免疫组化和荧光

1、2014-3-211 制作者：白慧2014-3-212免疫组化图片 2014-3-213免疫荧光图片 2014-3-214免疫组化与免疫荧光 免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素等) 显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法；这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用

2、，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。 2014-3-215实验原理 免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记的显色剂 显色来确定组织细胞内抗原；免疫荧光技术是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。2014-3-216实验步骤脱蜡水化：二甲苯 20min二甲苯 20min无水乙醇 10min无水乙醇 10min95%乙醇 5min80%乙

3、醇 5min75%乙醇 5min50%乙醇 过一遍蒸馏水 过三遍高压修复 4min流水冷却PBS冲洗 5min3次3%H2O2 15 min，37 /(0.5%Triton 5min)PBS冲洗 5min3次10%山羊血清封闭 37，50min一抗 4 ,过夜复温 37 ，1h PBS 冲洗 5 min x3 次 二抗 30 min PBS 冲洗 5 min x3 次DAB显色 1min /(DAPI 5min)PBS冲洗 (盖片，观察。)苏木素复染 1min自来水冲洗脱水，透明，封片。 2014-3-217 2014-3-218注意事项标本固定脱水、石蜡包埋和制片 脱蜡和水化 抗原修复 细胞

4、通透 灭活内源性过氧化物酶和生物素 血清封闭一抗和二抗浓度和孵育时间 抗体稀释液 切片清洗 DAB显色避光 复染封片 防止标本从玻片上脱落；除去妨碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；固定的标本易于保存。固定剂的选择一般用4%多聚甲醛脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则，容易裂片和脱片等。 为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。 由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使

5、得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。 使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。 灭活内源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右，而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般1030min；过氧化氢孵育时间过长易引起脱片 组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体

6、，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；但不能与一抗来源一致。一般室温10-30min。一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间、温度和抗体浓度。一抗孵育温度有：4、室温、37，其中4效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般371-2h，而4过夜和从冰箱拿出后37复温45min较好。二抗一般室温或3730min-1h。抗体稀释液用一般PBS即可，但专用的抗体稀释液中除PBS外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份，对抗体的多次回收利用较好。正因为这种原因，抗体稀释液的PH值可能偏酸，而使抗原抗体反应不佳，终而出现假阴性结果。 为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色

7、，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意：单独冲洗，防止交叉反应造成污染。温柔冲洗，防止切片的脱落。可用浸洗方式；冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。PBS的PH和离子强度的使用和要求。 背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的，特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗.防止荧光素提前衰退。目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用苏木素复染。苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟，胞浆蛋白可以适当时间

8、长一点，而胞核蛋白则要短。 一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止 2014-3-219石蜡切片在染色过程中出现脱片现象1）烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度；2）用含有多聚赖氨酸的玻片；3）有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲PBS不要直接冲到组织上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织；4）用高温修复时，温度骤冷也可能引起。 2014-3-2110免疫组化常见问题的处理 标本无染色 确认是否忽略了应该加的某种试剂(一抗、二抗、三抗及

9、底物等)。 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配。 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在48条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。 检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。 检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。 检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。 2014-3-2111弱阳

10、性 标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。 不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。 切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。 孵育时切

11、片是否放置水平，否则会导致抗体流失。如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。2014-3-2112产生组织切片非特异性染色1）抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。 2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，可试用单克隆抗体；3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；4）非特异性组分与抗体结合，通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；5）DAB孵育时间过长

12、或浓度过高；6）PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗孵育之后的浸洗要充分；7）标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。 2014-3-2113免疫荧光常见问题的处理 非特异性染色产生原因及其解决方案： 游离荧光素残留在二抗中。购买高质量、高纯度的荧光素二抗。抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原，可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。延长血清封闭时间。从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。荧光素不纯、标本固定不当等。一抗和二抗孵育条件和浓度不合适。调整一抗和二抗孵育条件和浓度至最佳。一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次数和延长清