微生物分离、培养、鉴定、 保存相关产品中取得了卓越的成就，近保存相关产品中取得了卓越的成就，近 年大力发展微生物采样等相关产品，尤年大力发展微生物采样等相关产品，尤 其是病毒采样液等产品受到了各界用户其是病毒采样液等产品受到了各界用户 的好评，在努力完善现有产品的同时，的好评，在努力完善现有产品的同时， 我们又致力于新产品的开发，尤其是病我们又致力于新产品的开发，尤其是病 毒采样产品所衍生出的更多细胞培养相毒采样产品所衍生出的更多细胞培养相 关的产品，以满足广大客户的需要。关的产

2、品，以满足广大客户的需要。 l标准化的生产管理标准化的生产管理 l我们对每批产品都进行严格的质量控制，做到我们对每批产品都进行严格的质量控制，做到 每批产品都有可追溯性每批产品都有可追溯性. l采用先进的生产设备和标准化的操作程序，保采用先进的生产设备和标准化的操作程序，保 证产品的质量的稳定性，降低产品的批间差证产品的质量的稳定性，降低产品的批间差. l定期超纯水及细胞培养注射用水水质的监测定期超纯水及细胞培养注射用水水质的监测 l严格的在线管道清洗（严格的在线管道清洗（CIP)及消毒程序及消毒程序(SIP) l标准化的配液，过滤，分装体系标准化的配液，过滤，分装体系 l什么是细胞？ 能进行

3、独立繁殖的有膜包围的生物体的 基本结构和功能单位。一般由质膜、细 胞质和核（或拟核）构成，是生命活动 的基本单位。 l严格的无菌无毒环境 体外培养的细胞缺乏对微生物和有毒物质的防 御能力 l适合的营养条件 高质量的细胞培养基和血清是细胞培养成功的 基本条件 l适宜的生存环境 恒定适宜的温度、pH值、气相环境（二氧化碳 的浓度） CO2培养箱培养箱 细菌霉菌培养箱细菌霉菌培养箱 过滤设备过滤设备 烘箱烘箱 高压灭菌设备高压灭菌设备 水浴锅水浴锅 磁力搅拌器磁力搅拌器 离心机离心机 酸缸酸缸 液氮罐液氮罐 精密天平精密天平 倒置倒置显微镜显微镜 pH计计 酶标仪酶标仪 电导率仪电导率仪 渗透压仪渗

4、透压仪 细胞计数板细胞计数板 超净台超净台 培养皿等相关耗材培养皿等相关耗材 生物安全柜生物安全柜 贴壁细胞培养流程 悬浮细胞培养流程 基本培养基基本培养基 血清血清 细胞培养试剂（抗生素细胞解离，生长因子细胞培养试剂（抗生素细胞解离，生长因子 等）等） 平衡盐溶液平衡盐溶液 l水 超纯水、细胞培养注射用水（本公司所采用的为细胞培养注射 用水） l氨基酸 l必需氨基酸：组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、 苏氨酸、色氨酸、缬氨酸。 条件性必需氨基酸： 谷氨酰胺、 精氨酸、半胱氨酸、 酪氨酸 l非必需氨基酸：丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨 酸、丝氨酸。 l维生素

5、 生物合成的辅助因子，机体自身不能合成：如生物素、叶酸、核黄素、 维生素B12。 l血清 提供额外的营养以及提供生长、附着因子 lpH指示剂 可使细胞产生类似于苛尔蒙的反应，在做苛尔蒙的研究或者生产中应去 掉酚红指示剂，避免产生干扰。 lBME ( Basal Medium Eagle): 是由Eagle发明的，是最简单的培养基， 只有11种氨基酸和盐及一些维生素。最 先用于培养小鼠的L 细胞和人类HeLa细 胞，现在广泛用于各种细胞的培养 lEMEM or MEM(Eagles Minimum Essential Medium): 是BME的升级版，氨基酸浓度是BME的 两倍，适用于更多的细

6、胞 lDMEM (Dulbeccos Modification of Eagles Medium) 是Dulbecco改进的MEM. 氨基酸和维生素 浓度是BME的4倍.最先葡萄糖的浓度是 1g/L，称为低糖DMEM,后来增加到 4.5g/L，称为高糖DMEM，广泛用于各种 细胞培养。 lM 199 (Medium 199): 是一种比较古老的，配方复杂的，含有 核苷酸，核酸等成分的培养基。最初用 于鸡胚肌细胞的培养，还用于各种细胞 的维持和病毒生产 lRPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute # 1640): 是是McCoys 5A 的改进版，含有

7、高浓度的的改进版，含有高浓度的 肌醇。广泛用于悬浮细胞的培养。如人肌醇。广泛用于悬浮细胞的培养。如人 类白细胞，骨髓瘤细胞，杂交瘤细胞等类白细胞，骨髓瘤细胞，杂交瘤细胞等 血液来源的细胞血液来源的细胞 lHams F10 (Hams Nutrient Mixture F10): 由Ham发明，用于人类2倍体细胞和仓鼠 细胞的培养。 lHams F12 (Hams Nutrient Mixture F12): F10 的升级版，含有更多的维生素，肌 醇，氨基酸。用于培养大鼠，兔子和鸡 胚细胞，还用于中国仓鼠卵巢细胞以及 肺细胞的培养 lIMDM 是由 Iscove改良的Dulbecco培养基，较

8、 DMEM增加了几种非必需氨基酸和一些 维生素，IMDM为高葡萄型培养基，可 用于杂交瘤细胞的筛选培养，也可作为 无血清培养的基础培养基 lDMEM/F12 是DMEM和F12按1:1比例配制而成，是神经生 物学最常用的基本培养基，也是无血清培养基 的基础液，IMDM 非常适合于迅速增殖，高密 度细胞的培养，包括Jurkat细胞，COS- 7，和 巨噬细胞。IMDM支持小鼠B淋巴细胞，来自 骨髓的造血组织，脂多糖刺激的B细胞，T淋巴 细胞，和各种杂交细胞的生长。与血清一起使 用时，它支持多种哺乳动物细胞，包括骨髓， 杂交瘤细胞和淋巴细胞的生长. lMcCoy 5A 是McCoy等人在1959年

9、研制，是一种专门为培 养肉瘤细胞研制的培养基，除适用于原代细胞、 组织活检细胞和淋巴细胞培养外，还适用于较 难培养的细胞，如皮肤，牙龈，睾丸，小鼠肾 脏，大网膜，肾上腺，肺，脾，大鼠胚胎和其 他组织的原代生长，以及活体组织的体外移植。 lMEM: 仅含12种必须氨基酸，谷氨酰胺和8种维生素广 泛应用于细胞系的培养，是DMEM的前身。 lBME：删除了一些必须氨基酸，增添了一些非必须氨 基酸。 lDMEM:2xMEM的成分，有高糖、低糖之分，广泛用于哺 乳细胞的培养。 lRPMI1640:最初针对淋巴细胞的培养而设计 lM199:广泛用于病毒学，疫苗生产和组织移植培养。 lHams F mixs

10、：可在血清含量较少的情况下培养细胞。 l即用型(1X) 液体培养基: 直接用培养基浓缩液(10X or 50X ): 用前需要稀释成1 l 干粉培养基DPM (Dry Powder Media): 需要在水中溶解, 加入碳酸氢钠,调pH值, 然后过滤才 可以使用. l 高级颗粒技术培养基AGT (Advanced Granulation TechnologyTM): 比DPM形式的培养基更容易溶解的颗粒状的培养基. AGT 是完全为工业产量的用户开发的, pH提前调好， 所有的成分都提前混合好,只需要加水溶解和过滤。 l传统培养基 要添加血清(5-10%)的培养基 l高级培养基（Advance

11、d medium） 浓缩了营养物质和其他成分的培养基,只需要 2% 的血清(减少50-90%) l无血清培养基(无血清培养基/无蛋白培养基/ 化学定义的培养基) l使用时无须再添加血清, 主要用于生物产品生 产,干细胞研究等 l专用培养基专用培养基 针对角质细胞、淋巴细胞、造血细胞、针对角质细胞、淋巴细胞、造血细胞、 内皮细胞、肝细胞、神经元细胞、胚胎内皮细胞、肝细胞、神经元细胞、胚胎 干细胞、干细胞、CHO细胞、细胞、293细胞、各类昆细胞、各类昆 虫细胞、杂交瘤细胞、羊水细胞等的无虫细胞、杂交瘤细胞、羊水细胞等的无 血清培养基血清培养基 lSerum-Free Medium （SFM） l

12、成分更加清晰成分更加清晰 l消除因血清批次不同而带来的不确定性消除因血清批次不同而带来的不确定性 保持实验的连续性保持实验的连续性 l易于纯化和下游处理易于纯化和下游处理 l优化特殊细胞及其功能的培养条件优化特殊细胞及其功能的培养条件 l越来越多的无血清培养基用非动物越来越多的无血清培养基用非动物/ /人来源的原料制造人来源的原料制造 l有利于精确阐述细胞功能有利于精确阐述细胞功能 l提高生产力提高生产力 l更好控制生理反应更好控制生理反应 l专门针对角质细胞、淋巴细胞、造血细胞、内皮细胞、肝细胞、神经元专门针对角质细胞、淋巴细胞、造血细胞、内皮细胞、肝细胞、神经元 l细胞、胚胎干细胞、细胞、

13、胚胎干细胞、CHOCHO细胞、细胞、293293细胞、各类昆虫细胞、杂交瘤细胞、细胞、各类昆虫细胞、杂交瘤细胞、 l羊水细胞的无血清培养基羊水细胞的无血清培养基 l无需加入血清无需加入血清 l可能包含降解的蛋白或者蛋白块可能包含降解的蛋白或者蛋白块 l蛋白含量保持在易于纯化的最小状态蛋白含量保持在易于纯化的最小状态 l优化特殊细胞培养条件优化特殊细胞培养条件 lProtein-Free Media (PFM) 无蛋白无蛋白( 不同的厂商有不同的说明不同的厂商有不同的说明)包含包含 起源于动物或者植物的不明确的提取物起源于动物或者植物的不明确的提取物 lChemically-Defined Me

14、dia (CDM) 无蛋白和不明确的成分无蛋白和不明确的成分 所有的成分都有一个明确的结构，可以所有的成分都有一个明确的结构，可以 提供性能一致的产品提供性能一致的产品,减少批次间的差别减少批次间的差别 l干粉：24个月，28避光保存，可在 室温情况下运输. l液体：12个月，所有的培养基都必须在 28， 避光保存，不能冷冻. 血清血清的作用 l提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有 或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。（如 氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核算衍生物、 胰岛素、肾上腺皮质激素、类固醇激素、纤维细胞生 长因子、表皮细胞生长因子、血小板生长因子等） l提供结合蛋白

15、，能识别维生素、脂类、金属和其他激 素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。 l有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合， 起到解毒作用。 l是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。 l起酸碱度缓冲液作用。 l提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶 失活，保护细胞不受伤害。 .胎牛血清(FBS): fetal bovine serum 直接胚胎心脏取血，胎牛还未接触外界，血清中所含 的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。 .新生牛血清(NBS):new born calf serum or new bovine serum 出生小于于十四天 .小牛血清（CS) ：calf se

16、rum 出生小于一年 .捐献血清: 特殊饲养的，专门用来进行血清提取的牛 .其他血清: horse, chicken, goat, lamb（羊）, porcine（猪）, rabbit 1、对大多数细胞，在体内状态，血清不是它们接触的生理学液体，只是 在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清，因此使用血清有可能改 变某种细胞在体内的正常状态，血清可能促进某些细胞的生长（成纤 维细胞）同时抑制另一类细胞生长（表皮细胞）。 2、血清含有对细胞产生毒性的物质，如多胺氧化酶，能与来自高度繁 殖细胞的多胺反应（如精胺、亚精胺）形成有细胞毒性作用的聚精 胺。补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长，甚至造成

17、细胞死 亡。 3、动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分 不能保持一致。 4、取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实 验失败或实验结果不可靠性。 5、血清的使用使得实验和生产的标准化困难，其中的蛋白质使得某些 转基因蛋白生物药品生产中分离纯化工作很难完成。 大规模生产 中，血清来源越来越困难，价格昂贵，是构成动物细胞培养对生产 成本的主要部分之一。 l平衡盐及缓冲液 l细胞消化试剂 lpH调节试剂 l营养添加剂 l抗生素 l细胞冻存液 lPBS PBS是生物学研究和组织培养中常用的一种缓 冲溶液。例如，细胞或组织的运输，细胞计数 时的稀释，溶液的配制，容

18、器，包括细胞的清 洗等，但不能用于细胞及组织块的消化。 lDPBS 配方中无钙镁离子，不会中和胰酶及EDTA活 性，用于贴壁和团块细胞的消化解离，细胞解 离前的清洗。 lHBSS HBSS可用于多种细胞培养应用，如细胞 解离前的清洗，细胞或组织的运输，细 胞计数时的稀释，溶液的配制等。含钙 和镁的HBSS配方一般用作运输培养基或 试剂配制，无钙镁的HBSS用于细胞解离 前的清洗，不会降低胰酶的活性 l0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA l0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA 胰蛋白酶是一种胰腺丝氨酸蛋白酶，具有底物特异性， 解离消化作用强，被用于组织培养中贴壁细胞的传代。 但细胞培养环境

19、中存在的二价阳离子，如钙和镁等可 以抑制解离。EDTA可螯合二价离子，从而增强胰蛋白 酶的作用。 l胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、温度、 胰酶浓度及溶液中是否含有Ca2+、Mg2+离子和 血清等因素有关。通常情况下，pH 8.0 , 温度 37 其作用能力最强。另外，钙、镁离子及血 清均能大大降低其消化能力。我们每次进行传 代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液反复 冲洗细胞培养瓶，以便于将含血清的培养基冲 洗干净，这样就能大大提高消化液的消化能力。 l台盼蓝染色是一种广为接受的用于死细 胞染色法。台盼蓝被正常的活细胞排斥 而能被丧失活性的细胞吸收，并呈现蓝 色。 lNaHCO3

20、 （7.5%） l碳酸氢钠是常用的缓冲体系的一部分，用来维持培养环境中生理 pH值7.2-7.4之间,大多数细胞适宜在pH 7.2-7.4条件下生长，为了维 持培养环境的Ph，多采用在培养基中加入碳酸盐等缓冲剂的方 法，细胞生长过程中，随细胞数量的增多和代谢活动的加强，不 断产生CO2，溶解的CO2与HCO3-达到平衡，从而使培养基的pH 降低，在溶液中存在如下反应： lH2O+CO2H2CO3H+ +HCO3- l抵消二氧化碳产生的作用可通过增加碳酸盐的浓度来解决： lNaHCO3Na+ +HCO3- lHCO3-的增加可使 H2O+CO2H2CO3H+ +HCO3- 的反应 l向左边进行直

21、至pH在7.4左右达到平衡。 lHepes（1M) Hepes Buffer是用于细胞培养基中的一种 生物缓冲剂，在开放式培养或细胞观察 时能维持较恒定的pH值，Hepes(25mM) 可以作为碳酸氢盐缓冲液的替代品，或 者作为碳酸氢盐缓冲液的添加物（10- 15mM），以解除需要高浓度CO2培养环 境的限制. lBSA（V）（7.5%） 牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）是牛血 清中的一种球蛋白，又称第五组分（需要注意的是， 第五组分并不是BSA的一种组份，而是Edwin J. Cohn 教授早期从血液中通过特定的分离技术得到5种组份， 其中第五种就是白蛋白）

22、，CAS号为9048-46-8，包含 583个氨基酸残基，分子量为66.430 kDa，等电点为4.7。 牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在 western blot中作为封闭试剂。血液中的白蛋白主要起 维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。 在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和 机械保护作用和载体作用。 l以流感病毒为例 作为流感病毒分离培养液的营养添加剂 替代牛血清 添加牛血清白蛋白生长添加剂不会影响TPCK-胰酶促 转染的效率，保持了TPCK-胰酶的活性，促进病毒的 复制，同时对后期 的血凝及血凝试验不会产生干扰， 人和动物血清中存在非特异性血凝抑制素，它

23、们是游 离在血清中类似病毒受体的唾液酸残基，能与病毒血 凝素分子上的受体结合，会竞争抑制病毒与红血球的 结合，因而造成假阳性，因此HI试验必须用受体破坏 酶处理血清。 l牛血清白蛋白（7.5%）保存于2-8，避 免与强氧化剂及强酸接触。 l在流感病毒分离培养时,牛血清白蛋白 （7.5%）用量为每500ml细胞培养基添加 12.5ml，终浓度 0.2%。 l青链霉素 l庆大霉素 l两性霉素B l庆大霉素、两性霉素B l青链霉素、两性霉素B l青霉素（10000U/ml） l链霉素（10000ug/ml） l青链霉素是广谱抑菌剂，对革兰氏阴性和阳性微生物 有抗菌性，青霉素影响细菌细胞壁合成的终止步

24、骤， 在转肽反应步骤抑制多肽链的延伸，青链霉素的有效 浓度为100u/ml；链霉素为100ug/ml l1ml青链霉素试剂可添加100ml细胞培养基中使用 l保存条件：-20冷冻保存，避免反复冻融 l庆大霉素（0.5mg/ml）or（50mg/ml） l庆大霉素是一种广谱细菌培养抗生素，在抗菌 浓度下，它对病毒和哺乳细胞没有毒性，对革 兰氏阳性和阴性细菌以及支原体有抗菌活性， 被用于长期病毒和组织培养研究。主要是通过 与50S核糖体亚基的L6蛋白结合，干扰细菌蛋 白质合成，它的有效浓度是5ug/ml，在大于 300ug/ml时具备细胞毒性。 l每ml庆大霉素试剂添加100ml细胞培养基中使 用

25、 l保存条件：15-30 l两性霉素B(250ug/ml） l两性霉素B溶液是一种对真菌有抗菌活性的抗 生素。将其作为一种抗真菌、抗酵母菌以及抗 霉菌制剂使用，它通过与固醇结合、干扰敏感 真菌的细胞膜渗透性。通常的有效浓度是 2.5ug/ml。 l每ml两性霉素B试剂可添加100ml细胞培养基产 品。 l保存条件：-20，避光保存，避免反复冻融 l庆大霉素（0.5mg/ml）、两性霉素B（250ug/ml） l庆大霉素/两性霉素B溶液针对革兰氏阴性和阳 性菌以及真菌和酵母菌具备广谱抗菌活性，它 常被作为抗真菌、抗酵母菌、抗霉菌或抗细菌 制剂。 l每ml庆大霉素、两性霉素B试剂可添加100ml细

26、 胞培养基中使用 l保存条件：-20 避免反复冻融，避光保存 l青霉素（10000u/ml） l链霉素（10000ug/ml） l两性霉素B(25ug/ml） l青霉素/链霉素/两性霉素B针对革兰氏阴性和阳 性菌以及真菌和酵母菌具备广谱抗菌活性，它 常被作为抗真菌、抗酵母菌、抗霉菌或抗细菌 制剂。 l每ml青链霉素、两性霉素B可添加于100ml细胞 培养基中使用 l保存条件：-20，避光保存，避免反复冻融 l由于细菌和酵母等的污染很容易观察到，污染细胞的 及时清理就大大减少了支原体、病毒的污染机会。潜 在的支原体、病毒的污染会带来很大的危害。这些微 生物的存在会影响细胞的理化性质，从而使研究者

27、得 到错误的实验结果。在严重的情况下，甚至使一个实 验室数年的研究白白浪费。由于过滤技术的提高和超 净台质量的改进，在规范的细胞培养操作过程中引进 污染的机会已经被大大降低了。所以比较合理的建议 是，在常规的细胞培养中不要使用抗生素。只有在培 养污染源很多（比如组织培养），或者培养非常珍贵 的细胞株时才使用抗生素。 l细胞冻存液由相应培养基、特级胎牛血清和细 胞培养级DMSO（二甲基亚砜）组成，经过改 良和优化，产品含符合细胞冻存的独特配方， 保护细胞免收冰晶河溶质损伤，能有效地提高 复苏细胞存活率和活力，助科研工作者摆脱程 式繁琐、操作复杂、微生物污染可能性高的冻 存调配工作，专注于下游的研

28、究。 l保存条件：-20，避免反复冻融 l选择指数生长期的细胞 l1000r/min 5分钟 离心去上清，（贴壁细胞消化后离心，悬浮细胞直接离 心） l弃上清，用细胞冻存液混悬沉淀细胞，将细胞悬液浓度调整到106-107个 /ml l分装于冻存管中进行程序降温：430min，-2030-60min，-80超低温 冰箱过夜后转移到液氮罐内，长期冻存。 l注意事项 l冻存前确认细胞未被污染，分析细胞系的可靠 性。 l选择合适的冷冻速度和冷冻温度，以免在冻存 过程中损伤细胞 l常温条件下DMSO对细胞有毒副作用，故应将 冻存液在4条件下放置40-60min后使用。 l冻存管放入液氮罐时，小心液氮溅出

29、。 l流感病毒分离所需培养基及试剂 lDMEM(高糖，含L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠） l胎牛血清 l0.05%胰酶+0.02%EDTA l青链霉素（10000u/ml，10000ug/ml） l庆大霉素（50mg/ml） lHepes（1M） lBSA(v) 7.5% lTPCK-胰酶（2mg/ml） lHBSS l当75%100%细胞出现病变时进行收获，收获之前可 以将细胞放于-70冰箱，冻融12次，以提高收获标 本的病毒滴度。即使无细胞病变也应该于接种后第7天 收获。收获病毒液时，先温和摇动细胞瓶数次，然后 用10mL的无菌移液管吸取病毒液置于15mL无菌离心管 中，混匀病毒。 l收获的病

30、毒液可以进行红细胞凝集实验，如没有红细 胞凝集现象，应将收获病毒培养液再MDCK细胞传代 2-3次。 l如果有必要，可再通过血凝抑制实验鉴定分离物，并 将分离物保存在-70或-70以下。 l 先进的检测仪器 l标准的检测操作流程 l每个批产品的监测和留样 l符合GMP标准的检测环境 lpH 依据中华人民共和国药典2010年版二部附录VI H pH 测定法. l无菌 依据中华人民共和国药典2010年版 二部 附录XI H 无 菌检查（2） 直接接种法，进行细菌真菌的检测。 l内毒素 依据中华人民共和国药典2010年版 二部 附录XI E 细 菌内毒素检查法中凝胶半定量法，利用鲎试剂来检测 或量化

31、由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素。 l支原体检测 依据中华人民共和国药典2010年版 二部 附录 B 支 原体检查法中培养法 lSP2/0毒性检测 依据中国生物制品主要原辅料质控标准中SP2/0生 长曲线，倍增时间的测定 l渗透压 l依据中华人民共和国药典2010年版 二部 附录IXG 渗 透压摩尔浓度测定法中（1）测量溶液的冰点下降来间 接测定其渗透压摩尔浓度。 l凝胶电泳图谱 依据中华人民共和国药典2010年版 三部 附录 F电泳法 第四法 聚丙烯酰胺凝胶电泳法。 l蛋白总量 依据中华人民共和国药典2010年版 二部 附录 M 蛋 白质含量测定法第五法（考马斯亮蓝法 Bradford） lH

32、anks 平衡盐溶液平衡盐溶液(HBSS)要在空气中使用，不需要要在空气中使用，不需要 CO2培养箱。原因是什么？培养箱。原因是什么？Hanks 平衡盐溶液平衡盐溶液(HBSS) 和和Earles平衡盐溶液平衡盐溶液(EBSS)有什么本质的功能差别？有什么本质的功能差别？ HBSS和 EBSS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高 水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空 气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱 中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要 用Eagles液

33、，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储 存的组织，用Hanks液就可以了。 l为何培养基保存于4 C 冰箱中， 颜色会偏暗 红色， 且pH值会越来越偏碱性？ 培养基保存于4 C 冰箱中， 培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培 养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色 也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结 果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏 碱时， 可以通入无菌过滤之CO2， 以调整pH 值。 lL-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中 不稳定吗？ L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基 后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、 参与蛋白质

34、的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在 溶液中经过一段时间后会降解，但是确切 的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降 解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 l什么情况下要求培养基中不能含有酚红？ 酚红在培养基中用作批H值的指示剂：中性时 为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究 表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特 别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞， 尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。 由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细 胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 l如何用台盼兰计数活细胞？ 用无血清培养基把细胞悬液稀释到200 2000个/毫升，在0.1毫升细胞悬液中加0

35、.1 毫升0.4的台盼兰溶液。轻轻混匀，数 分钟后，用血球计数板计数细胞。活细 胞排斥台盼兰，因而染成蓝色细胞是死 细胞。 l钙镁离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰 蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？ 钙镁离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA 用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便 保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白 酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消 除来自培养基中所有的二价离子. l购买的细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？ 研究人员在细胞培养时出现存活率不佳， 常见 原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质 不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻 过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和 离心

36、。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用 错误。细胞置于80 C 太久。 l为什么大多数细胞培养基中要含有丙酮酸钠？ l丙酮酸钠作为细胞培养的一种能源物质。它往 往被加到低葡萄糖组分的培养基中（1.0 g / L 葡萄糖），也有时添加到较高的葡萄糖配方中 （4.5g/L)。提供细胞生长所需要的碳源 ，在没 有葡萄糖时，细胞可代谢丙酮酸钠产生丙酮酸 进行能量合成。 l培养细胞生长减慢的原因有哪些？其解决办法有哪些？培养细胞生长减慢的原因有哪些？其解决办法有哪些？ 答：可能得原因有：更换了不同的培养液或血清；培 养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子 等耗尽或缺乏或已被破坏；培养物中有少量细菌

37、或真 菌污染；试剂保存不当；比较新培养液与原培养液成 分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验找出可能 的原因。 解决办法：增加起始培养细胞浓度；让细胞逐渐适应 新培养液；换入新鲜配制培养液；补加谷氨酰胺或生 长因子等；用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢 弃培养物，或用抗生素除菌；血清需保存在-5到- 20；培养液需在28避光保存；含血清完全培养 液在2-8保存，并在2周内用完；分离培养物，检测 支原体。 l细胞培养基偶然被冻，可否继续使用？细胞培养基偶然被冻，可否继续使用？ 答：如果细胞培养基偶然被冻，您应该 自然溶解培养基并观察是否有沉淀产生。 如果没有沉淀产生，培养基可以正常使 用，如果

38、出现沉淀，只能丢弃这些培养 基。严格意义上要避免细胞培养基冷冻， 会影响细胞培养。 lHEPES在细胞培养过程中起什么作用？在细胞培养过程中起什么作用？ HEPES溶液：是一种弱酸，中文名字是 羟乙基哌秦乙硫磺酸，主要作用是防止 培养基pH迅速变化。在开放式培养条件 下，培养基脱离了5%CO2的环境，CO2 气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了 HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般 在进行克隆化培养时要添加HEPES。 l血清使用时一定需要灭活么？血清使用时一定需要灭活么？ 实验显示，经过正确处理的热灭活血清对大多数的细 胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长 只有微小的促进，或

39、完全没有作用，甚至因为高温处 理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。 而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多， 这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”， 常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放 在37环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误 认为是微生物的分裂扩增。若非必须，可以不需要做 热处理这一步。不但节省时间，更确保血清的质量。 l培养液培养液pH下降很快可能原因有哪些？其解决办法是什么？下降很快可能原因有哪些？其解决办法是什么？ 通常细胞生长得非常快时，pH 值通常下降得很快。此时可以及时 传代、提高传代比例或降低血清量等方法进行解决。此外，培养 瓶盖拧得太

40、紧、NaHCO3 缓冲系统缓冲能力不够、培养液中盐浓 度不正确、细菌、酵母或真菌污染等也能导致pH值通常下降得很 快。 （1）按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度， 2.0g/L 到3.7g/L 浓度NaHCO3对应CO2浓度为5到10。 （2）改用不依赖CO2培养液。 （3）松开瓶盖1/4 圈。加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。 （4）在CO2培养环境中改用基于Earles盐配制的培养液，在大气 培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液。 （5）如果是污染造成的则丢弃培养物或用抗生素除菌。 l无血清培养基消化贴壁细胞时，用什么 终止消化试剂反应？ 通常用无血清培养

41、基进行贴壁细胞传代 时，可添加商品化的蛋白酶抑制剂或含 有钙镁离子的商品化试剂进行终止反应。 l怎样对病毒分离用的鼻咽拭子样本进行处理？ WHO规定用力将含有鼻咽拭子的采样管置于 漩涡振荡器中进行混合振荡，振荡后将鼻咽拭 子贴紧采样管内壁进行挤压，将拭子含有的病 毒采样液全部挤压到采样管中，取出拭子，每 ml采样液中添加庆大霉素试剂（50mg/ml） 0.2ml，室温下放置15min，1000rpm ，离心 5min，取上清液200ul进行接种，其余上清液- 80冻存。 l流感病毒阳性分离率低的原因？ 采样方法及部位（咽部后壁,用力采集） 采集拭子（高采集率及高释放率 ） 采样液（恒定的pH值

42、，渗透压，稳定剂） 运送温度（4） 样本处理（污染物，保存温度） 转染率（转染到宿主细胞的数量） 转染的细胞状态（MDCK细胞状态差） 病毒生长液（病毒生长液配制问题） l为什么分离普通流感病毒在细胞培养法中需添 加TPCK-胰酶，而鸡胚法不需要添加？ 维持液中加适量胰酶的目的是为了提高流感病 毒在细胞中的复制能力。绝大多数流感病毒只 有血凝素（H）是裂解型的才具有感染性。细 胞培养不像鸡胚，它的维持 液中不含有蛋白水 解酶，无法将病毒粒非裂解型的HA0变成裂解 型的HA1+HA2。故必须在维持液中加入适量 的胰酶。 lDMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium

43、 ) lMEM(Minimum Essential Media ) lRPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute 1640) lDMEM/F12(Dulbeccos Modified Eagle Medium Hams F12) lF10(Hams F10 Nutrient Mixture) lF12(Hams F12 Nutrient Mixture) lIMDM(Iscoves Modified Dulbeccos Medium) lMcCoys 5A(McCoys 5A) lM199(Medium 199) lHBSS(Hanks Balanced

44、 Salt Solution) lEBSS(Earles Balanced Salt Solution ) lPBS(Phosphate Buffered Saline) lDPBS(Dulbeccos Phosphate Buffered Saline) lTrpsin with EDTA(胰酶+EDTA) lTrypan blue solution(台盼兰溶液） lHepes buffer （Hepes缓冲液） lSodium Bicarbonate Solution（碳酸氢钠）（碳酸氢钠） lCell Culture Freezing Medium（细胞冻（细胞冻 存液）存液） lBSA

45、(V) (Bovine Serum Albumin fraction V) lPenicillin-Streptomycin(青链霉素）青链霉素） lAmphotericin B（两性霉素B) lPenicillin-Streptomycin-Amphotericin B(青 链霉素、两性霉素B) lGentamicin-Amphotericin B(庆大霉素、两 性霉素B） lGentamicin（庆大霉素） lWater for injection(cell culture)（细胞培养 级注射用水） 序号细胞系细胞类型种组织培养基 1293成纤维细胞人胚胎肾 MEM，10%灭活马 血清 2

46、IMR-90成纤维细胞人肺 MEM，10%胎牛血 清和NEAA 3W1-38成纤维细胞人胚胎肺，3月妊娠 MEM,10%胎牛血 清 4A549上皮细胞人肺癌 F-12K，10%胎牛 血清 5A431上皮细胞人表皮细胞癌 DMEM,10%胎牛血 清 6BHL-100上皮细胞人乳房 McCoy5A, 10% 胎牛 血清 7BeWo上皮滋养层人绒毛癌 F-12K, 15%胎牛血清 8Caco-2上皮细胞人结肠腺癌 MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA 9Chang上皮细胞人肝脏BME, 10% 小牛血清 10HCT-15上皮细胞人结肠直肠腺癌 RPMI-1640, 10% 胎牛 血清 11HeL

47、a上皮细胞人子宫颈癌 MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA(in suspension, S-MEM) 12HEp-G2上皮细胞人肝细胞癌 MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA 13HEp-2 上皮细胞人喉癌 MEM, 10% 胎牛血清; 或RPMI-1640, 10% 胎 牛血清 14HT-1080上皮细胞人纤维肉瘤 MEM, 10% HI 胎牛血 清 和 NEAA 序号细胞系细胞类型种组织培养基 15HT-29上皮细胞人结肠腺癌 McCoy5A, 10% 胎牛 血清 16JEG-2上皮细胞人绒毛膜癌MEM, 10% 胎牛血清 17MCF7上皮细胞人乳腺癌 MEM, 10% 胎牛血清

48、 NEAA, 10ug/ml 胰岛素 18KB上皮细胞人口腔癌 MEM, 10% 胎牛血清和 NEAA 19Saos-2 上皮细胞人骨肉瘤 McCoy5A, 15% 胎牛 血清 20WI-38上皮细胞人胚胎肺BME, 10% 胎牛血清 21WISH上皮细胞人羊膜BME, 10% 胎牛血清 22WS1人胚胎皮肤 MEM, 10% 胎牛血 清 和NEAA 23HUVEC内皮细胞人脐带 F-12K, 10% 胎牛血清 和 肝素盐 100 ug/ml 24EB-3淋巴样人Burkitt淋巴瘤 RPMI-1640, 10% 胎牛 血清 25Raji淋巴样人Burkitt淋巴瘤 RPMI-1640, 10% 胎牛 血清 26IM-9成淋巴细胞人骨髓瘤病人骨髓 RPMI-1640, 10% 胎牛 血清 27Daudi成淋巴细胞人淋巴瘤病人血液 RPMI-1640, 10% 胎牛 血清 28H9成淋巴细胞人 T细胞淋巴瘤 RPMI-1640, 20% 胎牛 血清 序号细胞系细胞类型种组