基因工程的基本操作程序

1、1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基本步骤基本步骤 一、目的基因的获取一、目的基因的获取 二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞 四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取( (一一) )、目的基因、目的基因 目的基因主要指能编码蛋白质的基因，例如，与生物抗逆目的基因主要指能编码蛋白质的基因，例如，与生物抗逆性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因等，也可以是一些具有调控作用的因子。的基因等，也可

2、以是一些具有调控作用的因子。 基因结构：原核生物基因与真核生物基因在结构上都有编基因结构：原核生物基因与真核生物基因在结构上都有编码区和非编码区。码区和非编码区。 编码区：是编码具有一定氨基酸序列的蛋白质的序列。编码区：是编码具有一定氨基酸序列的蛋白质的序列。 非编码区：分布于编码区两侧，对于编码区编码蛋白质具非编码区：分布于编码区两侧，对于编码区编码蛋白质具有有 调控作用。调控作用。原核生物基因原核生物基因-编码区连续编码区连续 真核生物基因真核生物基因-编码区不连续编码区不连续外显子与内含子的认识：外显子与内含子的认识：( (二二) )、获取目的基因的方法、获取目的基因的方法1.1.从基因

3、文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因 (1)(1)基因文库：基因文库：将某种生物全部将某种生物全部DNADNA提取出来，选用适当的限制酶，将提取出来，选用适当的限制酶，将DNADNA切成一定范围大小的切成一定范围大小的DNADNA片段，分别与载体连接，导入受体菌的群体中储存，各片段，分别与载体连接，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 (2)种类：种类：基因组文库：这个受体菌的群体包含了这种生物的所有基因，称基因组文库：这个受体菌的群体包含了这种生物的所有基因，称 为基因组文库。为基因组文库。 部分基

4、因文库：部分受体菌所含有的基因只是该种生物的部分基部分基因文库：部分受体菌所含有的基因只是该种生物的部分基 因，称为基因组文库。如因，称为基因组文库。如cDNA文库。文库。两种文库的比较两种文库的比较基因文库类型基因文库类型 部分部分(cDNA)文库文库基因组文库基因组文库构建基因文库构建基因文库的过程的过程某种生物某个时期的某种生物某个时期的mRNA 逆转录逆转录 cDNA 与载体连接导入与载体连接导入 受体菌群体受体菌群体某生物内部全部某生物内部全部DNA 限制酶限制酶许多许多DNA片段片段与载体连接导入与载体连接导入受体菌群体受体菌群体文库大小文库大小小小大大基因中启动子基因中启动子无无

5、有有基因中内含子基因中内含子无无有有基因多少基因多少某种生物的部分基因某种生物的部分基因某种生物的全部基因某种生物的全部基因物种间的基因交流物种间的基因交流可以可以部分基因可以部分基因可以(3)(3)从基因文库中获取目的基因的主要依据从基因文库中获取目的基因的主要依据 可根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体可根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物上的位置、基因的转录产物mRNAmRNA、基因的翻译产物蛋白质等特性、基因的翻译产物蛋白质等特性来获取目的基因。来获取目的基因。获取目的基因的途径获取目的基因的途径从供体细胞的从供体细胞的DNA中直接分离。方法

6、：鸟枪法。中直接分离。方法：鸟枪法。 鸟枪法：供体的鸟枪法：供体的DNA切成许多切成许多DNA片段，连入载片段，连入载 体导入受体细胞，根据性状筛选目的基体导入受体细胞，根据性状筛选目的基因因人工合成人工合成(真核细胞真核细胞)反转录法：反转录法：mRNA单链单链DNA双链双链DNA根据已知氨基酸序列合成根据已知氨基酸序列合成DNA 方法：氨基酸序列推测方法：氨基酸序列推测mRNA序列，序列，mRNA序序 列推测基因序列，化学合成目的基因。列推测基因序列，化学合成目的基因。2.2.利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 (1)PCR(1)PCR：PCRPCR是聚合酶链式反应的缩写

7、，它是一项在生物体外是聚合酶链式反应的缩写，它是一项在生物体外复制特定复制特定DNADNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以获得大量片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以获得大量的目的基因。的目的基因。 (2)(2)原理：利用原理：利用DNADNA双链复制的原理。双链复制的原理。 (3)(3)前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列( (以便根据这一以便根据这一段序列合成引物段序列合成引物) )。 (4) (4)需要条件：模板需要条件：模板DNADNA、引物、四种脱氧核苷酸、热稳定、引物、四种脱氧核苷酸、热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶酶)

8、)、PCRPCR扩增仪。扩增仪。 (5) (5)特点：呈指数式扩增特点：呈指数式扩增(6)(6)过程：过程： 引物结合到互补引物结合到互补DNA链链Taq酶从引物起始酶从引物起始进行互补链的合成进行互补链的合成53355533延伸方向：从延伸方向：从5端向端向3端延伸端延伸 (7)(7)细胞内细胞内DNADNA复制与复制与PCRPCR技术的比较技术的比较细胞内细胞内DNA复制复制PCR技术技术不不同同点点场所场所主要在细胞核内主要在细胞核内生物体外生物体外解旋解旋在解旋酶作用下，边解旋边复制在解旋酶作用下，边解旋边复制 不需解旋酶。高温不需解旋酶。高温(9095)解旋，解旋，双链完全分开双链完

9、全分开酶酶DNA解旋酶、解旋酶、DNA聚合酶聚合酶Taq酶酶引物引物不需要不需要需要需要温度温度体内温和条件体内温和条件高温高温相相同同点点需提供需提供DNA复制的模板；复制的模板；四种脱氧核苷酸为原料；四种脱氧核苷酸为原料；子链延伸的方向都是从子链延伸的方向都是从5端到端到3端端3.3.人工合成人工合成 如果基因较小，核苷酸序列又已知，也可以通过如果基因较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNADNA合成仪合成仪用化学方法直接人工合成。用化学方法直接人工合成。二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 基因表达载体的构建是基因工程的第二步，也是基因工程的核基因表达载体的构建是基因工程的第二步

10、，也是基因工程的核心。心。 1.目的：是目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下目的：是目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：组成： 目的基因目的基因+启动子启动子+终止子终止子 +标记基因。标记基因。表达载体表达载体启动子启动子插入基因插入基因终止子终止子复制原点复制原点抗生素抗性基因抗生素抗性基因 2.组成组成(1)启动子：是一段有特殊结构的启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出聚合酶识别和结合的部位，能驱

11、动基因转录出mRNA，最，最终获得所需要的蛋白质。终获得所需要的蛋白质。(2)终止子：是一段有特殊结构的终止子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，能片段，位于基因的尾端，能使转录在所需位置停下来。使转录在所需位置停下来。(3)标记基因的作用：为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从标记基因的作用：为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。基因。 3.基因表达载体的构建过程基因表达载体的构建过程 以质粒作为运载体：以质粒作为运载体： 两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因 载

12、体载体(质粒质粒)限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA分子分子限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端重组重组DNA分子分子(重组质粒重组质粒)DNA连接酶连接酶 结果：结果：目的基因两端结合呈环状目的基因两端结合呈环状DNA 载体的两端重新结合成环状载体的两端重新结合成环状DNA 目的基因与载体的黏性末端结合形成基因表达载体目的基因与载体的黏性末端结合形成基因表达载体4.基因表达载体的功能基因表达载体的功能 (1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。 (2)使目的基因能够表达和发挥作

13、用。使目的基因能够表达和发挥作用。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞 1.转化转化 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定的表达的过程，目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定的表达的过程，成为转化。成为转化。 2.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞 (1)方法：农杆菌转化法；基因枪法；花粉管通道法。方法：农杆菌转化法；基因枪法；花粉管通道法。 (2)农杆菌转化法特点：农杆菌转化法特点： (3)农杆菌转化法过程：农杆菌转化法过程： 目的基因目的基因插入插入Ti质粒的质粒的T-DNA上上转入农杆菌转入农杆菌导入植物细胞导入植物细胞整合到受整合到受体细

14、胞染色体的体细胞染色体的DNA上上维持稳定和表达维持稳定和表达 3.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞 (1)常用方法：显微注射技术。常用方法：显微注射技术。 (2)操作程序：将含有目的基因的表达载体提纯操作程序：将含有目的基因的表达载体提纯取卵取卵(受精受精卵卵)显微注射显微注射移植到雌性动物的输卵管或子宫内发育移植到雌性动物的输卵管或子宫内发育获获得具有新性状的动物得具有新性状的动物 4.将目的基因导入微生物将目的基因导入微生物 (1)原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质少等。原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质少等。 (2)转化过程：转化过程：Ca2+处理细胞处

15、理细胞感受态细胞感受态细胞重组表达载体重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNA分子分子 (3)实例：早期的基因工程操作都用原核生物作为受体细胞，其实例：早期的基因工程操作都用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最为常见。中以大肠杆菌最为常见。 5.目的基因导入不同受体细胞的比较目的基因导入不同受体细胞的比较生物种类生物种类植物细胞植物细胞动物细胞动物细胞微生物微生物转化方法转化方法农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射技术显微注射技术感受态细胞法感受态细胞法受体细胞受体细胞卵细胞、受精卵、卵细胞、受精卵、体细

16、胞体细胞受精卵、卵细胞受精卵、卵细胞常用大肠杆菌常用大肠杆菌目的目的形成具有新性状形成具有新性状的植株的植株形成具有新性状形成具有新性状的动物的动物生产人们所需要生产人们所需要的基因产品的基因产品四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定 目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测和鉴定才能知道。这是基因工程的第四步特性，只有通过检测和鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。工作。 1.操作目的操作目的 检测和鉴定目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和检测和鉴定目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表

17、达起遗传特性。表达起遗传特性。 2.检测和鉴定水平检测和鉴定水平目的基因是目的基因是否插入否插入mRNA蛋白质蛋白质个体个体DNA分子分子杂交杂交是否出现是否出现杂交带杂交带分子杂交分子杂交是否出现是否出现杂交带杂交带抗原抗原-抗体抗体杂交杂交是否出现是否出现杂交带杂交带抗虫、抗病抗虫、抗病接种实验接种实验是否抗虫；是否抗虫；是否抗病是否抗病个体水平检测个体水平检测分子水平检测分子水平检测转录转录翻译翻译检测检测检测检测检测检测鉴定鉴定现象现象现象现象现象现象现象现象DNA探针及其应用探针及其应用 1.DNA探针的应用所依据的原理是探针的应用所依据的原理是DNA杂交杂交。 DNA杂交是指杂交是指DNA片段在适合的条件下能和与之互补的另一个片段结合