RT-PCR及其产物电泳分析20161101

1、RT-PCR及其产物电泳分析及其产物电泳分析 中南大学中南大学生命科学学院生命科学学院q熟悉熟悉RT反应的原理；掌握反应的原理；掌握RT反应的操作步骤反应的操作步骤q熟悉熟悉PCR反应的原理反应的原理q掌握掌握PCR反应的操作步骤以及反应的操作步骤以及PCR反应参数反应参数的选择与优化的选择与优化q掌握掌握PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测方法产物的琼脂糖凝胶电泳检测方法RT反应反应：在逆转录酶作用下，以：在逆转录酶作用下，以mRNA为模板合为模板合成成cDNA（complementary DNA）分子的过程。）分子的过程。 PCR反应反应：PCR扩增是模拟天然扩增是模拟天然DNA复制过程，复制过

2、程，利用利用DNA聚合酶在体外扩增一对引物之间特异性聚合酶在体外扩增一对引物之间特异性DNA片段的方法。其主要热循环过程可分为三个片段的方法。其主要热循环过程可分为三个步骤：（步骤：（1）变性；（）变性；（2）退火；（）退火；（3）延伸）延伸 。RT-PCR: 以以RT反应产物反应产物cDNA分子为模板进行特分子为模板进行特异性异性PCR扩增的过程，是检测基因表达最常用的扩增的过程，是检测基因表达最常用的方法。方法。（1）引物引物： Oligo(dT)16，寡聚胸甘酸，寡聚胸甘酸16个，要求个，要求mRNA有有poly(A)尾巴（尾巴（mRNA 1-4%）（2）逆转录酶逆转录酶 ： 鼠白血病病

3、毒莫洛尼株鼠白血病病毒莫洛尼株 （MMLV）、）、鸟类成髓细胞瘤病毒（鸟类成髓细胞瘤病毒（AMV ）（3）RT反应缓冲液反应缓冲液：常用：常用5浓度。浓度。（4）底物底物：即四种：即四种dNTP的混合物溶液，常用的混合物溶液，常用10浓度浓度（2 mmol/L或或2.5 mmol/L）。）。（5 5）模板模板（6）RNasin（1）引物引物：一对，单链的：一对，单链的10-30nt长的长的DNA片段。片段。（2）Taq DNA聚合酶聚合酶（3）PCR反应缓冲液反应缓冲液：常用：常用10浓度，一般组成浓度，一般组成为为15mmol/L MgCl2、250mmol/L KCl等。等。（4）底物底物

4、：即四种：即四种dNTP的混合物溶液，常用的混合物溶液，常用10浓度（浓度（2 mmol/L或或2.5 mmol/L）。）。（5 5）模板模板6RT-PCR原理原理微量移液器微量移液器台式微量离心机台式微量离心机 电泳槽电泳槽凝胶成像系统凝胶成像系统 电泳仪电泳仪 热循环仪热循环仪（1）标记一个洁净的）标记一个洁净的1.5mL反应管，向其中依次加入：反应管，向其中依次加入： RNA溶液溶液 5 L RT mix 15 L 20 L （2）盖紧管盖，轻轻混匀后，离心）盖紧管盖，轻轻混匀后，离心 30 s，使反应成份均，使反应成份均匀富集于管底。匀富集于管底。（3）42 水浴水浴30 min 。R

5、T mix的成分的成分：RNasin、5RT反应缓冲液、反应缓冲液、2.5mM dNTPs、Oligo(dT)16、逆转录酶、逆转录酶(MMLV) （4）标记一个洁净的）标记一个洁净的200L反应管，向其中依次加入：反应管，向其中依次加入：ddH2O 6 L2PCR mix 10 LPrimer mix 2 LcDNA模板模板 2 L 20 L（5）混合均匀后，离心）混合均匀后，离心30S，使反应成份均匀富集于管底。，使反应成份均匀富集于管底。PCR mix的成分的成分：PCR反应缓冲液、反应缓冲液、2.5 mM dNTPs、Taq DNA聚合酶聚合酶（6）在）在PCR仪上设置反应循环参数仪上

6、设置反应循环参数: 本次实验为：本次实验为：94 20 s，56 20 s，72 20 s，循环数，循环数为为26，最后于，最后于72 充分延伸充分延伸5 min后，终止反应。后，终止反应。（7）置反应管于）置反应管于PCR仪上进行热循环。仪上进行热循环。（8）反应完毕后，取）反应完毕后，取5 LPCR产物，于产物，于1.5 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳检测结果。检测结果。1. 戴手套操作，避免污染。戴手套操作，避免污染。2. 尽量冰上操作。尽量冰上操作。3. 取样准确，体系正确。取样准确，体系正确。4. 一定要有内参。一定要有内参。 PCR扩增有限性扩增有限性-平台期平台期 经过一定数量的循

7、环后，随着产物的对数累积经过一定数量的循环后，随着产物的对数累积趋于饱和，趋于饱和，DNA分子数分子数不再呈指数积累不再呈指数积累，而是进入，而是进入线性增长期或静止期线性增长期或静止期，此过程称为平台效应。，此过程称为平台效应。PCR的离子需要的离子需要 Taq酶活性对酶活性对Mg2+浓度和单价离子（浓度和单价离子（K+或或NH4+）的性质和浓度较敏感。的性质和浓度较敏感。 一般一般PCR反应中反应中MgCl2浓度在浓度在2.0mmol/L时酶活时酶活性最高，性最高，Mg2+浓度偏高，酶活性反受抑制。浓度偏高，酶活性反受抑制。 变性剂的加入有助于模板变性，消除复杂二级结变性剂的加入有助于模板

8、变性，消除复杂二级结构，但不同变性剂及浓度对酶活性损害程度不同。构，但不同变性剂及浓度对酶活性损害程度不同。PCR引物用量引物用量 一般一般PCR反应引物的终浓度为反应引物的终浓度为0.21mol/L，在此范围内，在此范围内，PCR产物量基本相同。产物量基本相同。 但引物低于但引物低于0.2 mol/L时，则产量降低。时，则产量降低。 引物浓度过高会促进引物错误引导非特异产物引物浓度过高会促进引物错误引导非特异产物合成，还会增加合成，还会增加引物二聚体引物二聚体的形成。的形成。M 1 2 3 M：100bp 梯级梯级DNA分子量标志物；分子量标志物；泳道泳道1：阳性对照；：阳性对照；泳道泳道2

9、：靶：靶DNA扩增；扩增；泳道泳道3：阴性对照：阴性对照图图1 PCR产物检测的琼脂糖凝胶电泳产物检测的琼脂糖凝胶电泳观察结果：观察结果： 是否有扩增产物。是否有扩增产物。如有拖尾或有几条区带如有拖尾或有几条区带, ,说明有非特说明有非特异性扩增。异性扩增。分子量标准电泳后区带是否分开。分子量标准电泳后区带是否分开。与分子量标准比较，与分子量标准比较，PCRPCR产物的长度产物的长度是否正确。是否正确。PCRPCR产物的产量。产物的产量。引物二聚体。引物二聚体。RT-PCR检测人检测人-actin基因表达（基因表达（扩增产物长度扩增产物长度 260 bp） 无无PCR产物产物 1. 确保确保m

10、RNA无降解。无降解。 2. 确保酶未失活。确保酶未失活。 3. 确保引物无降解。确保引物无降解。 4. 重新设置退火温度。重新设置退火温度。 5. 重新设置变性温度。重新设置变性温度。 PCR产物呈拖尾现象产物呈拖尾现象 1. 提高退火温度。提高退火温度。 2. 减少减少Taq DNA聚合酶的用量。聚合酶的用量。 3. 试用二步法进行试用二步法进行PCR扩增。扩增。 4.调节调节Mg2+浓度，使之最优化。浓度，使之最优化。Taq DNA聚合酶发挥活性需要聚合酶发挥活性需要Mg2+参与，通过参与，通过Mg2+介导与模板介导与模板DNA、引物及、引物及dNTP结合。结合。通常通常Mg2+浓度为浓

11、度为0.52.5mM，Mg2+浓度过高，将引起非特异浓度过高，将引起非特异扩增产物增多；反之，扩增产物增多；反之，Mg2+浓度过低则导致产量降低。浓度过低则导致产量降低。 5. 减少延伸时间。减少延伸时间。 6. 减少循环次数。减少循环次数。 7. 设计新的引物。设计新的引物。 8.采用热启动法进行采用热启动法进行PCR。 引物二聚体引物二聚体 1. 防止引物防止引物3端互补。端互补。2. 设计较长的引物。设计较长的引物。3. 增大模板的量。增大模板的量。PCR产量随模板产量随模板DNA浓度的增加而显著升浓度的增加而显著升高，模板高，模板DNA浓度过高会导致非特异性产物增加。浓度过高会导致非特

12、异性产物增加。 4. 降低引物浓度。一般为降低引物浓度。一般为0.10.5M。引物浓度过高，将错误。引物浓度过高，将错误启动延伸（即错误引发），导致非特异性产物堆积，还可启动延伸（即错误引发），导致非特异性产物堆积，还可形成引物二聚体；引物浓度过低则可导致扩增产量下降。形成引物二聚体；引物浓度过低则可导致扩增产量下降。5. 减少循环次数。减少循环次数。6. 提高退火温度。提高退火温度。 PCR循环参数的优化循环参数的优化 变性变性 9595变性变性20203030秒即可使双链模板秒即可使双链模板DNADNA完全解链为完全解链为单链，变性温度过高和过低均会导致单链，变性温度过高和过低均会导致DN

13、ADNA聚合酶活性的丧失。聚合酶活性的丧失。 退火退火 引物与模板的退火温度有引物的长度及引物与模板的退火温度有引物的长度及GCGC含量决含量决定。退火温度由定。退火温度由TmTm值确定：值确定：TmTm4 4（G+CG+C）+2(A+T), +2(A+T), 退火温度退火温度比比TmTm低低3 31212。 延伸延伸 延伸温度取决于延伸温度取决于DNADNA聚合酶的最适温度（聚合酶的最适温度（70707575；延伸时间由扩增片段的长度决定（；延伸时间由扩增片段的长度决定（500bp 30s,500-1200bp 500bp 30s,500-1200bp 40s40s）。）。 循环次数循环次数 PCRPCR循环次数取决于模板循环次数取决于模板DNADNA的浓度，一般为的浓度，一般为25253535次，次，PCRPCR产物可达最大值。产物可达最大值。 PCR反应成分浓度的优化反应成分浓度的优化Taq DNA聚合酶：聚合酶：12.5U/100L反应液。反应液。 dNTP浓度：浓度：20200mol/L，且四种底物，且四种底物浓度相等，以减少错误掺入的机会。浓度相等，以减少错误掺入的机会。 Mg2+浓度浓度 ：0.52.5