第七章分子发光-荧光与磷光

1、第七章molecular luminescence analysis一、荧光与磷光的产生过程luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence 由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。1. 分子能级与跃迁分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级； 基态(S0)激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势； 第一、第二、电子激发单重态 S1 、S2 ； 第一、第二、

2、电子激发三重态 T1 、 T2 ；2.电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低； 大多数有机分子的基态处于单重态； S0T1 禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小； 2.激发态基态的能量传递途径(分子的去激过程) 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁跃迁( (发光发光) )和无辐射跃迁等方式失去能量；和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无辐

3、射跃迁 激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光荧光：10-710 -9 s,第一激发单重态单重态的最低振动能级基态；磷光磷光：10-410s；第一激发三重态三重态的最低振动能级基态；S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换振动弛豫分子吸收和发射过程的Jablonski能级图非辐射能量传递过程振动弛豫振动弛豫：在凝聚相体系中，被激发到激发态(如S1和S2)的分子能通过与溶剂分子的碰撞迅速以热的形式把多余的振动能量传递给周围的分子，而自身返回该电子能级的最低振动能级，

4、这个过程称为振动弛豫。发生振动弛豫的时间10 -12 s。内转换内转换：当S2的较低振动能级与S1的较高振动能级的能量相当或重叠时，分子有可能从S2的振动能级以无辐射方式过渡到S1的能量相等的振动能级上。这个过程称为内转换。内转换发生的时间约为10 -12 s。内转换过程同样也发生在激发态三重态的电子能级间。 由于振动弛豫和内转换过程极为迅速(10 -12 s)，因此，激发后的分子很快回到电子第一激发单重态S1的最低振动能级。所以高于第一激发态的荧光发射十分少见。外转换外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换过程是荧光或磷光的竞争过程，因此，该过程使荧光或

5、磷光减弱或“猝灭”。系间跨越系间跨越：是不同多重态之间的一种无辐射跃迁。该过程是激发电子改变其自旋态，分子的多重性发生变化的结果。当两种能态的振动能级重叠时，这种跃迁的概率增大。 如S1到T1跃迁就是系间跃迁的例子，即单重态到三重态的跃迁。即较低单重态振动能级与较高的三重态振动能级重叠。这种跃迁是“禁阻”的。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。辐射能量传递过程 荧光发射：荧光发射：当分子处于第一激发单重态当分子处于第一激发单重态S1的最低能级时，分的最低能级时，分子返回基态的过程比振动弛豫和内转化过程慢得多。分子可子返回基态的过程比振动弛豫和内转化过程慢得多。分子可能通过发射光子跃

6、迁回到基态能通过发射光子跃迁回到基态S0的各振动能级上，这个过程的各振动能级上，这个过程称为荧光发射。称为荧光发射。电子由第一激发单重态的最低振动能级基态（ 多为 S1 S0跃迁），发射波长为 l2的荧光； 10-710 -9 s 。 由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长； l l2 l l 2 l l 1 ；磷光发射磷光发射：激发态分子经过系间跨跃达到激发三重态后，并经过迅速的振动弛豫达到第一激发三重态(T1)的最低振动能级上，从T1态分子经发射光子返回基态。此过程称为磷光发射。磷光发射是不同多重态之间的跃迁(即T1 S0)，故属于“禁阻”跃迁。因此磷光的寿命比荧光要长很多，约

7、为10-3到10s。所以，将激发光从磷光样品移走后，还常可以观察到发光现象，而荧光发射却观察不到该现象。2. 分子的活化与去活化 分子的活化与去活化*MXMX n1iihv n1jjhvMXMX* 任何荧光分子都具有两种特征的光谱，即激发光谱和发射光谱。荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 90004008001200160020002400280032003600400044004800 IFl l 固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关

8、系曲线。 固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线。200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 90004008001200160020002400280032003600400044004800 IFl l200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发

9、光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱三、荧光光谱的特征激发光谱与发射光谱的关系1、Stokes位移 在溶液中，分子的荧光发射波长总是比其相应的吸收(或激发)光谱的波长长，荧光发射这种波长位移的现象称为Stokes位移。 处于激发态的分子一方面由于振动弛豫等损失了部分能量，另一方面溶剂分子的弛豫作用使其能量进一步损失，因而产生了发射光谱波长的位移，这种位移表明在荧光激发和发射之间所产生的能量损失。200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900040080012001600200024002800320036004000440

10、04800 IFl l 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。 镜像规则的解释大多数吸收光谱的形状表明了分子的第一激发态的振动能级结构，而荧光发射光谱则表明了分子基态的振动能级结构一般情况下，分子的基态和第一激发单重态的振动能级结构相似，因此吸收光谱的形状与荧光发生光谱的形状呈镜像对称关系。3、荧光发射光谱的形状与激发波长无关 一般地，用不同波长的激发光激发荧光分子，可以观察到形状相同的荧光发射光谱。荧光分子无论被激发到哪一个激发态，处于激发态的分子经振动弛豫及内转换等过程最终回到第一激发态的最低振动能级。而分子的荧光发射总是从第一激发态的最低振动能级跃迁到基态的

11、各振动能级上，所以荧光光谱的形状与激发波长无关。S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换振动弛豫分子吸收和发射过程的Jablonski能级图200250300350400450500550600650700750800850900080016002400320040004800 IFl lRLSbC303. 20teT,bCIIlgTlgA bC303.20te1T1II1 )e1(IIIbC303.20t0 )e1(I)II(IbC303.20t0F !nx!4x!3x!2x!1x1en432

12、x )!4)bC30. 2(!3)bC30. 2(!2)bC30. 2(bC30. 2(II4320F CbIk30. 2I0FF CbIk30. 2I0PP CKIF KCIP n1iikkF(P)F(P)1 激激发发分分子子总总数数发发射射荧荧光光的的分分子子数数 F n1iiFFFkkk 激激发发分分子子总总数数发发射射磷磷光光的的分分子子数数 P n1iiPPstPkkk 强荧光的有机化合物具备下特征强荧光的有机化合物具备下特征:具有大的共轭具有大的共轭键结构；键结构；具有刚性的平面结构；具有刚性的平面结构；具有最低的单重电子激发态为具有最低的单重电子激发态为S1为为 * 型；型；取代

13、基团为给电子取代基。取代基团为给电子取代基。N NN NCCOO-O-OCOCOO-O-OCH2OHCH3H3CONO2NCH3H3C-O3SNCH3H3CSO3-CCHHCCHHOHO-OHO-三. 金属螯合物的荧光NOHNOZnNNOOAlNNOHHO三、影响荧光强度的环境因素1.1.溶剂的影响溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；2.2.温度的影响温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。3. 3. 溶液溶液pHpH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；4.内滤光作用和自吸现象自吸现象自吸现象：化合物

14、的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；5.溶液荧光的猝灭Hhvhvk*,k*1QMQMMMMM2 *,*hvhvAADD )(A)D()A()(D)(A)D()A()(D1*0011*001SSSTSSSS* NCH3CH3NCH3CH3+_23*3231OMOM 1k*hvhvDDDD D)(DDD11* kT M2M)M(MM*3*3*3400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 5000102030405060708090100

15、 T T %l lbCIIlgA0t CbIk30. 2I0FF A ,I ,kI0FF 紫外-可见分光光度计测量池(吸收池)I0ItI0ItIF,p7.5 7.5 化学发光分析化学发光分析一、一、基本原理基本原理1. 1. 化学发光反应化学发光反应 在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。 A +B = C + D* D* D + h （1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=

16、170300 kJ/mol；位于可见光区；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行；发光持续时间较长，反应持续进行； 化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。2.2.化学发光效率化学发光效率化学效率：化学效率：clceem发射光子的分子数参加反应的分子数ce激发态分子数参加反应分子数发光效率：发光效率：em产生光子数激发态分子数时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)： clclddcIttdc/dt 分析物参加反应的速率；3.3.化学发光强度与化学发光分析的依据化学发光强度与化学发光分析的依据 在化学发光分析中，被分

17、析物相对于发光试剂小得多，对于一级动力学反应： cttcttIAttcl0cl0cldddd dc/dt =Kc； K 为反应速率常数。定性依据：定性依据：（1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性：4.4.化学发光反应的类型化学发光反应的类型（1 1）气相化学发光反应）气相化学发光反应a. 一氧化氮与一氧化氮与O3的发光反应的发光反应 NO + O3 NO2* NO2* NO2 + h 发射的光谱范围：600875nm，灵敏度1ng/cm-3；b.氧原子与氧原子与SO2、NO、CO的发光反应的发光反应 O3 O2

18、+ O （1000 C石英管中进行） SO2 + O + O SO2* + O2 SO2 * SO2* + h 最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3； O3 O2 + O （1000 C石英管中进行石英管中进行） NO + O NO2* NO2 * NO2 + h 发射光谱范围：发射光谱范围：4001400nm；灵敏度；灵敏度1ng/cm-3；氧原子与氧原子与CO的发光反应：的发光反应： CO + O CO2* CO2 * CO2 + h 发射光谱范围：发射光谱范围：300500nm；灵敏度；灵敏度1ng/cm-3； 氧原子与氧原子与NO的发光反应：的发光反应：c. 乙烯与乙烯与O

19、3的发光反应的发光反应 乙烯与乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：反应，生成激发态乙醛： CH2O* CH2O + h 最大发射波长：最大发射波长：435nm；对；对O3的特效反应；线性响应的特效反应；线性响应范围范围1 ng/cm-3 1 g/cm-3；（2 2）火焰中的化学发光反应）火焰中的化学发光反应 在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；a. 一氧化氮一氧化氮 NO + H HNO* HNO * HNO + h 发射光谱范围：发射光谱范围：660770nm； 最大发射波长：最大发射波长：690nm； 在在富氢火焰中：富氢火焰中： NO2 + 2

20、H NO + H2O 该反应十分迅速；该反应十分迅速；b.硫化物硫化物 挥发性硫化物挥发性硫化物SO2 、H2S 、CH3SH、 CH3SCH3等等在富在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）： SO2 + 2H2 S + 2H2O S + S 2S2 * S2 * S2 + h 发射光谱范围：发射光谱范围：350460nm； 最大发射波长：最大发射波长：394nm； 灵敏度：灵敏度： 0.2 ng/cm-3； 发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。（3 3）液相中的化学发光反应）液相中的化学发光反应 机理研究较多

21、，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2 、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。 应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）； 化学发光反应效率：0.150. 05； 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：反应过程： 该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可测定这些金属离子。5. 5. 化学与生物发光分析的应用化学与生物发光分析的应用（1） 该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+ 、Mn2+、Co2+、V4+、F

22、e2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等等（2） 可检测低至可检测低至 10-9 mol/L 的的H2O2；（3） 间接测定某些生物试样间接测定某些生物试样 氨基酸氨基酸 + O2 酮酸酮酸 +NH3 + H2O2 氨基酸氧化酶 葡萄糖葡萄糖 + O2 + H2O 葡萄糖酸葡萄糖酸 + H2O2 通过测定生成的通过测定生成的H2O2 ，确定，确定氨基酸、葡萄糖氨基酸、葡萄糖含量。含量。葡萄糖氧化酶 草酸二酯(能量提供体)+高浓度双氧水+稠环芳烃(能量接受体)+金属离子+溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光(冷光源)。生物

23、发光分析应用生物发光分析应用 1 1 在pH 78；荧光素酶(E)和Mg2+的存在下，荧光素(LH2)与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)： ATP + LH2 + E + Mg2+ AMP LH2 E +Mg ppi + 2H+pH7 - 8复合物与氧反应，产生化学发光： AMP LH2 E + O2 氧化荧光素* + AMP+CO2 + H2O氧化荧光素* 氧化荧光素 + h最大发射波长562nm；生物发光分析应用生物发光分析应用 2 2 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用下，在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反应 ：NADH + FMA + H+ NAD+ + FMNH2NADH脱氢酶FMNH2 + RCHO + O2 FMN + RCOOH + H2O + h黄素酶最大发射波长495 nm；二、二、特点特点1. 1