双水相萃取课件

1、双水相萃取课件双水相萃取课件双水相萃取课件 利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。差异来进行萃取的方法。双水相萃取？双水相萃取？双水相萃取课件双水相萃取课件双水相萃取课件 双水相的形成双水相的形成p 将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值，体系会自然的分成互不相溶的两相，这就是双水相体系双水相体系。这种含有不同聚合物分子的溶液发生分相的现象叫聚合物的不相容性聚合物的不相容性。p 形成原因：由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二

2、相。双水相萃取课件常用的双水相体系常用的双水相体系 高聚物/高聚物体系：聚乙二醇(简称PEG) / 葡聚糖(简称Dextran) 高聚物/无机盐体系：硫酸盐体系。常见的高聚物/ 无机盐体系为: PEG/ 硫酸盐或磷酸盐体系。双水相萃取课件双水相系统双水相系统(aqueous two-phase system, ATPS) PEG = 聚已二醇(polyethylene glycol)Kpi = 磷酸钾DX = 葡聚糖(dextran)双水相萃取课件双水相萃取课件 双水相萃取的原理双水相萃取的原理 是生物物质在双水相体系中的选择性分配，当物是生物物质在双水相体系中的选择性分配，当物质进入双水相体

3、系后，由于表面性质、电荷作用质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种作用力（如憎水键、氢键和离子键等）的和各种作用力（如憎水键、氢键和离子键等）的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同，即分配系数不同。同，即分配系数不同。第一节第一节 双水相分离理论双水相分离理论双水相萃取课件双水相萃取课件双水相萃取课件双水相萃取课件双水相萃取课件双节线双节线：把均相区和两相区域分隔开：把均相区和两相区域分隔开。 系线系线：连接双节线上两点的直线。：连接双节线上两点的直线。 均相区均相区两相区两相区双水相萃取课件n在同一条系线上的各点分成的两相具有在同一

4、条系线上的各点分成的两相具有相同的组成相同的组成，但但体积比体积比不同不同临界点临界点：当系线长度趋向于零时，即在图中的：当系线长度趋向于零时，即在图中的C点，点，两相差别消失，任何溶质在两相中的分配系数均为两相差别消失，任何溶质在两相中的分配系数均为1，成为单相体系。，成为单相体系。双水相萃取课件ATPS相图相图双节线双节线(bi-nodal)：图中的曲线。双节线以下的区域为均相区,以上的区域为两相区，即ATPS 。 系线系线(tie line)：双节线上两点的直线。系线反映的信息系线反映的信息A 杠杆规则：杠杆规则：系线上各点均为分成组成相同，而体积不同的两相。两相体积近似服从杠杆规则B

5、性质差异性质差异：系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度,系线越长,两相间的性质差别越大；反之则越小.C 临界点临界点(critical point)：当系线长度趋于零时, 两相差别消失,任何溶质在两相中的分配系数均为1。如K点。 双水相萃取课件双水相萃取课件双水相萃取课件双水相萃取课件p对于对于PEG/Dextran所形成的双水相所形成的双水相体系中，若降低体系中，若降低PEG相对分子质量，相对分子质量，则生物分子分配于富含则生物分子分配于富含PEG的上相中，的上相中，使分配系数增大；而降低使分配系数增大；而降低Dextran相相对分子质量，则分配系数减小。对分子质量，则分配系数减小。p若想在

6、上相获得较高的蛋白质收率，若想在上相获得较高的蛋白质收率，对于对于PEG聚合物，应降低它的平均分聚合物，应降低它的平均分子量，相反，若想在下相获得较高的子量，相反，若想在下相获得较高的蛋白质收率，则平均分子量应增加。蛋白质收率，则平均分子量应增加。(1)成相聚合物的影响成相聚合物的影响A、成相聚合物分子量、成相聚合物分子量双水相萃取课件B、成相聚合物的浓度、成相聚合物的浓度 聚合物分相的最低浓度为临界点，系线的长度为聚合物分相的最低浓度为临界点，系线的长度为零，此时分配系数为零，此时分配系数为1，即组分均匀的分配于上，即组分均匀的分配于上下相下相. 随着成相聚合物的总浓度或聚合物随着成相聚合物

7、的总浓度或聚合物/盐混合物的总盐混合物的总浓度增大，系统远离临界点，系线长度增加，两浓度增大，系统远离临界点，系线长度增加，两相性质的差别相性质的差别(疏水性等疏水性等)增大，蛋白质分子的分增大，蛋白质分子的分配系数将偏离临界点处的值配系数将偏离临界点处的值(m=1)，即大于，即大于1或小或小于于1。因此。因此,成相物质的总浓度越高，系线越长，成相物质的总浓度越高，系线越长，蛋白质越容易分配于其中的某一相。蛋白质越容易分配于其中的某一相。双水相萃取课件(2) 盐的种类和浓度盐的种类和浓度p盐的种类和浓度对分配系数的影响主要反盐的种类和浓度对分配系数的影响主要反映在对映在对相间电位相间电位和和蛋

8、白质疏水性蛋白质疏水性的影响。的影响。双水相萃取课件盐的种类盐的种类 在双聚合物系统中，无机离子具有各自的分配系在双聚合物系统中，无机离子具有各自的分配系数，不同电解质的正负离子的分配系数不同，从数，不同电解质的正负离子的分配系数不同，从而产生不同的相间电位。由于各相要保持电中性，而产生不同的相间电位。由于各相要保持电中性，使得带电生物大分子，如蛋白质和核酸等分别向使得带电生物大分子，如蛋白质和核酸等分别向两相移动分配。两相移动分配。双水相萃取课件盐的浓度盐的浓度 盐的浓度不仅影响蛋白质的表面疏水性，而且扰盐的浓度不仅影响蛋白质的表面疏水性，而且扰乱双水相系统，改变各相中成相物质的组成和相乱双

9、水相系统，改变各相中成相物质的组成和相体积比。体积比。p 例如，例如，PEG/磷酸盐体系中上下相的磷酸盐体系中上下相的PEG和磷酸盐浓度及和磷酸盐浓度及Cl-在上下相中的分配平衡随添加在上下相中的分配平衡随添加NaCl浓度的增大而改变，浓度的增大而改变，这种相组成即相性质的改变直接影响蛋白质的分配系数，这种相组成即相性质的改变直接影响蛋白质的分配系数，如图。如图。p 离子强度对不同蛋白质的影响程度不同，利用这一特点，离子强度对不同蛋白质的影响程度不同，利用这一特点，通过调节双水相系统的盐浓度，可有效地萃取分离不同的通过调节双水相系统的盐浓度，可有效地萃取分离不同的蛋白质。蛋白质。双水相萃取课件

10、双水相萃取课件双水相萃取课件双水相萃取课件（4）温度的影响）温度的影响p 分配系数对温度的变化不敏感分配系数对温度的变化不敏感p 成相聚合物对蛋白质有稳定化作用成相聚合物对蛋白质有稳定化作用,所以室温操作所以室温操作活性收率依然很高活性收率依然很高,而且室温时粘度较冷却时而且室温时粘度较冷却时(4 ) 低低,有助于相的分离并节省了能源开支。有助于相的分离并节省了能源开支。双水相萃取课件双水相萃取课件双水相萃取课件双水相萃取课件双水相萃取课件双水相萃取课件（一）目的物的萃取（一）目的物的萃取1、如果目标产物在上相中的分配系数足够大，则、如果目标产物在上相中的分配系数足够大，则细胞匀浆液中的目标产

11、物可采用一步或两步双水细胞匀浆液中的目标产物可采用一步或两步双水相萃取工艺获得较高的纯化倍数。相萃取工艺获得较高的纯化倍数。 p一步双水相萃取：一步双水相萃取：是把生物材料悬浮液和双水相是把生物材料悬浮液和双水相系统混合后，其中下相含有大多数杂质，而上相系统混合后，其中下相含有大多数杂质，而上相含目标产物。含目标产物。p两步双水相萃取：两步双水相萃取：把一步萃取体系中的上相分离把一步萃取体系中的上相分离出来后，再加入盐使其形成新的双水相体系，则出来后，再加入盐使其形成新的双水相体系，则富含富含PEG的上相得到回收，同时，含有目标产物的上相得到回收，同时，含有目标产物的盐相通过超滤等操作得到分离

12、目标。的盐相通过超滤等操作得到分离目标。 双水相萃取课件三步双水相萃取酶的流程示意图三步双水相萃取酶的流程示意图 2、如果细胞匀浆液中的目标产物的分配系数较小，、如果细胞匀浆液中的目标产物的分配系数较小，则可采用多步双水相萃取工艺以获得较高的纯化则可采用多步双水相萃取工艺以获得较高的纯化倍数。倍数。 双水相萃取课件（二）（二）PEG循环循环 在大规模双水相萃取过程中，成相材料的回收和在大规模双水相萃取过程中，成相材料的回收和循环使用，不仅可以减少废水处理的费用，还可循环使用，不仅可以减少废水处理的费用，还可以节约化学试剂，降低成本。以节约化学试剂，降低成本。 PEG的回收有三种方法的回收有三种

13、方法： 加入盐使目标产物转入富盐相来回收加入盐使目标产物转入富盐相来回收PEG； 将将PEG相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去PEG，再洗出蛋白质。，再洗出蛋白质。 超滤超滤双水相萃取课件（三）无机盐的循环（三）无机盐的循环 一种方法使将含磷酸钠的盐相冷却到一种方法使将含磷酸钠的盐相冷却到6，使盐结晶析出，然后用离心机分离收集；使盐结晶析出，然后用离心机分离收集； 另一种方法是用电渗析法、膜分离法回收另一种方法是用电渗析法、膜分离法回收盐类。盐类。双水相萃取课件二、大规模双水相萃取及其简单设备二、大规模双水相萃取及其简单设备 两步萃取法连续分离胞内酶的两步萃取

14、法连续分离胞内酶的流程示意图流程示意图 双水相萃取课件第三节第三节 双水相萃取技术在生物、食品双水相萃取技术在生物、食品工业中的应用工业中的应用 （1）提取酶和蛋白质。）提取酶和蛋白质。 （2）进行萃取性生物转化）进行萃取性生物转化 （3）酸水解产物中提取二肽、氨基酸、核）酸水解产物中提取二肽、氨基酸、核苷酸等风味物质苷酸等风味物质 （4）萃取细胞、细胞器、膜等粒子）萃取细胞、细胞器、膜等粒子 （5）应用于液液分配层析）应用于液液分配层析 双水相萃取课件 双水相的应用举例 分离和提纯各种蛋白质分离和提纯各种蛋白质(酶）酶） 用PEG/ -(NH4) 2SO4 双水相体系,经一次萃取从- 淀粉酶

15、发酵液中分离提取 - 淀粉酶和蛋白酶, 萃取最适宜条件为PEG1000 ( 15 %) -(NH4) 2SO4 (20 %) ,pH = 8 ,- 淀粉酶收率为90 % ,分配系数为19. 6 ,蛋白酶的分离系数高达15. 1。比活率为原发酵液的1. 5 倍,蛋白酶在水相中的收率高于60 %。双水相萃取课件 提取抗生素和分离生物粒子提取抗生素和分离生物粒子 采用PEG/ Na2HPO4 体系提取丙酰螺旋霉素，最佳萃取条件是pH= 8. 08. 5 ， PEG2000 (14 %) / Na2HPO4 (18 %) ,小试收率达69. 2 % ,对照的乙酸丁酯萃取工艺的收率为53. 4 %双水相

16、萃取课件第四节第四节 双水相萃取分离技术的发展方向双水相萃取分离技术的发展方向 一、开发廉价的新型双水相体系一、开发廉价的新型双水相体系例如：用粗例如：用粗dextran、变性淀粉、糊精、变性淀粉、糊精、乙基羟乙基纤维素等取代葡聚糖（乙基羟乙基纤维素等取代葡聚糖（dextran ）双水相萃取课件二、双水相分配与相关技术的集成化二、双水相分配与相关技术的集成化 集成化集成化 ：不同分离技术上的相互渗透、实现优势互补，而达不同分离技术上的相互渗透、实现优势互补，而达 到整体优化的目的。到整体优化的目的。 具体表现具体表现3个方面：个方面：与常规技术结合解决双水相萃取本身的难点问题与常规技术结合解决双水相萃取本身的难点问题引进其他分离技术进行融合以提高分离效率，简化分离引进其他分离技术进行融合以提高分离效率，简化分离过程