pull down 实验方法_第1页
全文预览已结束

下载本文档

版权说明：本文档由用户提供并上传，收益归属内容提供方，若内容存在侵权，请进行举报或认领

文档简介

1、植物科学最前沿公众号粉丝提供，严谨商用，只限自用Pull Down实验流程1. 混合两种预测相互作用的蛋白。（Protein-A-GST & Protein-B-HIS，下面实验用GST 树脂IP，用Western Blot检测HIS；反之亦然。如果是纯化后的蛋白，需要进行偷袭或者使用超滤离心管为蛋白更换溶液，之后才能继续Pull Down。）2. 加入1 mL Binding Buffer。Binding Buffer：50 mM Tris.HCl （pH7.50.） 100 mM NaCl 0.25% Triton-X 100 35 mM -Me（巯基乙醇）3. 将混合蛋白在4条件下旋转结

2、合2-4 h。4. 加入20-30 L GST-BindTM Resin结合2-4 h。5. 4 ，150-200 g 离心2 min，吸弃上清（小心！不要吸弃底部沉淀）。第一次弃去的上清样品记为Washing- Protein-A/ Protein-B，用于SDS-PAGE电泳时的对照。6. 加入1 mL Binding Buffer，4 条件下旋转混匀5-10 min，4 ，150-200 g 离心2 min，吸弃上清。7. 重复步骤6，用1 mL Binding Buffer 清洗5-6次。8. 最后一次清洗后留有20-30 L 液体，加入适量的 Loading Buffer，95金属浴

3、5-10 min，150-200 g 离心5 min，样品记为上样跑SDS-PAGE电泳。电泳样品顺序：Marker，Protein-A-GST，Protein-B-HIS，Washing- Protein-A/ Protein-B，Pull Down- Protein-A/ Protein-B此次电泳的目的，一是初步检测两个蛋白是否互作，二是可以为后面正式实验所需蛋白量提供参考。用于正式检测两个蛋白是否互作电泳顺序如下： （input，蛋白量为后两者的1/10）Marker，Protein-B-HIS ， GST+ Protein-B-HIS， Protein-A-GST+ Protein-B-HISMarker，Protein-A-GST ， HIS+ Protein-A-GST， Protein-B-HIS+ Protein-B-GST9. 转PVDF膜，350 mA 恒流，2 h 左右。（PVDF膜用之前，用甲醇泡2 min）10. 做Western Blot 过程：预杂交1 h 以上；杂交一抗1 h 以上；洗膜三次，每次10 min ；杂交二抗1 h 以上；洗膜三次，每次10 min。11. 显影：用1 mL 发光液A + 1 mL发光液

人人文库> 全部分类> 教育资料 > 中学教育

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明，都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等，如果需要附件，请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸，网页内容里面会有图纸预览，若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间，仅对用户上传内容的表现方式做保护处理，对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑，并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容，请与我们联系，我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

最新文档

评论

0/150

提交评论