生物信息学作业

1、山东大学生物信息学作业Pfu DNA聚合酶的高保真性和耐热性的生物信息学分析姓 名 学 号 学 院 生命科学学院 专 业 生命基地班 年 级 2011级 2013/12/1Pfu DNA聚合酶的高保真性和耐热性的生物信息学分析1.引言Pfu DNA聚合酶，又称Pfu聚合酶或Pfu酶，是在嗜热的焦热球菌中发现的。它是一类能在活体内进行DNA复制的酶。在聚合酶链式反应（PCR）中，使用Pfu聚合酶可以快速的、高保真的扩增DNA片段。Pfu酶不仅具有耐热性而且具有高保真性，商业化的Pfu聚合酶试剂，其出错率是100万到130万个碱基对出现一个错配，在PCR反应中，每扩增1kb的DNA片段会产生2.6

2、%的突变产物，其保真性强于Taq聚合酶，已经渐渐取代了Taq酶在PCR反应中的作用。因此，我想运用生物信息学的方法探究Pfu酶的高保真性和耐热性，以及其相对于Taq酶在PCR技术中的优势。2.背景聚合酶链式反应(PCR) 是一种能在体外快速扩增特定DNA 片段的技术，是在由DNA 模板、引物（一般有上、下游两种引物）、四种dNTP以及适当缓冲液等组成的反应混合物中，在DNA聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的DNA 片断进行扩增的反应。在这一反应体系中，DNA 聚合酶起着关键性作用，所以自PCR 技术产生至今，人们一直在通过各种手段努力寻找能够高效特异地催化单核苷酸聚合的DNA 聚合酶。

3、Taq 酶是第一个被应用于PCR 的高热稳定DNA聚合酶，也是活性最高的一种具有耐热性的DNA 聚合酶，不仅具有5-3聚合酶和5-3外切酶活性，同时还存在非模板依赖性活性，但缺乏3-5外切酶活性，所以在DNA 合成过程中对单核苷酸错配没有校正功能，每一循环错配率高达2X10-4个核苷酸碱基，不能很好地保证PCR 产物的保真性。并且对于小片段PCR扩增 Taq DNA 聚合酶尚可以，但对于大片段的片段(6kb以上的片段) 就无法完成。近年来利用基因工程方法已经获得了缺少5-3外切核酸酶活性和具有3-5外切核酸酶活性的Taq 酶，从而拓宽了Taq 酶的应用范围。由于Taq DNA聚合酶的发现，PC

4、R 技术才真正得以推广和应用。但是人们也在一直不断地寻找酶学性能好、保真度高的PCR 用DNA 聚合酶。因此，继Taq DNA聚合酶之后，人们又陆续发现了Vent1 、Deep 、Pfu、Tgo 和KOD1 等不仅耐热性好且有校正功能的DNA 聚合酶。其中，Pfu DNA 聚合酶是从嗜热的古细菌焦热球菌（Pyrococcus furiosus）中获得，因其超强的纠错功能等特性受到了极大的关注。该酶为2 个蛋白亚基(P45 和P50) 的多聚体，含775 个氨基酸，分子量为90KD。Pfu DNA 聚合酶热稳定性极强，有5-3聚合酶活性和3-5外切核酸酶活性，所以在催化聚合反应的同时可纠正聚合反

5、应过程中的错误掺入。Pfu 酶的错配率比其它校正酶低260 倍，比Taq DNA 聚合酶低6100倍，因而显示出极高的保真度，所以与其它的聚合酶相比，其PCR产物的错配率大大降低，特别是进行2kb 以内的DNA 片段的扩增, 效果甚佳。3.分析资源数据库：RCSB PDB数据库、NCBI数据库、Inter Pro数据库等分析软件：PyMOL三维结构显示软件4.数据库分析4.1 利用RCSB PDB数据库获得Pfu基本信息4.1.1 获得Pfu酶的结构（1）首先打开PDB数据库的首页并按如下操作：（2）选取如下条目：（3）得到如下页面：（4）得到Pfu聚合酶的结构图（5）得到pfu聚合酶的结构图

6、：4.1.2 获得Pfu酶的氨基酸序列（1）按图进行操作：（2）按图进行操作下载氨基酸序列：即得到以下序列：MILDVDYITEEGKPVIRLFKKENGKFKIEHDRTFRPYIYALLRDDSKIEEVKKITGERHGKIVRIVDVEKVEKKFLGKPITVWKLYLEHPQDVPTLREKVREHPAVVDIFEYDIPFAKRYLIDKGLIPMEGEEELKILAFDIETLYHEGEEFGKGPIIMISYADENEARVITWKNIDLPYVESVSTEKEMIKRFLRIIREKDPDIIVTYNGDSFDFPYLAKRAEKLGIKLTIGRDGSEPKMQRIGD

7、MTAVEVKGRIHFDLYHVIRTTINLPTYTLEAVYEAIFGKPKEKVYADEIAKAWESGENLERVAKYSMEDAKATYELGKEFLPMEIQLSRLVGQPLWDVSRSSTGNLVEWFLLRKAYERNEVAPNKPSEEEYQRRLRESYTGGFVKEPEKGLWENIVYLDYKSLYPSIIITHNVSPDTLNLEGCKNYDIAPQVGHKFCKDIPGFIPSLLGHLLEERQKIKTKMKETQDPIEKILLDYRQKAIKLLANSFYGYYGYAKARWYCKECAESVTAWGRKYIELVWKELEEKFGFKVLYIDTDGLY

8、ATIPGGESEEIKKKALEFVKYINSKLPGLLELEYEGFYKRGFFVTKKRYAVIDEEGKVITRGLEIVRRDWSEIAKETQARVLETILKHGDVEEAVRIVKEVIQKLANYEIPPEKLAIYEQITRPLHEYKAIGPHVAVAKKLAAKGVKIKPGMVIGYIVLRGDGPISNRAILAEEYDPKKHKYDAEYYIENQVLPAVLRILEGFGYRKEDLRYQKTRQVGLTSWLNIKKS（3）按照如下操作：（4）得到氨基酸序列图如下：（5）在sequence标签下可看到Pfu聚合酶的氨基酸序列结构图：4.2 Pfu酶的高保真性

9、分析4.2.1 利用Inter Pro数据库分析Pfu酶的结构域以及蛋白质特性（1）进入Inter Pro数据库并按图操作：（2）得到如下分析图：（3）从图中可以看出在这段序列中包含DNA聚合酶（Family B）结构域，其具有3-5外切酶活性，因此，在PCR扩增过程中，如果发生碱基错配，错配的碱基会立即被3-5外切酶移除，之后正确的碱基才会被加上。这一过程被称作proofreading（校对）。在此过程中，错配的碱基会减慢DNA聚合酶的催化进程并破坏Palm结构域中的非共价键。接着错配的碱基会在3-5外切酶活性位点被移除，之后DNA链继续合成。（4）通过序列分析，可以得到结论：DNA聚合酶（

10、Family B）结构域是由21-128号残基序列以及130-278号残基序列组成的；palm结构域的残基序列是363-417和507-623。如下图：4.2.2 利用PyMOL软件作图（1）在PDB数据库中可找到Pfu酶的编号是2JGU，用PyMOL下载蛋白结构图；（2）将Pfu酶结构显示为cartoon模式，并设置surface调节透明度为0.4；（3）利用3.2.1中已知的残基序列找出Pfu酶中的DNA聚合酶（Family B）结构域以及palm结构域，并将21-128残基序列颜色设置为Blue，130-278残基序列颜色设置为cyan，两段palm域残基序列颜色均设置为red，其余部分

11、为yellow；（4）调节Pfu酶结构观察角度，设置背景颜色（白）并保存图片（具体操作步骤不一一截图展示）；（5）得到以下结果：（6）按条目（3）中的描述可以所得到的图相匹配4.2.3 与Taq酶氨基酸序列分析进行对比（1）按照3.1.2的步骤找到Taq酶的氨基酸的序列，如下：MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGY

12、LITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSL

13、EVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLM

14、KLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE（2）按照3.2.1的步骤得到Taq酶的氨基酸的序列分析图：（3）从上图中很明显的可以看出Taq酶具有DNA polymerase（Family A）酶活性位点，并且具有5-3酶活性，而不具有3-5酶活性。因此，相比于Taq酶而言，Pfu聚合酶具有更低的错配率，使得PCR扩增产物具有高保真性。4.3 Pfu酶的耐热性分析4.3.1蛋白质一级结构的热稳定性分析：（1）统计各氨基酸的含量：表1. Pfu酶中各类氨基酸含量统计表中文名称英文名称缩写短写个数含量

15、（%）丙氨酸AlanineAlaA435.5苯丙氨酸PhenylalaninePheF263.4半胱氨酸CysteineCysC40.5天冬氨酸Aspartic acid / AspartateAspD384.9天冬酰胺AsparagineAsnN192.5谷氨酸Glutamic acid / GlutamateGluE8811.4谷氨酰胺GlutamineGlnQ151.9甘氨酸GlycineGlyG506.5组氨酸HistidineHisH141.8亮氨酸LeucineLeuL688.8异亮氨酸IsoleucineIleI709.0赖氨酸LysineLysK8310.7甲硫氨酸Methio

16、nineMetM101.3脯氨酸ProlineProP364.6精氨酸ArginineArgR445.7丝氨酸SerineSerS263.4苏氨酸ThreonineThrT324.1缬氨酸ValineValV516.6色氨酸TryptophanTrpW111.4酪氨酸TyrosineTyrY476.1（2）选取一个较为有代表性的常温酶（T4 聚合酶）进行相应的统计：表2. 常温酶（T4聚合酶）中各氨基酸含量统计表中文名称英文名称缩写短写个数含量（%）丙氨酸AlanineAlaA164.1苯丙氨酸PhenylalaninePheF194.9半胱氨酸CysteineCysC41.0天冬氨酸Aspa

17、rtic acid / AspartateAspD328.2天冬酰胺AsparagineAsnN174.3谷氨酸Glutamic acid / GlutamateGluE297.5谷氨酰胺GlutamineGlnQ102.6甘氨酸GlycineGlyG225.7组氨酸HistidineHisH61.5亮氨酸LeucineLeuL246.2异亮氨酸IsoleucineIleI348.8赖氨酸LysineLysK338.5甲硫氨酸MethionineMetM184.6脯氨酸ProlineProP164.1精氨酸ArginineArgR194.9丝氨酸SerineSerS277.0苏氨酸Threon

18、ineThrT112.8缬氨酸ValineValV225.7色氨酸TryptophanTrpW51.3酪氨酸TyrosineTyrY246.2（3）根据以上两个表的结果分析：对比二者的蛋白质一级结构中对蛋白质耐热性有影响的的氨基酸含量后，可以很容易的发现通耐热性酶Pfu酶中Ala（A）、Pro（P）、Arg（R）、Glu（E）的含量均高于常温菌，尤其是Glu（E）的含量，高出了将尽4%的含量；根据资料显示，Ala（A）有利于螺旋结构的形成；Pro（P）由于其结构熵比其它氨基酸小因而更易折叠，且一旦折叠则需要很高的能量才能解折叠，这样在不影响其高级结构的前提下，Pro 的替代可以提高整个蛋白质分

19、子的热稳定性，也就是说，在其他条件相同的情况下，破坏Pro（P）含量高的酶所需要的能量比Pro（P）含量低的酶要高，即需要较高的温度；Arg（R）和Glu（E）分别比带同种电荷的氨基酸有更大的侧链，侧链所提供的疏水作用及离子间相互作用有助于提高蛋白质的热稳定性。相比之下，Asn（N）、Gln（Q）、Cys（C）、Trp（W）的含量显著低于常温菌。这是由于在高温下蛋白质中Asn 和Gln 的脱氨作用，Cys 和Trp 的氧化降解作用导致非酶促不可逆反应（不可逆修饰），造成酶失活，所以这些不稳定氨基酸在嗜热酶中出现频率较低。但由于在螺旋排布中，有C支链的氨基酸（Val、Ile、Thr）产生较大的构

20、象张力，可能会造成热不稳定因素，但是在这2者比较中，这3种氨基酸的含量都高于常温酶，这可能是由于3-5酶活性位点影响的，因此没有出现资料中所显示的现象。4.3.2蛋白质二级结构的热稳定性分析：（1）与常温酶相比，耐热性酶更倾向于形成较长的-螺旋结构和较短的表面环；并通过一系列疏水作用、氢键、离子键等非共价力的共同作用，使亚基之间发生相互作用形成寡聚体，表面环被锚定在相同或其它亚基的相邻区域，蛋白质的氨基端与羧基端包埋于疏水口袋中或形成彼此相互交织的结构，这些变化促进了嗜热酶的二级结构间和结构域间的相互作用，增加了蛋白质的紧密性而减少了其柔性，防止升温引起的终端区解链，在酶的高级结构的稳定性上起

21、重要作用。由上图可见，在Pfu酶的结构中含有较多的较长的-螺旋（绿色的方框内）和较短的表面环（蓝色的小方框内），因此，Pfu酶相比于常温酶来说具有较高的耐热性。（2）与Taq酶相比较，Taq酶具有更多的-螺旋和较短的表面环，因此，Pfu酶的耐热性相比于Taq酶而言较差。这两者的差异可能是Pfu酶的3-5核酸外切酶活性的干扰。此外，Pfu酶的延伸速率比Taq酶抵，其原因也是由于酶本身较低的聚合效率和来自于3-5核酸外切酶活性的干扰; 对于长距离模板的扩增尚不能很好地实现，主要原因是由不能及时纠正或难于纠正的错配引发的“关闭”DNA 聚合反应。4.3.3 环境因素对耐热性的影响一些环境因素，比如离

22、子浓度会提高酶的耐热性。与其它离子相比，K + 、NH 4+、Ca2 + 、SO42-、HPO42 -通过影响水分子作用，和相邻残基形成离子键、配位键起到类似二硫键的桥连作用，从而稳定酶分子的三维结构。某些底物分子也可以通过稳定酶分子的活性位点来使其适应高温环境，这些可通过生物化学的方法进行验证，在此将不作分析。5. 总结与反思PCR技术在分子生物学实验中占据着举足轻重的地位，我们的平时实验中几乎都不会离开这一高效的体外扩增技术。因此，PCR技术中所用的酶的性能可能会直接或间接地影响到最后实验的成功与否。Pfu酶已经渐渐取代了Taq酶在PCR中的作用已经是大家公认的事实，这源于Pfu酶的高保真

23、性，通过这次我自己的生物信息学分析，我也已经自己验证了其DNA polymerase（Family B）结构域的存在，也就是说Pfu酶上不仅存在有5-3聚合酶活性而且也存在有3-5外切核酸酶活性，而就是这一点会大大增加扩增产物的准确性，这样会使实验结果更为准确并更有说服力。但Pfu酶也存在自身的缺陷，通过生物信息学分析，我也发Pfu酶的耐热性和催化效率较Taq酶低，这也可能与其具有3-5外切核酸酶活性位点有关，因此，也有人提出可以将Pfu酶和Taq酶混合使用的观点。另一方面，现在也已经生产出了Fast Pfu DNA polymerse ，起催化效率比起Pfu酶有较大的提高。所以，我认为提高PCR酶活性还需要我们进一步的提取纯化新的高性能的酶，或者是在现有的酶的基础上对其进行分子改造，使其在保证较高耐热性和保真性的基础上，获得更高的催化效率。6.参考文献1 吴穗洁，吴文林，刘 斌. 嗜热酶耐热机制及提高酶热稳定性的研究进展. 亚热带农业研究(Subtropical agriculture research).2006. 第2 卷 第4 期2 石宣明，刘淑珍，黄玉碧. 嗜热酶耐热机制的研究进展. 科学技术与工(Science Technology and Engineering).2004.第四卷