安捷伦-液质联用技术(LCMS)及其应用

1、by Li Ping1安捷伦安捷伦-液质联用技术液质联用技术(LC/MS)及其应用及其应用by Li Ping2液质液质(LC/MS)联用技术基础联用技术基础by Li Ping3o质谱分析仪质谱分析仪(MS)P需要高真空条件需要高真空条件P质量分析系统质量分析系统P最好使用挥发性缓冲液最好使用挥发性缓冲液o液相液相(HPLC)v高效分离混合物高效分离混合物v流动相挥发后产生大量气体流动相挥发后产生大量气体v出口压力为大气压出口压力为大气压v无质量限制无质量限制v可以使用缓冲盐溶液可以使用缓冲盐溶液液相液相(HPLC) 到到 质谱质谱(MS)的接口的接口HPLCMSInterface(Key

2、to Success!)by Li Ping4LC-MS的接口的发展和种类p传送带传送带(moving belt)(moving belt)式的式的LC-MS: LC-MS: 目前已目前已经停用经停用p热喷雾热喷雾( (TSP) LC-MSTSP) LC-MS接口接口: : 已经很少使用已经很少使用p粒子束粒子束(PBI)(PBI)p大气压电离源大气压电离源( (API):API):目前最常用的方法目前最常用的方法电喷雾电喷雾( (ESI)ESI)大气压化学电离源大气压化学电离源( (APcIAPcI) )by Li Ping5LC/MS联用技术的相对适用范围by Li Ping6大气压电喷雾

3、质谱应用范围大气压电喷雾质谱应用范围大气压电喷雾源大气压电喷雾源大气压化学源大气压化学源分子量分子量化合物极性化合物极性1000100,00010,000非极性非极性极性化合物极性化合物气相色谱气相色谱/质谱质谱by Li Ping7库仑爆炸库仑爆炸（Coulomb ExplosionsCoulomb Explosions）RayleighLimitReached+-+-+-+-溶剂蒸发溶剂蒸发+带电液滴分析物离子分析物离子溶剂离子束溶剂离子束分析物离子分析物离子溶剂离子束溶剂离子束盐盐/ /离子对离子对中性化和物中性化和物电喷雾(ESI)的电离过程by Li Ping8Neutral Mol

4、eculesAnalyte IonsClustersSalts毛细管液相的入口雾化器加热加热 N N2 2雾化气入口碎片碰撞电压碎片碰撞电压(CID)锥孔八极杆四极杆高能打拿极/电子倍增器+透镜+液质联用的电喷雾(ESI)接口by Li Ping9ES电离原理电离原理by Li Ping10蒸汽蒸汽通过电晕针放电通过电晕针放电形成带电荷的反形成带电荷的反应剂离子应剂离子溶剂在蒸发溶剂在蒸发器中蒸发器中蒸发+含有气溶胶的分析物含有气溶胶的分析物分析物离子分析物离子+电荷转移至电荷转移至 分析物分子分析物分子+流动相流动相分析物分析物溶剂溶剂-溶剂溶剂+ +H H + + 溶剂溶剂+ +H H +

5、 +M-+M-溶剂溶剂+ + MM+ +大气压化学电离源(APCI)的电离过程by Li Ping11毛细管碎片碰撞电压碎片碰撞电压（CID）Corona needle+锥孔透镜四极杆+八极杆热氮气热氮气液质联用的大气压化学电离源(APCI)接口高能打拿极/电子倍增器by Li Ping12APCI电离原理电离原理by Li Ping13大气压源子化技术电喷雾电喷雾(ESI)化合物无需具有挥发性化合物无需具有挥发性是分析热不稳定化和物是分析热不稳定化和物的首选方法的首选方法离子在溶液中以已生成离子在溶液中以已生成除了生成单电荷离子之除了生成单电荷离子之外还可以生成多电荷离外还可以生成多电荷离子

6、子大气压化学电离源大气压化学电离源(APCI)J化和物需具有一定的挥发性化和物需具有一定的挥发性J化和物必需是热稳定的化和物必需是热稳定的J离子在气态条件中生成离子在气态条件中生成J只生成单电荷离子只生成单电荷离子by Li Ping14电喷雾电喷雾(ESI)和大气压化学离子化和大气压化学离子化(APCI)农药及残留化合物农药及残留化合物多肽及蛋白的分子量测定多肽及蛋白的分子量测定确定氨基酸序列确定氨基酸序列多肽及蛋白的纯度分析多肽及蛋白的纯度分析单糖和多糖的结构分析单糖和多糖的结构分析中极性到高极性中极性到高极性,包括离子化合物包括离子化合物的分析的分析,如表面活性剂分析如表面活性剂分析农药

7、及残留化合物农药及残留化合物抗生素抗生素碱性药物碱性药物小分子量样品小分子量样品类固醇类固醇, 雌激素雌激素单磺酸偶氮染料单磺酸偶氮染料ESIAPCIby Li Ping15什麽是诱导解离碰撞什麽是诱导解离碰撞? ?( (Collision Induced Dissociation)?Collision Induced Dissociation)?N在特定的区域, 通过与氮气分子碰撞导致分子解离, 从而产生特征碎片离子N可以得到结构信息用于化和物的定性分析N可以提供用于定量分析目地的确任碎片离子N只要改变单一参数“fragmentor”来控制CID.CapillaryFragmentation

8、 Zone (CID)SkimmersOctopoleLensesQuadrupoleM nM 1+M 2+DETAILby Li Ping16碰撞电压值对质谱图的影响3504004505005506006507002000400060008000m/z-Abundance439467502684.653504004505005506006507002000400060008000m/z-Abundance411439467495684.65碰撞电压碰撞电压= 175 volts碰撞电压碰撞电压= 100 voltsloss of C14 fatty acidloss of C12 fatty

9、 acidCH2OCOOC11H23CHOCOOC13H27CH2OCOOC15H31loss of C16 fatty acidby Li Ping17 安捷伦液安捷伦液-质联用仪介绍质联用仪介绍by Li Ping18液质液质(LC/MS)联用系统的示意图联用系统的示意图离子源离子源离子束离子束聚焦聚焦M/Z分析器分析器检测器检测器数据数据处理处理HPLCLC 接口接口020406080100Abund.100150200250300m/z197.1223.0251.0281.0324.21: MS, Time=0.4341-0.7177min (#17-#22), 100%=200390

10、00arb质谱图质谱图by Li Ping19安捷伦安捷伦LC/MS 产品家族产品家族液相液相/离子井质谱离子井质谱(VL和和SL)液相液相/单四极杆质谱单四极杆质谱LC/MSD VL液相液相/单四极杆质谱单四极杆质谱LC/MSD SLby Li Ping20四极杆质谱四极杆质谱 S ca nning of m e asuring ra nge :U (D C vo ltage )V (pe ak a m p litu de of a radio fre que ncy)U an d V are variedU + V cos 2 f t U V co s 2 f tac and dc vo

11、ltage sio n s w ithc o rres p o n d in gm /z io n s c o llid ew ith th e ro d sD e te c to r+Main RFLow Amplitude Dipole Field (1/3 Frequency of the Main RF)Conversion DynodeElectron MultiplierShutterOptimized Asymptote AngleOctapoleRing 多极离子阱质谱多极离子阱质谱by Li Ping21安捷伦的专利技术安捷伦的专利技术直角喷雾接口直角喷雾接口+P 提高灵敏度

12、提高灵敏度P 减少污染减少污染P 降低毛细管被堵塞降低毛细管被堵塞P 对非挥发性缓冲液的忍耐能力强对非挥发性缓冲液的忍耐能力强by Li Ping22独一无二的交叉喷雾器独一无二的交叉喷雾器交叉喷雾器交叉喷雾器不需不需 X,Y, Z 位置调整位置调整, 而且避免了离而且避免了离子光学透镜的污染子光学透镜的污染倾斜排水口可以快速倾斜排水口可以快速去除冷凝液去除冷凝液by Li Ping23完成整个分析后完成整个分析后, 毛细管的入口处还是干静的毛细管的入口处还是干静的!在非常复杂的基质的条件下在非常复杂的基质的条件下 - 汉克盐溶液汉克盐溶液(Hanks)Componentg/LSodium c

13、hloride8Calcium chloride0.1Potassium chloride0.4Potassium phosphate monobasic0.06Magnesium Sulfate0.1Sodium bicarbonate0.35Sodium phosphate dibasic0.048Glucose1Phenol red0.011by Li Ping24清洁喷雾室清洁喷雾室在在APCI的条件下的条件下,流动相为流动相为HBSS,连续进样连续进样635次以后次以后完成整个分析后完成整个分析后, 毛细管的入口处还是干静的毛细管的入口处还是干静的!by Li Ping25内置式较正

14、溶液内置式较正溶液用于全自动调谐和质量较正用于全自动调谐和质量较正by Li Ping26安捷伦安捷伦1100 系列系列 LC/MSD: 易懂易懂,易用的图易用的图型化的液相和质谱控制及分析软件型化的液相和质谱控制及分析软件by Li Ping27哪一种离子化模式最好哪一种离子化模式最好?o不知道要分析的化合物的性质不知道要分析的化合物的性质是酸性或碱性是酸性或碱性o要分析的化合物中同时包含酸要分析的化合物中同时包含酸性和碱性化合物性和碱性化合物o酸性和碱性化合物的浓度不同酸性和碱性化合物的浓度不同by Li Ping28可同时采集多种质谱信号可同时采集多种质谱信号: 正离子和负离子模式正离子

15、和负离子模式采集采集50组，组，30个离个离子子/组离子组离子同时采集正负离子同时采集正负离子by Li Ping29我经常筛选未知物我经常筛选未知物.最好是同时获得分子最好是同时获得分子量和一些碎片信息量和一些碎片信息我正在筛选未知物我正在筛选未知物,但但我不知道最优的碰撞电我不知道最优的碰撞电压压 我希望一次能获得我希望一次能获得在不同碰撞电压条件下在不同碰撞电压条件下的谱图的谱图可同时采集多种质谱信号可同时采集多种质谱信号: 高和低高和低CID能量能量by Li Ping30低低CID能量能量高高CID能量能量可同时采集多种质谱信号可同时采集多种质谱信号: 高和低高和低CID能量能量by

16、 Li Ping310200000400000600000800000min12345670100000200000300000400000500000600000700000800000High fragmentor: 130 V Low fragmentor: 65 Vm/z100200300 311.1 312.1 156.1 311.1 108.1 245.1 218.1可同时采集多种质谱信号可同时采集多种质谱信号: 高和低高和低CID能量能量磺胺药物演示混合样磺胺药物演示混合样by Li Ping32可同时采集多种质谱信号可同时采集多种质谱信号: SIM/ScanSIM 来定量所选的

17、目来定量所选的目标化合物离子标化合物离子对未知的化合物对未知的化合物SCANby Li Ping33ScanSIM0100000200000300000400000500000600000min1234520000400006000080000100000120000140000160000180000200000 279.0m/z100200300 279.0 280.0 301.0磺胺药物演示混合样磺胺药物演示混合样可同时采集多种质谱信号可同时采集多种质谱信号: SIM/Scanby Li Ping34可同时采集多种质谱信号可同时采集多种质谱信号: 时间编程信号时间编程信号1) 开始五分钟

18、不采集信号开始五分钟不采集信号2)5分钟开始采集信号分钟开始采集信号3) 信号关闭采集信号关闭采集Improve data quality and manage data file size:by Li Ping35从每一项分析中获得最大的信息从每一项分析中获得最大的信息 一针注射样品可获得任意以下分析模式最多达四种一针注射样品可获得任意以下分析模式最多达四种 1. 高高/低低 CID能量可获得分子量及碎片信息用于确认化能量可获得分子量及碎片信息用于确认化 合物的结构合物的结构 2. 正正/负负 离子化模式离子化模式 3. SIM/Full Scan 模式模式by Li Ping36如何建立自

19、己的如何建立自己的HPLC/ESI和和HPLC/APCI谱库谱库by Li Ping37质谱库检索特点质谱库检索特点o 检索用户自建谱库检索用户自建谱库 v使用使用 NIST 程序和检索规则程序和检索规则 v没有应用独特的筛选没有应用独特的筛选,如如PBMo 谱库可以包含结构式谱库可以包含结构式o 交互式或自动检索交互式或自动检索o DAD/MSD 组合检索报告组合检索报告 by Li Ping38自动生成谱库检索报告自动生成谱库检索报告 Library search mode: Automatic library searchLibrary file No. : 1Library file

20、name : S:SPYDERMSLIBR1DOUGLIB.UVLMatch threshold : 950 Purity threshold: CalculatedTime window left % : None Case sensitive : NoTime window right % : None Whole word : NoWavelength shift : 0.0 Compare spectrum : YesAbsorbance threshold : 0.0 Search logic : ORSearch range : AllSignal 1: DAD1 A, Sig=2

21、54,8 Ref=450,80Signal 2: MSD1 TIC, MS FileNIST MS library search mode: Automatic library searchNIST MS library file No. : 1NIST MS library file name : douglibRetTime Sig MW Library Match Formula Name min # Id -|-|-|-|-|-|-|- 2.746 2 270 1 4 720 C9H10N4O2S2 Sulfamethizole 2.987 2 278 1 5 748 C12H14N4

22、O2S Sulfamethazine 3.571 2 284 1 6 583 C10H9ClN4O2S Sulfachloropyridazine 6.143 2 310 1 25 868 C12H14N4O4S Sulfadimethoxine by Li Ping39SIM 灵敏度灵敏度 API-electrospray at 400 l/min or APCI at 1000 l/min Selected ion monitoring of m/z 609.3 Positive ionizationVL 10 pg reserpine 50:1 RMS (10:1 peak-to-pea

23、k)SL 1.0 pg reserpine 50:1 RMS (10:1 peak-to-peak)Unsurpassed performance!卓越的操作性能指标卓越的操作性能指标by Li Ping40LC/MSD SL: 利血平利血平(电喷雾电喷雾, SIM 模式模式)Chromatographic ConditionsColumn: 30 x 2.1mm Zorbax Rapid Resolution SB-C8, 3.5 m (p/n 873700-902)Mobile phase: 5 mM each ammonium formate in 75% methanol in wat

24、erFlow rate: 0.4 ml/minInjection amount: 1 or 2 pg on columnESI MS ConditionsSource: ESIIon mode: positiveSIM ions: 609Fragmentor: 200 V2 pg reserpine0200040006000min24681012141000200030001 pg reserpineby Li Ping41LC/MSD SL:利血平利血平(大气压化学离子化大气压化学离子化, SIM 模式模式)Chromatographic ConditionsColumn: 30 x 2.1

25、mm Zorbax Rapid Resolution SB-C8, 3.5 m (p/n 873700-902)Mobile phase: 5 mM each ammonium formate in 75% methanol in waterFlow rate: 1 ml/minInjection amount: 1 or 2 pg on columnAPCI MS ConditionsSource: APCIIon mode: positiveSIM ions: 609Fragmentor: 200 VVaporizer: 450CDrying gas: 350C, 5 l/minNebul

26、izer: 50 psigmin24681012144008001200 9.475 10.992 12.506 14.022 15.536400800120016002000 9.472 10.988 12.502 14.015 15.5282 pg reserpine1 pg reserpineby Li Ping42安捷伦安捷伦-液质联用技术液质联用技术1.具有多年的台式质谱研究经验；具有多年的台式质谱研究经验；2. 直角接口的设计，保证仪器耐缓冲盐，提高灵敏直角接口的设计，保证仪器耐缓冲盐，提高灵敏 度及易于清洗离子源和接口多重目的；度及易于清洗离子源和接口多重目的；3.同一厂家的产品

27、，工作站的一体化控制，同时同一厂家的产品，工作站的一体化控制，同时 采集色谱和质谱信号；采集色谱和质谱信号；4.具有自动调谐和手动调协两种方式；具有自动调谐和手动调协两种方式；5.APCI和和API-ES源转换方便，源转换方便，5min即可完成；即可完成；6.在实验室条件下，在实验室条件下，0.4-1.5ml/min流速下达到最高的流速下达到最高的 灵敏度；灵敏度；7.同时采集正负离子模式；同时采集正负离子模式；by Li Ping43Agilent 1100 Series LC/MSD:应用分析举例应用分析举例u在农药合成及农药残留分析中的应用在农药合成及农药残留分析中的应用u在高分子添加剂

28、分析中应用在高分子添加剂分析中应用u在染料在染料(如偶氮染料如偶氮染料)分析中的应用分析中的应用u在双酚在双酚A,壬基酚及表面活性剂分析中的应用壬基酚及表面活性剂分析中的应用u在激素及兴奋剂分析中的应用在激素及兴奋剂分析中的应用u在蛋白质及多肽分析中的应用在蛋白质及多肽分析中的应用u在糖类化合物分析中的应用在糖类化合物分析中的应用u在天然产物分析中的应用在天然产物分析中的应用by Li Ping44o氨基甲酸盐类化合物(Carbamates)o磺酰脲类(Sulfonyl Ureas)o苯脲类(Phenyl Ureas)o其它农药及其残留化合物LC/MSD在农药及农药残留分析中的应用在农药及农药

29、残留分析中的应用by Li Ping45Tomato extract spiked with 11 carbamates 200 pg/l; 50 l injected; Scan modeAPCI-LC/MS氨基甲酸盐类化合物的分析氨基甲酸盐类化合物的分析mAUmin51015202520406080UV 254 nmTomato extract spiked with 11 carbamatesNorm.4000080000120000EIC m/z 222MS TICcarbofuranby Li Ping46APCI-LC/MS氨基甲酸盐类化合物的分析氨基甲酸盐类化合物的分析v对于对于

30、1ppb氨基甲酸盐类化合氨基甲酸盐类化合HPLC的分析的分析: 柱后衍柱后衍生生,然后用萤光检测器分析然后用萤光检测器分析vLC/MS: 进样量进样量: 50ul X 200pg/ul 柱子柱子: 100X4mm I.d, 3um Hypersil ODS 溶剂溶剂 A: Water 溶剂溶剂B: Methanol 梯度梯度: 25 to 75% B in 20min UV Detector=214nm Flow rate: 0.8ml/min MS: Mass Scan range: 100 to 510 amu APCI Vap=400C Drying gas temp=350C by L

31、i Ping47氨基甲酸盐化合物的总离子图及提取离子谱图氨基甲酸盐化合物的总离子图及提取离子谱图600001200006000120007501500600012000100020002.557.51012.51517.515003000MS TICm/z 163m/z 116m/z 222m/z 202m/z 226oxamylaldicarbaldicarb sulfonealdicarb sulfoxidecarbofurancarbarylmethiocarbpromecarb草氨酰涕灭威涕灭威砜涕灭威亚砜西维因猛杀威by Li Ping4841.5 pg/componentIncre

32、ased Sensitivity for Carbamates Using SIMmin204015030020402.557.51012.51517.52040min02.557.51012.51517.50100200300400200400MS TICm/z 132m/z 226m/z 202m/z 222aldicarb sulfoxidecarbofurancarbarylpromecarbby Li Ping49* Final sample concentration for carbamates equals 2 g/ml* 3 ul inj on a 2.0 mm x 150

33、mm Phenomenex C-18* 10 ul inj on a 4.6 mm x 250 mm Pickering C-18检测的比较检测的比较PesticideLC/M S*Post-Colum n FLD*UnitsAldicarb sulfoxide1020PPBO xam yl520PPBM ethom yl417PPB3-O H-carbofuran520PPBAldicarb520PPBCarbofuran417PPBCarbaryl2.510PPBM ethiocarb417PPBflorida CDFA Methodology克百威敌灭威亚碸草氨酰甲氨叉威3-羟基克百威敌

34、灭威西维因灭虫威by Li Ping5050 l of 1 ppb injected, SIM除草剂的除草剂的APCI-LC/MS 分析谱图的提取离子分析谱图的提取离子图图02000Cyanazine01000Simazine040008000Hexazinonemin510152025Atrazine040008000m/z 241 m/z 202m/z 253 m/z 216 氰草津西玛津莠草津环嗪酮by Li Ping51* 50 l of 1 ppb injected (50 pg on column), 2-OH-atrazine may shift, and is very dep

35、endant on column equilibration and pHCOMPOUND*(M+H)+S/N 2,6-dichlorobenzamide1902 DIP-atrazine17484 Metamitron20343 Dimethoate23018 DE-atrazine18873 2-OH-atrazine198detected Cyanazine24124 Simazine20214 Hexazinone25362 Atrazine21686 Isoproturon20751 Diuron23324 Terbuthylazine23075 Linuron2492 Pendim

36、ethalin28226利用利用APCI-LC/MS 正离子正离子/选择离子选择离子模式分析除草剂的结果模式分析除草剂的结果by Li Ping52Scan mode, 20 ppm/componentAPCI-LC/MS用于苯脲除草剂的分用于苯脲除草剂的分析析min1234550000100000150000200000 Metoxuron Linuron Diuron Chlortoluron Monolinuron立谷隆敌草隆绿谷隆甲谷隆绿麦隆by Li Ping53分析苯脲类除草剂的分析苯脲类除草剂的LC/MS 条件条件vLC conditions: Column 200 X 2.1

37、mm C18 Mobile phase A: Water B: Methanol Gradient: 50-80% within 3 min Flow Rate: 0.4ml/min UV Detector=254 nmvMS: Mass Scan: 100-400amu, Positive in APCI Corona needle=6uA, Vaporize Temp=400C Drying gas Temp=325C, 4.0 L/min Nebulizer Gas Presure: 30psiby Li Ping54Electrospray positive ion mode, SIM

38、Sulfonylureasmin1234550000100000150000200000Chlorsulfuron(Glean)MW = 357SNHNHOOONNNCH3OCH3ClThifensulfuron methyl(Harmony)MW = 387SNHNHOOONNNCH3OCH3SH3COOMetsulfuron methyl(Ally)MW = 381SNHNHH3COOOOONNNCH3OCH3Nicosulfuron(Accent)MW = 410NSNHNHNOOOONNNCH3OCH3H3CCH3by Li Ping55液质联用液质联用(LC/MS)技术在技术在 聚合

39、物添加剂分析中的应用聚合物添加剂分析中的应用by Li Ping56聚合物润滑添加剂聚合物润滑添加剂:作用: 减少摩擦系数Behenamide(山俞酸酰胺山俞酸酰胺)CH3(CH2)18CONH2, MW 311.3和CH3(CH2)20CONH2, MW 339.3Erucamide(芥酸酰胺芥酸酰胺)CH3(CH2)7CH=CH (CH2)11CONH2MW 337.3by Li Ping57聚合物润滑添加剂聚合物润滑添加剂:APCI 正离子模式-分析山俞酸酰胺(Behenamide) 样品0246810050000010000001500000200000025000003000000T

40、ime (min.)Ion AbundanceCH3(CH2)16CONH2m/zIon Abundance250300350400 284.2 285.2250300350400 312.3 313.2250300350400 340.3 341.2CH3(CH2)18CONH2CH3(CH2)20CONH2by Li Ping58050000100000150000200000250000300000350000Time (min.)Ion Abundance02468101214m/z250300350400450020000400006000080000100000120000 338

41、.3 339.3250300350400450020004000600080001000012000 338.3 436.4 339.2 437.5 411.2 312.1 356.3 284.3Ion AbundanceIon Abundance聚合物润滑添加剂聚合物润滑添加剂:APCI 正离子模式-分析芥酸酰胺(Erucamide)样品by Li Ping59抗氧添加剂作用作用: 防止聚合物在挤出时防止聚合物在挤出时,由于氧化而受到破坏由于氧化而受到破坏Irgafos 168MW 646.6Irganox 1076MW 530.4OP3HOCH2CH2C=OOC18H37by Li Pin

42、g60抗氧添加剂, Irgafos 168 by Positive Ion APCIIrgafos 168MW 646.6OP3600625650675700050000100000150000200000250000300000 663.5 664.5 665.5 607.460062565067570002000004000006000008000001E6 647.5 648.5 649.5M +16m/z0246810121416050000010000001500000200000025000003000000Time (min.)Ion AbundanceIon AbundanceIon Abundanceby Li Ping61Irganox 1076 by Negative Ion APCI 02468101214-5-2.502.557.5100246810121405000001000000150000020000002500000UV Signal 280 nmTotal Ion ChromatogramNegative Ion APCITime (min.)mAUIon AbundanceIrganox 1076MW 530.4HOCH2CH2C=OOC18H37m/zIon Abundance(M