大学化学教学课件12分光光度法

1、1 可见分光光度计可见分光光度计23 分光光度法是根据分光光度法是根据物质的吸收光谱物质的吸收光谱及及光的吸收定光的吸收定律律，对物质进行定性、定量分析的一种分析方法。，对物质进行定性、定量分析的一种分析方法。分光光度法分光光度法可见可见分光光度法分光光度法（380380-780nm-780nm）紫外紫外分光光度法分光光度法（1010-380nm-380nm）（常用（常用200-380nm200-380nm）红外红外分光光度法分光光度法（780nm-3780nm-310105 5nmnm）重要特点重要特点：灵敏度高，适用于微量和痕量分析灵敏度高，适用于微量和痕量分析。相对误差一般为相对误差一般

2、为2%5%。41.了解分光光度法的特点、原理和基本概念。 2.掌握lambert-beer定律的数学表达式，能熟练利用该式进行有关计算。3.了解分光光度法测定条件的选择。4.了解分光光度法的误差来源。5.掌握吸收曲线和标准曲线的绘制方法及其应用。6.掌握分光光度法的有关应用。7.熟悉分光光度计的主要组成部件及其作用。5一、物质对光的选择性吸收一、物质对光的选择性吸收 当一束光照射到某物质或某溶液时，组成该物质的当一束光照射到某物质或某溶液时，组成该物质的分子、分子、原子或离子等粒子接受光的能量原子或离子等粒子接受光的能量，使这些粒子中的电子，使这些粒子中的电子由低由低能量的轨道跃迁到高能量轨道

3、能量的轨道跃迁到高能量轨道，也就是说：由基态转变为激，也就是说：由基态转变为激发态。发态。m（基态）（基态）+ hm*（激发态）（激发态）这个过程就是物质对光的吸收这个过程就是物质对光的吸收。 由于分子、离子或原子的能级是量子化的，只有由于分子、离子或原子的能级是量子化的，只有光子的光子的能量能量（h）与被照射物质粒子的与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差（基态和激发态能量之差（e）相等相等时，才能被吸收时，才能被吸收。6单色光单色光复合光复合光光的互补光的互补单一波长的光单一波长的光由不同波长的光组合而成的光由不同波长的光组合而成的光若两种不同颜色的单色光按一定的强度比若两种不同颜色的单色

4、光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。为互补色光，这种现象称为光的互补。蓝蓝黄黄紫红紫红绿绿紫紫黄绿黄绿绿蓝绿蓝橙橙红红蓝绿蓝绿7复合光8测量该溶液对不同波长测量该溶液对不同波长()的单色光的吸收程度，即的单色光的吸收程度，即吸光度吸光度a（absorbance）。 以波长以波长为横坐标为横坐标，吸光度，吸光度a为为纵坐标作图纵坐标作图，可得一条曲线，即，可得一条曲线，即为为吸收光谱或称为吸收曲线。吸收光谱或称为吸收曲线。不同波长不同波长()的单色光依次的单色光依次通过通过有色溶有色溶液液波长波长1234吸光度

5、吸光度a1a2a3a4图图12-2三（邻二氮菲）合铁（三（邻二氮菲）合铁（）离子的吸收光谱）离子的吸收光谱9 吸收光谱中，吸光度最大处的波长为吸收光谱中，吸光度最大处的波长为最大吸最大吸收波长，用收波长，用“ max ”表示表示。 若在最大吸收波长处测定吸光度，灵敏度最高若在最大吸收波长处测定吸光度，灵敏度最高。 图中图中max为为508nm，说明溶液最容易吸收的，说明溶液最容易吸收的波长为波长为508nm附近的光（绿色），所以溶液呈现附近的光（绿色），所以溶液呈现绿色光的补色绿色光的补色-紫红色。紫红色。10 12-2 12-2 分光光度法基本原理分光光度法基本原理一、透光率和吸光度一、透光

6、率和吸光度均匀均匀的有的有色溶色溶液液单单色色光光ioiaitir为反射光强度为反射光强度空空白白溶溶液液被被测测溶溶液液i0 = ia + it 加空白消除影响，上式可简化为：加空白消除影响，上式可简化为：io为入射光强度为入射光强度ia为吸收光强度为吸收光强度it为透过光强度为透过光强度110iitt 透射光的强度透射光的强度 it 与入射光的强度与入射光的强度 i0 之比称为之比称为透光率（透光率（transmittance）用符号用符号“t”表示表示t 越大，溶液对光的吸收就越少越大，溶液对光的吸收就越少； t 越小，溶液对光的吸收就越多越小，溶液对光的吸收就越多。透光率的负对数称为吸

7、光度，用符号透光率的负对数称为吸光度，用符号“a”表示表示。tiita0lglga越大，溶液对光的吸收就越多。越大，溶液对光的吸收就越多。12 lambertlambert定律：定律：当一适当波长的单色光通过一当一适当波长的单色光通过一固定浓度的溶液时，其吸光度与液层厚度成正比固定浓度的溶液时，其吸光度与液层厚度成正比。a = k1b式中：式中：b为液层厚度；为液层厚度； k1为比例系数。为比例系数。 beer定律定律：当一适当波长的当一适当波长的单色光通过一液层厚度固定的单色光通过一液层厚度固定的溶液时，其吸光度与溶液的浓溶液时，其吸光度与溶液的浓度成正比度成正比。a = k2c式中：式中：

8、 c为物质的量浓度或质为物质的量浓度或质 量浓度；量浓度；k2为比例系数。为比例系数。13将以上两式合并得将以上两式合并得：a = bc （lambert-beer定律数学表达式定律数学表达式） 式中：式中：b的单位为的单位为cm；c为物质的量浓度（为物质的量浓度（mol/l）；）； 为摩尔吸光系数，单位为为摩尔吸光系数，单位为lmol-1cm-1。 若用质量浓度若用质量浓度 （gl-1）代替物质的量浓度）代替物质的量浓度c， lambert-beer定律可表示为：定律可表示为：a = ab 式中：式中：a为质量吸光系数，单位为为质量吸光系数，单位为lg-1cm-1。a和和可以相互换算：可以相

9、互换算： bc = ab c = a =a /c =am14 比吸光系数：是指比吸光系数：是指100ml100ml溶液中含溶液中含被测物质被测物质1g1g，液液层厚度层厚度b b为为1cm1cm时的吸光系数值，用时的吸光系数值，用 表示。表示。%11cme%111 . 0cmea a = aa = aa a +a +ab b + a + ac c + + 15解：有解：有lambert-beer定律可得：定律可得：cbtcbalg已知：已知：c = 0.15010-3mol/l，b = 2.00cm，t = 0.39811341033. 100. 2/1050. 1398. 0lg)480(c

10、mmollcmlmolcbanm16例例12-2 测试酶与腺苷酸（测试酶与腺苷酸（amp）体系的吸光度如下：）体系的吸光度如下： a（280nm） = 0.46， a（260nm）= 0.58 试计算每一组分的浓度？试计算每一组分的浓度？11111330. 52511033. 11)480()480(cmglmolgcmmollmnmnma已知：酶的已知：酶的（280nm）= 2.96104lmol-1cm-1 （260nm）= 1.52104lmol-1cm-1 amp的的（280nm）= 2.4103lmol-1cm-1 （260nm）= 1.5104lmol-1cm-1吸收池厚度为吸收池

11、厚度为1.00cm。17 解：解：设酶和腺苷酸（设酶和腺苷酸（amp）的浓度分别为）的浓度分别为y和和z，因吸收，因吸收光的加和性光的加和性为为260nm 0.58 = 1.52104lmol-1cm-11.00cmy + 1.5104lmol-1cm-1 1.00cmz为为280nm 0.46 = 2.96104lmol-1cm-11.00cmy + 2.4103lmol-1cm-1 1.00cmz解方程组得：解方程组得：y = 1.4105mol/l ；（酶的浓度）；（酶的浓度） z = 2.5105mol/l （amp的浓度）的浓度）180.575辐射源辐射源/ /光源光源(source

12、) (source) 单色器单色器(monochromator) (monochromator) 检测器检测器(detector) (detector) 12.3 12.3 可见分光光度法可见分光光度法19 0 1.0 2.0 3.0 4.0 c(mg/ml)a。 。 。 。*0.800.600.400.200.00axcx标准系列标准系列未知样品未知样品20标准对照法标准对照法未知样品未知样品标准样品标准样品21 比吸光系数比较法是利用标准的比吸光系数比较法是利用标准的 值进行定值进行定量测定的，即将量测定的，即将样品的比吸光系数样品的比吸光系数与与标准物质的比标准物质的比吸光系数（可从手册上查得）比较吸光系数（可从手