紫外分光广度法

1、CZYQFX-UV紫外紫外- -可见分光光度法可见分光光度法(UV-Vis CZYQFX-UVF 四大光谱之一F 灵敏度较高(10-6g/ml)F 应用广泛F 定量分析(定性鉴别, 结构鉴定) 对乙酰氨基酚、阿替洛尔 青蒿素、鱼肝油、维生素A、维生素B2、 维生素B12CZYQFX-UV内容提要内容提要 一、基本原理一、基本原理 二、紫外可见分光光度计二、紫外可见分光光度计 三、定性与定量方法三、定性与定量方法 四、分析条件的选择四、分析条件的选择 五、紫外吸收光谱与有机分子的结构关系五、紫外吸收光谱与有机分子的结构关系CZYQFX-UV一、基本原理定量依据一、基本原理定量依据t0lglgII

2、=T-=A1Lmbert-Beer定律定律ItI0A = -lgT 条件：单色的平行光；均匀的稀溶液条件：单色的平行光；均匀的稀溶液 A= KLCK：吸光系数或吸收系数；：吸光系数或吸收系数；0tII=T吸光度吸光度(absorbance, A)(absorbance, A)CZYQFX-UV2 2吸光系数（吸光系数（K K） 吸光物质在单位浓度及吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度单位厚度时的吸光度C mol/LC 1g/100ml摩尔吸光系数，摩尔吸光系数，用用表示表示百分吸光系数，百分吸光系数，用用 表示表示1cm1%EK影响因素：物质的本性；入射光波长；溶剂K越大，物质在此波长的灵敏

3、度越高。CZYQFX-UV摩尔吸光系数与百分吸光系数的关系摩尔吸光系数与百分吸光系数的关系3 3、吸收度的加和性、吸收度的加和性 %cmEM1110CZYQFX-UV max4 4吸收光谱（吸收曲线）吸收光谱（吸收曲线）A-A-曲线曲线 ACZYQFX-UV5 5偏离偏离BeerBeer定律的主要因素定律的主要因素 化学因素化学因素 溶液浓度偏高（溶液浓度偏高（0 0。01mol/l01mol/l）；缔合、）；缔合、 离解等因素。离解等因素。 光学因素光学因素 非单色光、非平行光、散射、反射等非单色光、非平行光、散射、反射等。 入射光的选择：入射光的选择：maxmax 或曲线平坦且灵敏度尽可能

4、高的波长或曲线平坦且灵敏度尽可能高的波长。 Lambert-BeerLambert-Beer定律的应用条件定律的应用条件： 稀溶液、单色光、稳定溶液。稀溶液、单色光、稳定溶液。CZYQFX-UV溶液偏离Beer定律 n偏离Beer定律，A-c曲线弯曲。主要原因：化学因素 吸光物质发生解离、缔合、溶剂化等现象；光学因素 复和光引起对Beer定律的偏离。 两种不同吸光系数的混两种不同吸光系数的混合光对合光对Beer定律的偏离定律的偏离 CZYQFX-UVn属于随机误差，来自仪器的噪音、暗噪音、散粒噪噪音、暗噪音、散粒噪音。音。n透光率误差T引起浓度误差c：n透光率透光率20% 65%，A为为0.2

5、0.7时，浓度相时，浓度相对误差较小。对误差较小。 测量误差和透光率的关系测量误差和透光率的关系 TTTcclg0.4346透光率的测量误差透光率的测量误差T可用范围：可用范围： 0.8-0.2控制方法控制方法: 通过改变通过改变 C 或或 L。CZYQFX-UV1.基本构造基本构造光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示器及数字显示器及数字处理系统处理系统CZYQFX-UV 波长范围波长范围:1901100nm:1901100nm 波长准确度波长准确度: :0.3nm0.3nm 波长重现性波长重现性: : 0.2nm0.2nm 吸光度吸光度( (透光率透光率) )测量范围测量范围:

6、-0.477+3.00: -0.477+3.00 光度准确度光度准确度: :透光率误差表示，透光率误差表示， 0.3%0.3% 光度重复性：光度重复性：透光率的变动，透光率的变动， 0.3%0.3% 分辨率：分辨率：260nm260nm处处=0.3nm 杂散光杂散光 2 2计量性能计量性能CZYQFX-UVCZYQFX-UV3.紫外紫外-可见分光光度计的类型可见分光光度计的类型单光束可见分光光度计（单光束可见分光光度计（721721型）；型）；单光束紫外单光束紫外- -可见分光光度计可见分光光度计 （751751型、型、752752型、型、75307530型）；型）；双光束紫外双光束紫外- -

7、可见分光光度计可见分光光度计 （国产（国产710710型、型、730730型、日本岛津型、日本岛津UV-200UV-200、UV-240UV-240）双波长紫外双波长紫外- -可见分光光度计可见分光光度计 （国产（国产WFZ800-SWFZ800-S型、日本岛津型、日本岛津UV-300UV-300型）。型）。CZYQFX-UV0.575光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示显示CZYQFX-UV差值A光源单色器吸收池检测器显示光束分裂器CZYQFX-UVCZYQFX-UV三、定性与定量三、定性与定量 对比吸收光谱特征数据对比吸收光谱特征数据；（；（max、min、sh 、 max）

8、对比吸收度比值；对比吸收度比值； 对比光谱的一致性。对比光谱的一致性。1 1定性鉴别定性鉴别2 2纯度检查纯度检查 杂质检查杂质检查 杂质限量检查杂质限量检查 ex. 肾上腺素中常含有杂质肾上腺酮，其肾上腺素中常含有杂质肾上腺酮，其 在在310nm处有紫外吸收，处有紫外吸收， E1%1cm435），）， 一般将样品配成一般将样品配成2mg/ml的的HCl溶液，测溶液，测A； 药典规定药典规定A0.5，则肾上腺酮含量，则肾上腺酮含量 0.9991. r 0.999 2. n = 5-7 2. n = 5-7 3. 3.待测浓度尽量在标准曲线中间位置待测浓度尽量在标准曲线中间位置标准曲线标准曲线(

9、A=aC+b,r(A=aC+b,r) )CZYQFX-UV特点：以标准溶液为参比液，特点：以标准溶液为参比液， 且且C样样C标，标， A样样=E C样样L A标标=E C标标L A= E LC C样样= C标标 + C示差分光光度法示差分光光度法CZYQFX-UV 多组分（双组分）的定量多组分（双组分）的定量解线性方程解线性方程 系数倍率法系数倍率法 等吸收双波长消去法等吸收双波长消去法导数光谱法、褶合光谱法导数光谱法、褶合光谱法 双波长法双波长法计算分光光度法计算分光光度法 A1ab = E1aLCa + E1bLCb A2ab = E2aLCa + E2bLCbCZYQFX-UV计算分光光

10、度法计算分光光度法 计算分光光度法是运用计算分光光度法是运用数学数学、统计学统计学与与计计算机科学算机科学的方法，通过试验设计与数据的的方法，通过试验设计与数据的变换变换和和解析解析，对物质进行定性定量的方法，属于，对物质进行定性定量的方法，属于化学计化学计量学量学(Chemometrics(Chemometrics) )的范畴。的范畴。CZYQFX-UV计算分光光度法计算分光光度法数学变换法数学变换法导数光谱法导数光谱法正交函数法正交函数法褶合光谱法褶合光谱法数值计算法数值计算法图解法图解法双波长法双波长法系数倍率法系数倍率法三波长法三波长法信号处理法信号处理法- -卡尔曼滤波法卡尔曼滤波法

11、主成分分析法主成分分析法矩阵解法矩阵解法偏最小二乘法偏最小二乘法CZYQFX-UV( (一一) ) 数值计算法数值计算法1 1、解线性方程组法、解线性方程组法 CE CE AAA CE CE AAAbb2aa2b2a2ba2bb1aa1b1a1ba1CZYQFX-UV A a b(干扰干扰) A) 2 2、双波长法、双波长法 工作波长工作波长参比波长参比波长CZYQFX-UV等吸收双波长消去法的等吸收双波长消去法的定量定量步骤步骤 1.1.分别配制分别配制待测组分待测组分a a及及干扰组分干扰组分b b的标准溶液；的标准溶液； 2.2.利用利用待测组分待测组分a a的标准溶液，作的标准溶液，作

12、待测组分待测组分的吸收光的吸收光谱（谱（A-A-曲线）曲线） ，找出，找出max，确定确定工作波长工作波长1 ； 3.3.利用利用干扰组分干扰组分的标准溶液，寻找的标准溶液，寻找参比波长参比波长2（在（在1和和2处，干扰组分的吸收度相等）；处，干扰组分的吸收度相等）； 4.4.配制标准系列；配制标准系列； 5.5.分别在分别在1和和2处，测定标准系列的吸收度处，测定标准系列的吸收度A A值，求出值，求出A，作工作曲线（作工作曲线（ A - -C曲线）曲线）；或求回归方程；或求回归方程； （A = K= KCa+ h） 4.4.在相同条件下，测量样品的在相同条件下，测量样品的A A值，并求出值，

13、并求出A A值；值； 5.5.利用回归方程，计算样品中待测组分的浓度。利用回归方程，计算样品中待测组分的浓度。CZYQFX-UV l )CE(EAA AAAAA AAA AAAaa1a2a1a212b1b2b2a22b1a11a(a(待测待测) )b(干扰干扰)M(M(混合混合) )CZYQFX-UV3 3、系数倍率法、系数倍率法 （当干扰组分的吸收光谱找不出等吸收波长时。）当干扰组分的吸收光谱找不出等吸收波长时。）A干扰干扰yxA Ay2y2 A Ay1y112条件：条件： A Ay2y2 A Ay1y1CZYQFX-UV KAy2=Ay1 则则 KA2=K(Ax2 +Ay2) A1=Ax1

14、+Ay1 A =KA2 A1=K(Ax2+Ay2) (Ax1+Ay1) =KAx2 Ax1(KEx2 Ex1)Cx=K Cx CZYQFX-UV( (二二) ) 数学变换法数学变换法零阶零阶一阶一阶二阶二阶三阶三阶四阶四阶1、导数光谱法、导数光谱法CZYQFX-UV导数光谱的定量方法导数光谱的定量方法p.p.峰谷法峰谷法 d.d.正切法正切法 z.z.峰峰- -零法零法CZYQFX-UV导数光谱法检定乙醇中痕量苯导数光谱法检定乙醇中痕量苯空白醇空白醇(1)(1)，醇中含苯，醇中含苯0.0001%(2)0.0001%(2)与与0.001%(3)0.001%(3)的吸收光谱的吸收光谱含苯含苯0.0

15、001%0.0001%醇液的二阶醇液的二阶(4)(4)与四阶与四阶(5)(5)导数光谱导数光谱CZYQFX-UV2 2、褶合光谱法、褶合光谱法(Convolution Spectrometry)(Convolution Spectrometry)I I 通过数学变换，把被掩盖的信息提取出来、构通过数学变换，把被掩盖的信息提取出来、构造造 新的独立光谱体系；新的独立光谱体系；II II 以新的光谱体系为基础建立定性定量方法；以新的光谱体系为基础建立定性定量方法；III III 改造现有的分光光度计，向分光光度计智能化、改造现有的分光光度计，向分光光度计智能化、自动化及多功能化发展。自动化及多功能

16、化发展。CZYQFX-UV051015202530354000.10.20.30.40.50.60.7Convolution trasformationOriginal spectrumOriginal spectrumConvolution spectraConvolution spectraCZYQFX-UV吸收光谱：吸收光谱：A = ECl A = ECl 褶合光谱：褶合光谱：Q Q = Q= QijijClCl CZYQFX-UV四、分析条件的选择四、分析条件的选择显色条件的选择显色条件的选择-比色法比色法 显色剂及其用量、溶液的酸度、温度、显色剂及其用量、溶液的酸度、温度、 显色时间

17、、参比溶液等的选择。显色时间、参比溶液等的选择。测量条件的选择测量条件的选择入射光波长、吸光度范围的选择。入射光波长、吸光度范围的选择。参比溶液的选择参比溶液的选择溶剂参比溶液、试样参比溶液、试剂参比溶液、溶剂参比溶液、试样参比溶液、试剂参比溶液、平行操作参比溶液的选择。平行操作参比溶液的选择。CZYQFX-UVElectronic transitionsElectronic transitionsanti-bondinganti-bonding* * *n n* *n n* * n * *anti-bondinganti-bondingbondingbondingnon-bondingnon

18、-bondingbondingbondingE E五、紫外吸收光谱与有机分子的结构关系五、紫外吸收光谱与有机分子的结构关系电子能级及跃迁类型电子能级及跃迁类型CZYQFX-UV跃迁类型跃迁类型 吸收峰波长吸收峰波长 基团基团 紫外吸收紫外吸收 强度强度 150nm 饱和烃C-C、 C-H n 200nm 杂原子单键-OH、末端吸收末端吸收 E=150 -NH2 200nm附近 不饱和键 C=C 有 E104 CC n 200-400nm 含杂原子的不饱 有 E=10-30 和键 C=O、C=N跃迁类型跃迁类型CZYQFX-UV1、生色团与助色团生色团与助色团 能吸收紫外、可见光的原子或原子团为

19、生色团。能吸收紫外、可见光的原子或原子团为生色团。CZYQFX-UV 名称名称 基团基团 跃迁类型跃迁类型 特点特点生色团生色团 C=C、C=O 紫外紫外-可见区有吸收可见区有吸收 -N=N-、C=S n 助色团助色团 -OH、-NH2 n 紫外区有末端吸收紫外区有末端吸收 -OR、-SH、-Cl 可使饱和烃吸收峰长移可使饱和烃吸收峰长移红移（长移）红移（长移）：吸收峰向长波段移动。吸收峰向长波段移动。 原因：结构改变（加入助色团、共轭作用）改变溶原因：结构改变（加入助色团、共轭作用）改变溶剂蓝移（短移）：蓝移（短移）：吸收峰向短波段移动吸收峰向短波段移动。 原因：共轭作用减弱、失去助色团、改

20、变溶剂原因：共轭作用减弱、失去助色团、改变溶剂。 增色效应（浓色效应）：增色效应（浓色效应）：由于结构改变或其他原因使吸收强度（E）增加的现象。强带和弱带强带和弱带(strong band & weak band)：摩尔吸光系数值大于摩尔吸光系数值大于104的吸收峰称为强带；的吸收峰称为强带；小于小于102的吸收峰称为弱带。的吸收峰称为弱带。CZYQFX-UV吸收带符号吸收带符号 跃迁类型跃迁类型 波长波长 吸收强度吸收强度 其他特征其他特征 R n 250500 100 溶剂极性增加，蓝移溶剂极性增加，蓝移 K 210250 104 共轭双键增加，红移共轭双键增加，红移 B 芳香族芳香族cc

21、骨架骨架 230270 200 蒸气状态出现蒸气状态出现 振动及环内振动及环内 精细结构精细结构 E 苯环内苯环内 180（E1) 104 助色团取代红移助色团取代红移 共轭共轭 200 （E2) 103 生色团取代，生色团取代， 与与K带合并带合并 CZYQFX-UVCH3CCH2CHCHCHCH2OR R带带K K带带CZYQFX-UV 影响吸收带的因素影响吸收带的因素位阻影响位阻影响HHCCCCHH顺式顺式二苯乙烯二苯乙烯 max max 280nm (10500)280nm (10500) 反式反式二苯乙烯二苯乙烯 max max 295.5nm (29000)295.5nm (290

22、00)CZYQFX-UV二苯乙烯顺反异构体二苯乙烯顺反异构体的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱溶剂效应溶剂效应pH的影响的影响跨环效应跨环效应CZYQFX-UV2、有机化合物的紫外吸收光谱、有机化合物的紫外吸收光谱 饱和烃饱和烃（紫外吸收光谱中的溶剂） 只有电子，只能发生 跃迁，所需能量大，吸收峰在真空区，在200-400nm无吸收。 含孤立助色团的饱和化合物含孤立助色团的饱和化合物 （n ） 例如：-Cl、-I、-Br、-OH、-NH2。 本身在紫外区无吸收，但能使生色团吸收峰红移且吸收强度增大，孤对电子n越多，助色能力越强。 CZYQFX-UV含有杂原子的饱和化合物的吸收峰含有杂原子的饱和化合物

23、的吸收峰助色团助色团 化合物化合物 溶剂溶剂 跃迁跃迁 maxmax（nmnm） - CH- CH4 4 - - 150nm -150nm - -Cl-Cl CH CH3 3Cl Cl 正己烷正己烷 n n 173 200 173 200 -OH CH-OH CH3 3OH OH 正己烷正己烷 n n 177 200 177 200 -SH CH-SH CH3 3SH SH 乙醇乙醇 n n 195 1400 195 1400 -NH2 CH-NH2 CH3 3NHNH2 2 乙醇乙醇 n n 215 600 215 600含孤立生色团的化合物含孤立生色团的化合物（ ，n n ） 在紫外区有吸

24、收。孤立的双键（在紫外区有吸收。孤立的双键（ 吸收峰在吸收峰在160-160-180nm-180nm）；n n 的跃迁吸收峰在的跃迁吸收峰在190nm190nm左右；左右； n n 吸收峰在吸收峰在275-295nm275-295nm之间之间。CZYQFX-UV一些孤立生色团的最大吸收峰一些孤立生色团的最大吸收峰生色团生色团 化合物化合物 溶剂溶剂 maxmax（nmnm） maxmax CC 乙烯 - 171 10000CC 乙炔 - 173 6000CO 乙醛 - 289 12.5 160 20000 182 10000CZYQFX-UV共轭烯烃共轭烯烃 共轭体系越大，吸收峰位越大，共轭体系越大，吸收峰位越大，越大。越大。化合物化合物 双键数双键数 maxmax（nmnm）max max 颜色颜色乙烯 1 165 10000 无1，3-丁二烯 2 217 21000 无1，3，5-己三烯 3 258 35000 无二甲基辛四烯 4 296 52000 无葵五烯 5 335 118000 无2-羟基-胡萝卜素 8 415 210000 橙色橙色番茄红素 11 470 185000 红色红色多烯化合物的吸收峰多烯化合物的吸收峰CZYQFX-UV3