重组体的选择与鉴定1

1、转化子：转化子：在在DNA分子克隆中，通常将导入外分子克隆中，通常将导入外 源源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子；转化子；重组体：重组体：含有重组含有重组DNA分子的转化子；分子的转化子；目的重组体：目的重组体：含有外源目的基因的重组体。含有外源目的基因的重组体。 在转化反应中,并非所有的细胞中都转入重组DNA分子,即使所有的受体细胞都变为转化体,所获得的转化子仍是多种类型的DNA分子,因为在连接反应中会有以下几种情况发生:载体和一个或数个串联目的基因连接载体和一个或数个串联目的基因连接载体发生自连载体发生自连目的目的DNADNA分子发生自连分子发生自连

2、未发生连接反应的载体和目的未发生连接反应的载体和目的DNADNA片段片段 因此,在成千上万个转化子中，真正含有期望的重组DNA分子的比例很少，为了将含有外源DNA的宿主细胞和不含外源DNA的宿主细胞分开，以及将含有正确重组子的宿主细胞和含有其他外源DNA的宿主细胞分开，就需要设计出最易于筛选重组子的方案并加以验证。直接选择法直接选择法抗药性筛选 -半乳糖苷酶显色法间接选择法间接选择法快速裂解菌落鉴定分子大小限制性内切酶酶切法PCR法菌落杂交筛选依赖于遗传表型的选择法抗药性筛选-半乳糖苷酶显色法 分类：（1）抗药性基因不失活（2）抗药性基因失活常用的抗药性选择标记： 氨苄青霉素（Amp）、氯霉素

3、（Cm） 卡那霉素（Kan）、四环素（Tet或Tc） 链霉素（Sm或Str）基本原理： 外源基因片段外源基因片段插入载体的位点在抗药性在抗药性基之外基之外， 不导致抗药性基因的失活，仍能编仍能编码抗药性基因产物码抗药性基因产物。含有这种重组子的转化细胞可以在含有相应抗生素的琼脂平板上生长成菌落，未能接受载体DNA的细胞因不能 生长而被排除。l 实验步骤：（1）培养基中加入千分之一的抗性药物，再倒平板；（2）将转化后的菌液均匀涂布在平板上；（3）放在37培养箱培养1216小时；（4）观察菌落生长情况。基本原理： 如果外源基因片段外源基因片段插入载体的位点在抗药性基因中中 间间，导致抗药性基因失活

4、抗药性基因失活，这个抗药性标志就会失活。检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插入失活效插入失活效应应 。l 例如： 非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨四环素和氨苄青霉素苄青霉素抗性基因都是正常的。带有这种质粒的受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性双抗性平板上生长平板上生长。但是, 如果在该质粒的氨苄青霉素抗性基因内插入外源片段外源片段, 就会造成氨苄青霉素抗性氨苄青霉素抗性基因失活基因失活, 携带这种质粒的宿主菌可以在四环素的在四环素的平板上生长平板上生长, 而不能在氨苄青霉素抗性平板上生不能在氨苄青霉素抗性平板上生长长。 l注意事项：（1）以Amp、Tc等抗生素作为选择药

5、物时， 37培养时间约1216h，超过时间视为杂菌（假转化子菌落）。（2）挑选单菌落作为转化子以便进一步实验 验证。挑的菌落在培养基中震荡培养。l 基本原理： 许多质粒载体具有-半乳糖苷酶显色反应的检测功能。 当外源DNA插入到它的lacZ基因（编码-半乳糖苷酶）上时，可造成-半乳糖苷酶的失活，就可通过大肠杆菌转化子菌落在添加X-gal-IPTG培养基中的颜色变化鉴别出重组子和非重组子。（X-gal是-半乳糖苷酶的显色底物）l 举例：举例：l pUCpUC质粒质粒：带有：带有- -半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZlacZ）的调控序）的调控序列列和和- -半乳糖苷酶半乳糖苷酶N N端端1

6、46146个氨基酸的编码序列个氨基酸的编码序列。这个。这个编码区中插入了一个多种限制性核酸酶单一识别位点编码区中插入了一个多种限制性核酸酶单一识别位点的多克隆位点，但并的多克隆位点，但并没有破坏没有破坏lacZlacZ的阅读框架。的阅读框架。l 大肠杆菌菌株：大肠杆菌菌株：带有带有- -半乳糖苷酶半乳糖苷酶C C端部分序列的端部分序列的编码信息。编码信息。l 在各自独立的情况下，在各自独立的情况下，pUCpUC质粒和大肠杆菌编码的质粒和大肠杆菌编码的- -半乳糖苷酶片段都没有活性。半乳糖苷酶片段都没有活性。 当质粒转化大肠杆菌后,可形成具有酶活性的蛋白质,它在生色底物X-gal的存在下被IPT

7、G(异丙基-D-硫代半乳糖苷）诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pUC质粒的多克隆位点上后，则会导致读码框架改变，表达蛋白失活，因此，在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。因此，根据这种-半乳糖苷酶的显色反应，可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。l 注意事项：（1）由于被转化的基因产物作用于X-gal需要较长 时间，因此，观察和确定转化子菌落的培养时间可适当延长。与37温箱取出后放4 冰箱几小时后观察效果更好；（2）为了防止假阳性需挑菌进一步验证。依赖于重组子结构特征分析的筛选法依赖于重组子结构特征分析的筛选法快速裂解菌落鉴定分子大小限制性内切酶酶切法PCR法菌

8、落杂交筛选l 基本原理： 由于外源片段插入的重组质粒与载体大小不同，故可以利用琼脂糖凝胶电泳将重组体分离出来。l 优点优点：直观快捷，适用于插入片段较大的重组子的筛选。l 缺点缺点：不能鉴别插入片段大小相近的非目的基因片段。l 基本原理： 根据已知的外源DNA序列的限制酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA的带数和长度）。或用合适的内切酶酶切插入片段，再用其它酶酶切这个片段，电泳后比较电泳结果是否符合预计的结果。l 基本原理： 在载体DNA分子中，外源DNA插入位点两侧的序列多为已知，通过与插入位点两侧已知序列互补的引物，从单克隆中提取少量质粒DNA作为模板进行PCR扩

9、增，琼脂糖凝胶电泳分析确定是否为重组子。l 注意事项： 如需检测插入片段及其方向，则使用载体特异引物和方向插入特异引物或互换。 如只需确认是否存在插入片段，可用2个插入片段特异引物。 扩增反应前在94变性两分钟，有利于细菌的裂解，提高PCR产物扩增的成功。l 主要原理主要原理 用体外标记基因DNA或相应的RNA为探针同转化后的菌落进行原位杂交原位杂交，筛选含重组DNA的克隆。这个方法可以快速地从数百个菌落中挑选出含有重组DNA的克隆。 该方法的优点是通用性比较强优点是通用性比较强，可以用来检测任何一种插入的DNA序列。这种方法依据的是核酸分子核酸分子杂交的原理杂交的原理，而不以插入的DNA序列能否实现基因表达为前提，因此，只要有