5-园艺植物 组织培养

1、 植物组织培养技术植物组织培养技术 一、植物组织培养的概念一、植物组织培养的概念 1. 1. 概概 念念 植物组织培养（植物组织培养（Plant tissue culturePlant tissue culture）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括甚至包括完整植株完整植株进行培养的技术。进行培养的技术。 2.2.主要特征主要特征 （1 1）在培养容器中进行；）在培养容器中进行； （2 2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌

2、以及害虫等的侵入；及害虫等的侵入； （3 3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。 （4 4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；）通常打破了正常的植物发育过程和格局； （5 5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。物显微结构进行操作成为可能。二、植物组织培养技术的发展历史二、植物组织培养技术的发展历史 1、 早期探索阶段早期探索阶段 （1930年以前）年以前） 1893年

3、，年，Schwann和和Scheiden提出细胞学说及植物细胞全能性理论。提出细胞学说及植物细胞全能性理论。 1902年，德国植物生理学家年，德国植物生理学家Haberlandt第一次尝试采用植物组织培养第一次尝试采用植物组织培养技术对小野芝麻、风眼兰叶肉组织及万年青属植物的表皮细胞进行培养，技术对小野芝麻、风眼兰叶肉组织及万年青属植物的表皮细胞进行培养，但未能培养成活。但未能培养成活。 1904年，年，Hanning首次对十字花科的萝卜和辣根的胚培养成功。首次对十字花科的萝卜和辣根的胚培养成功。 1922年，年，Knudson将兰花种子在离体的条件下非共生萌发。同年，将兰花种子在离体的条件下

4、非共生萌发。同年，Knotte和和Robbins对离体根尖进行了培养。对离体根尖进行了培养。Robbins还对豌豆、玉米及棉花还对豌豆、玉米及棉花的茎尖进行了培养，只形成一些缺绿的叶和根。的茎尖进行了培养，只形成一些缺绿的叶和根。 1925年，年，Laibach利用胚培养技术对亚麻的种间杂种胚进行了培养，利用胚培养技术对亚麻的种间杂种胚进行了培养，并于并于1929年利用亚麻的胚培养来克服杂交不亲和性。年利用亚麻的胚培养来克服杂交不亲和性。2、植物组织培养技术的初步形成（、植物组织培养技术的初步形成（1930-1960年）年） 1933年，我国植物生理学家李继侗培养银杏胚胎，并发现银杏胚乳提取年

5、，我国植物生理学家李继侗培养银杏胚胎，并发现银杏胚乳提取液可促进离体胚的生长。液可促进离体胚的生长。 1937年，年，White发现发现B族维生素对离体根培养的重要性。并指出族维生素对离体根培养的重要性。并指出IAA对植对植物生长发育的控制起重要作用。物生长发育的控制起重要作用。 1937,1938年，年，Gantheret在培养基中加入上述生长因子，使得柳树形成层在培养基中加入上述生长因子，使得柳树形成层诱导形成的愈伤组织连续生长。诱导形成的愈伤组织连续生长。Nobecomt对烟草种间杂种茎段的形成层细对烟草种间杂种茎段的形成层细胞培养也得到了类似的结果。胞培养也得到了类似的结果。 1948

6、年，年，Skoog等通过对烟草茎段和髓培养发现，不定芽和不定根的发生等通过对烟草茎段和髓培养发现，不定芽和不定根的发生由生长素由生长素/腺嘌呤的比例决定。腺嘌呤的比例决定。 1950年，年，Ball从红杉愈伤组织培养中再生获得器官。从红杉愈伤组织培养中再生获得器官。1952年年，Morel和和Martin通过分生组织培养获得大丽花的脱毒植株，同通过分生组织培养获得大丽花的脱毒植株，同年，首次应用微型嫁接技术。年，首次应用微型嫁接技术。1953年，年，Tuleche首次从花粉培养中获得银杏的单倍体愈伤组织。首次从花粉培养中获得银杏的单倍体愈伤组织。1955年，年，Miller等发现了一种促进细胞

7、分裂的植物激素等发现了一种促进细胞分裂的植物激素激动素，后来激动素，后来发现激动素可用来代替腺嘌呤促进芽的形成，而且其效力比后者高发现激动素可用来代替腺嘌呤促进芽的形成，而且其效力比后者高3万万倍。倍。1957年年，Skoog和和Miller发现改变细胞分裂素发现改变细胞分裂素/生长素比例，可以控制根生长素比例，可以控制根和芽的发生。和芽的发生。1958年年，Maheshwari和和Rangaswamy从柑橘胚珠的珠心组织培养中再生从柑橘胚珠的珠心组织培养中再生获得体细胞胚；同年，获得体细胞胚；同年，Reinert 和和Steward分别从胡萝卜的愈伤组织和细分别从胡萝卜的愈伤组织和细胞培养中

8、再生得到原胚，为以后的组织培养中器官发生和体细胞胚胎发胞培养中再生得到原胚，为以后的组织培养中器官发生和体细胞胚胎发生奠定了基础，也为植物细胞全能性理论提供了证据。生奠定了基础，也为植物细胞全能性理论提供了证据。3、植物组织培养技术的发展（、植物组织培养技术的发展（1960年以后）年以后）1960年，年，Morel利用兰花茎尖培养对兰花进行营养繁殖；利用兰花茎尖培养对兰花进行营养繁殖； 1962年，年，Murashige和和Skoog开发出最著名的开发出最著名的Murashige和和Skoog培养培养基（基（MS基本培养基），并被后来广泛采用的基本培养基。基本培养基），并被后来广泛采用的基本培

9、养基。1964年，印度人年，印度人Guha和和Maheshwari利用曼陀罗花粉培养获得第一例利用曼陀罗花粉培养获得第一例单倍体植株。从而开辟了单倍体育种技术。单倍体植株。从而开辟了单倍体育种技术。1971年年，Takebe等获得第一例原生质体培养的再生植株。等获得第一例原生质体培养的再生植株。1972年，年，Carlson等利用原生质体融合在两个烟草属中进行种间杂交。等利用原生质体融合在两个烟草属中进行种间杂交。1974年年，Murashige等利用细胞分裂素诱导茎尖侧芽分枝。等利用细胞分裂素诱导茎尖侧芽分枝。Zaenen和和Larebeke分别发现土壤农杆菌（分别发现土壤农杆菌（Agrib

10、acterium）中的根瘤诱导的主要）中的根瘤诱导的主要成分是成分是Ti质粒。质粒。1978年年，Melchers等进行了番茄和马铃薯的体细胞杂交。等进行了番茄和马铃薯的体细胞杂交。1979年年，Marton提出了利用植物原生质体和土壤农杆菌共培养的方提出了利用植物原生质体和土壤农杆菌共培养的方法进行转化。法进行转化。1981年，年，Larkin和和Scowcroft引入引入“体细胞无性系变异（体细胞无性系变异（Somaclonal variation）”这一术语。这一术语。1982年年，Krens等的工作证明，原生质体可以摄入裸露的等的工作证明，原生质体可以摄入裸露的DNA，表明，表明可以用

11、外源可以用外源DNA对原生质体进行遗传转化。对原生质体进行遗传转化。1982年，年，Zimmermann利用电刺激进行原生质体融合。利用电刺激进行原生质体融合。1985年年，Horsch等用土壤农杆菌对叶盘进行感染和转化，并得到再等用土壤农杆菌对叶盘进行感染和转化，并得到再生的转化植株。生的转化植株。 二、植物组织培养类型二、植物组织培养类型（根据不同分类的依据可以分为不同类型）根据不同分类的依据可以分为不同类型） 1 1、根据培养材料不同分为：、根据培养材料不同分为： （1）完整植株培养完整植株培养（Plant Culture）：对幼苗和较大植株等的培养。）：对幼苗和较大植株等的培养。 （2

12、）胚胎培养（）胚胎培养（Embryo Culture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。培养。 （3）器官培养（）器官培养（Organ Culture）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花器官的培养。器官的培养。 （4）组织培养（）组织培养（Tissue Culture）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。 （5）细胞培养（）细胞培养（Cell Culture）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。 （6）原生质体培养（）原生质体培养（P

13、rotoplast Culture）：指对去掉细胞壁后所获得的原）：指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。生质体进行培养。 矮牵牛茎尖离体培养培矮牵牛茎尖离体培养培养养 牡丹成熟胚的离体培养与快速繁殖牡丹成熟胚的离体培养与快速繁殖Mature embryo culture and rapid propagation of tree peony微型月季茎段离体培养微型月季茎段离体培养花烛叶片离体快速繁殖花烛叶片离体快速繁殖大蒜根尖培养及植株再生大蒜根尖培养及植株再生大蒜试管鳞茎诱导大蒜试管鳞茎诱导人参细胞悬浮人参细胞悬浮培养培养非洲紫罗兰原生质体分离、非洲紫罗兰原生质体分离、培养及植株再生培

14、养及植株再生2 2、根据再生途径分为：、根据再生途径分为： （1 1）器官发生途径器官发生途径（Organogenesis）：）： 直接器官发生途径：植物器官可以直接由外植体上诱直接器官发生途径：植物器官可以直接由外植体上诱导。如茎尖培养。导。如茎尖培养。 间接器官发生途径：成熟细胞经过脱分化间接器官发生途径：成熟细胞经过脱分化（dedifferentiation）及再分化（）及再分化（redifferentiation）过程）过程而形成新的组织和器官的过程。如叶片培养。而形成新的组织和器官的过程。如叶片培养。 （2）体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生（Somatic embryogenesis）：

15、）： 体胚发生途径是指二倍体或单倍体的体细胞在特定条件体胚发生途径是指二倍体或单倍体的体细胞在特定条件下未经性细胞融合而通过与合子胚发生类似的途径发育下未经性细胞融合而通过与合子胚发生类似的途径发育出新个体的形态发生过程。经体胚发生形成类似合子胚的出新个体的形态发生过程。经体胚发生形成类似合子胚的结构称为胚状体（结构称为胚状体（embryoid）或体细胞胚）或体细胞胚(somatic embryo). 直接器官发生直接器官发生 间接器官发生间接器官发生体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生贯叶金丝桃不定芽直接再生过程贯叶金丝桃不定芽直接再生过程 优化培养基优化培养基 无蔗糖无蔗糖 1%蔗糖蔗糖 5%蔗糖

16、蔗糖 无无BAP BAP 0.1mg/l BAP 5.0mg/l 无无NAA非洲紫罗兰叶片培养非洲紫罗兰叶片培养骨特异性碱性磷酸酶骨特异性碱性磷酸酶BAP 优化培养基优化培养基 无蔗糖无蔗糖 1%蔗糖蔗糖 5%蔗糖蔗糖 无无BAP BAP 0.1mg/l BAP 5.0mg/l 无无NAA台湾百合离体培养台湾百合离体培养大花蕙兰原球茎增殖与植株再生大花蕙兰原球茎增殖与植株再生 器官发生途径（原球茎的形成）：器官发生途径（原球茎的形成）： 大蒜愈伤组织培养大蒜愈伤组织培养 日本牵牛花的离体培养日本牵牛花的离体培养禾本科牧草的体胚发生过程禾本科牧草的体胚发生过程菊花体细胞胚胎发生及植株再生菊花体细

17、胞胚胎发生及植株再生大蒜体细胞胚胎发生过程大蒜体细胞胚胎发生过程 人工种子（人工种子（Artificial seedArtificial seed，SyntheticSyntheticSeedSeed）：）：是指植物离体培养产生的胚状体或不是指植物离体培养产生的胚状体或不定芽被包裹在含有营养和保护功能的人工胚乳定芽被包裹在含有营养和保护功能的人工胚乳和人工种皮中，从而形成能发芽出苗的颗粒体。和人工种皮中，从而形成能发芽出苗的颗粒体。作为繁殖材料。作为繁殖材料。3 3、根据培养基的类型分为、根据培养基的类型分为: : （1 1）固体培养（固体培养（Solid cultureSolid cultu

18、re）: : 琼脂、卡拉胶等固琼脂、卡拉胶等固化。化。 （2 2）半液半固体培养）半液半固体培养(Semisolid Culture)(Semisolid Culture)：固液双：固液双层。层。 （3 3）液体培养）液体培养(Liquid Culture)(Liquid Culture)：震荡、旋转或静置：震荡、旋转或静置培养。培养。液体培养的优点：液体培养的优点： A 不使用凝固剂，节约生产成本不使用凝固剂，节约生产成本 B 营养吸收充分；营养吸收充分； C 操作过程简化。操作过程简化。MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高

19、，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要,因而适用范围比较广。 大量元素 成分分子量使用浓度 (mg/L)硝酸钾KNO3101.211900硝酸铵NH4NO380.041650磷酸二氢钾KH2PO4136.09170硫酸镁MgSO4.7H2O246.47370氯化钙CaCl2.2H2O147.02440微量元素碘化钾KI166.010.83硼酸H3BO361.836.2硫酸锰MnSO4.4H2O223.0122.3硫酸锌ZnSO4.7 H2O287.548.6钼酸钠Na2MoO4.2 H2O241.950.25硫酸铜CuSO4.5 H2

20、O249.680.025氯化钴CoCl2.62237.930.025铁盐乙二胺四乙酸二钠Na2.EDTA372.2537.3硫酸亚铁FeSO24.7H2O278.0327.8有机成分肌醇100甘氨酸2盐酸硫胺素VB10.1盐酸吡哆醇VB60.5烟酸VB5 或 VPP0.5蔗糖sucrose 342.3130g /L琼脂agar7 g /L固体培养：固体培养：液体培养液体培养体胚液体培养体胚液体培养 不同类型液体培养装置不同类型液体培养装置 液体培养体系液体培养体系菠萝种苗液体培养系统菠萝种苗液体培养系统 丹参毛状根培养丹参毛状根培养三、植物组织培养技术的理论基础三、植物组织培养技术的理论基础

21、植物细胞的全能性植物细胞的全能性(Plant cellular totipotency） 从理论上讲，植物体的每个生活从理论上讲，植物体的每个生活细胞都具有细胞都具有该植物体的全部遗传信息，在特定的离体培养条该植物体的全部遗传信息，在特定的离体培养条件下，具有发育成完整植株的潜在能力。件下，具有发育成完整植株的潜在能力。 分化、脱分化与再分化：分化、脱分化与再分化：分化是指个体发育分化是指个体发育过程中，不同部位的细胞形态结构和生理功能发过程中，不同部位的细胞形态结构和生理功能发生改变，形成不同组织或器官。生改变，形成不同组织或器官。 脱分化也称去分化，是指离体条件下生长的细胞、组脱分化也称去

22、分化，是指离体条件下生长的细胞、组织或器官逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生能力，形织或器官逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生能力，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织的过程。再分化是由脱成无组织结构的细胞团或愈伤组织的过程。再分化是由脱分化形成的愈伤组织重新分化出特定细胞、组织和器官的分化形成的愈伤组织重新分化出特定细胞、组织和器官的过程。过程。 细胞全能性的表达：细胞全能性的表达：尽管理论上每个细胞都具尽管理论上每个细胞都具有全能性，但实际表达难易程度却随有全能性，但实际表达难易程度却随植物种类、植物种类、组织和细胞的不同而异。组织和细胞的不同而异。五、植物组织培养技术的应用五、植物组织培养技

23、术的应用1 1、优质种苗的快速无性繁殖：、优质种苗的快速无性繁殖： （1 1）无性繁殖作物及不易繁殖作物的快速繁殖无性繁殖作物及不易繁殖作物的快速繁殖园艺植物种苗工厂化生产园艺植物种苗工厂化生产兰科植物生产兰科植物生产ABECFG花烛属植物花烛属植物厥类植物厥类植物盆栽及切花植物的繁殖盆栽及切花植物的繁殖珍贵树种珍贵树种无菌苗快速繁殖无菌苗快速繁殖无菌苗驯化无菌苗驯化组培苗驯化移栽组培苗驯化移栽 （2）通过茎尖培养生产脱毒健康种苗：如草莓、香蕉、通过茎尖培养生产脱毒健康种苗：如草莓、香蕉、 甘蔗、马铃薯、大蒜等。甘蔗、马铃薯、大蒜等。virus-freevirus-freetissuetiss

24、ue茎尖培养脱毒茎尖培养脱毒脱毒马铃薯种薯生物反应器液体培养脱毒马铃薯种薯生物反应器液体培养2 2、用于植物遗传育种、用于植物遗传育种 包括种质资源离体保存；花粉花药培养产包括种质资源离体保存；花粉花药培养产生单倍体；胚乳培养产生三倍体；胚培养拯救生单倍体；胚乳培养产生三倍体；胚培养拯救杂种胚克服远缘杂交障碍；原生质体培养进行杂种胚克服远缘杂交障碍；原生质体培养进行体细胞杂交；植物体细胞无性系变异诱导和筛体细胞杂交；植物体细胞无性系变异诱导和筛选；用于植物基因转移操作等。选；用于植物基因转移操作等。 种质资源的离体保存种质资源的离体保存体细胞无性系变异筛选体细胞无性系变异筛选 花粉、花药培养产

25、生单倍体植株花粉、花药培养产生单倍体植株 幼胚拯救克服远缘杂交障碍幼胚拯救克服远缘杂交障碍 用于基因工程技术创造植物新种质。用于基因工程技术创造植物新种质。3 3、大规模植物细胞、组织和器官培养生产次、大规模植物细胞、组织和器官培养生产次生代谢物质；生代谢物质； 根培养根培养: :正常根培养，正常根培养， 毛状根培养毛状根培养4 4、用于植物生长发育理论研究，包括生理学、用于植物生长发育理论研究，包括生理学、病理学、胚胎学和细胞与分子生物学等。病理学、胚胎学和细胞与分子生物学等。 植物胚胎发生理论植物胚胎发生理论研究研究 生长发育特性研究生长发育特性研究继代培养时材料的玻璃化继代培养时材料的玻

26、璃化 玻璃化 当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明和水渍状，这种现象称玻璃化。 呈现玻璃化的试管苗，其茎、叶表面无蜡质，体内的极性化合物水平较高，细胞持水力差，植株蒸腾作用强，无法进行正常移栽。这种情况主要是由于培养容器中空气湿度过高，透气性较差造成的 。 控制和克服玻璃化现象的措施 增加培养基中的增加培养基中的 溶质水平，以降低培养基的溶质水平，以降低培养基的水势水势 随着琼脂浓度的增加，玻璃化的比例明显减少。随着琼脂浓度的增加，玻璃化的比例明显减少。 减少培养基中含氮化合物的用量减少培养基中含氮化合物的用量 增加光照强度增加光照强度增加容器通风增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用； 降低培养温度降低培养温度，温度主要影