任务五测定食品中的蛋白质及氨基酸

1、食品分析与检验技术1任务五测定食品中的蛋白质及氨基酸 李京东 余奇飞 刘丽红食品分析与检验技术2v技能目标1会测定食品中粗蛋白含量。2会测定食品中氨基酸总量。3会测定食品中不同氨基酸含量。v知识目标1明确常见的食品蛋白质含量，以及测定原理。2明确食品氨基酸总量的含量，以及测定原理。食品分析与检验技术3项目一：测定食品中蛋白质v一、案例v二、选用的国家标准GB 5009.5-2010食品中蛋白质的测定凯氏定氮法。食品分析与检验技术4v三、测定方法1样品消化v 准确称取固体样品0.22g ,半固体样品25g，液体样品1025g，使试样中含氮3040mg （精确至0.001g），小心移入干燥洁净的1

2、00mL或500mL凯氏烧瓶中，然后依次加硫酸铜0.2g、硫酸钾6g、浓硫酸20mL、玻璃珠数粒，轻轻摇匀后，安装消化装置。v将凯氏烧瓶45斜放在电炉上，于瓶口放一漏斗，缓慢加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，加大火力，保持液面微沸至溶液呈蓝绿色透明时，继续加热0.51h，取下凯氏烧瓶冷却后，缓慢加入20mL水，冷却至室温。食品分析与检验技术5v2蒸馏、吸收（1）常量蒸馏：装好蒸馏装置。接收瓶内加入10mL 4%硼酸溶液及45滴甲基红-溴甲酚绿混合指示液，置于蒸馏装置的冷凝管下口，并使冷凝管下口浸入硼酸溶液中。放松夹子，沿漏斗向凯氏烧瓶中缓慢加入7080mL40%氢氧化钠溶液，摇动凯氏瓶，至瓶

3、内溶液变为深蓝色，或产生黑色沉淀，再从漏斗加入100mL蒸馏水，夹紧夹子。加热蒸馏，蒸馏30min(始终保持液面沸腾)，至氨全部蒸出(约250mL蒸馏液)。降低接收瓶的位置，使冷凝管口离开液面，继续蒸馏13min，用表面皿接几滴溜出液，以奈氏试剂检查，如无红棕色生成，表示蒸馏完毕。停止加热，用少量水冲洗冷凝管管口，洗液并入接收瓶内，取下接收瓶，用0.1000mol/L的盐酸标准溶液滴定至终点；同时做空白实验，记录空白滴定消耗盐酸标准溶液体积。食品分析与检验技术6食品分析与检验技术7v（2）微量蒸馏：安装好定氮蒸馏装置。在水蒸气发生瓶中装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，保持水呈

4、酸性（淡红色），加热煮沸，将样品消化液转移到100mL容量瓶中并定容、摇匀。接收瓶内加入10mL 4%硼酸溶液和1滴混合指示剂，置于蒸馏装置的冷凝管下口，浸入硼酸溶液中，取210mL稀释样液，移入反应室，并用少量蒸馏水冲洗，塞紧玻璃塞，然后向反应室加入10mL400g/L氢氧化钠溶液，立即塞紧玻璃塞，加水密封。蒸馏至硼酸吸收液中指示剂变为绿色开始计时，继续蒸馏10min后，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min，冲洗冷凝管管口。取下接收瓶，用0.1000mol/L的盐酸标准溶液滴定至终点，同时做空白实验，记录空白滴定消耗盐酸标准溶液体积。食品分析与检验技术8食品分析与检验技术9v3结果计算常量蒸馏

5、按下式计算: 微量蒸馏按下式计算：v式中vX食品中蛋白质质量分数，%；vV滴定试样时消耗盐酸标准滴定溶液的体积，mL；vV0空白试验时消耗盐酸标准滴定溶液的体积，mL；vc盐酸标准滴定溶液的浓度；v0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol；vm试样的质量，g；vF氮换算为蛋白质的系数。100014. 0)(0FmVVX%100014. 0)(0FmcVVX10010010014. 0)(0FmVVX食品分析与检验技术10v4试剂硫酸铜CuSO45H2O、硫酸钾、硫酸(密度为1.8149g/L)、40g/L硼酸溶液、400g/L氢氧化钠、0.1000mol/L盐酸标准溶液、混合指示剂v混合指示剂：

6、1g/L甲基红乙醇溶液与1g/L亚甲基蓝乙醇溶液，用时按2:1的比例混合；或者1g/L甲基红乙醇溶液与1g/L溴甲酚绿乙醇溶液，用时按1:5的比例混合。v5实验仪器凯氏烧瓶（100mL或500mL）、可调式电炉、定氮蒸馏装置。食品分析与检验技术11v四、相关知识（一）食品中蛋白质含量测定凯氏定氮法原理v 将被检样品加入浓硫酸，以硫酸铜、硫酸钾为催化剂共同加热消化，食品中蛋白质分解为氨，并与硫酸结合成硫酸铵，通过碱化蒸馏，使氨分离出来，用硼酸吸收形成硼酸氨后，再用盐酸标准溶液滴定，根据消耗的标准盐酸的体积，通过换算系数，可测定食品中蛋白质含量。v 本法摘自GB 5009.5-2010，适用于所有

7、动、植物食品的蛋白质含量测定。食品分析与检验技术12v（二）样品消化反应过程1样品消化、蒸馏、滴定反应过程消化反应方程式：v 2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2Ov 2H2SO4+CCO2+SO2+H2Ov H2SO4+2NH3(NH4)2SO4蒸馏反应方程式：v(NH4)2SO4+2NaOH2NH3+Na2SO4+2H2O吸收与滴定：v2NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7+5H2Ov(NH4)2B4O7+5H2O+2HCl2NH4Cl+4H3BO3食品分析与检验技术13v2加快食品消化反应（1）硫酸钾：硫酸钾可以提高溶液的沸点

8、而加快有机物分解，它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，反应方程式为：vK2SO4+H2SO42KHSO4v2KHSO4K2SO4十SO2十H2O（2）硫酸铜：起催化剂作用，使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化，硫酸铜的作用机理如下所示：v2CuSO4Cu2SO4+SO2+O2vC+CuSO4 Cu2SO4+SO2+CO2v Cu2SO4+2H2SO42CuSO4+H2O+SO2 此反应不断进行，待有机物全部被消化完后，不再有硫酸亚铜 (褐色)生成，溶液呈现清澈的蓝绿色，故硫酸铜除起催化剂的作用外，还可指示消化终点的到达。 食品分析与检验技术14v（三）不同食品的蛋

9、白质换算系数v食品种类 F食品种类 Fv小麦 5.83小麦粉及其制品 5.7v大麦、燕麦、黑麦 5.83米 5.95v花生 5.46大豆及其制品 5.71v畜禽肉及其制品 6.25乳及乳制品 6.38v芝麻、向日葵 5.4南瓜子 5.4v栗子、胡桃 5.3其他食品 6.25食品分析与检验技术15v（四）注意事项1蛋白质含量测定，因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故结果称为粗蛋白质含量。2为减少实验误差，所有试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。3消化过程要不断转动凯氏烧瓶，以利于附着在瓶壁上的固体残渣洗下，促进其消化；同时为防止造成氮损失，不要用强火，应保持缓和沸腾

10、。4样品中含脂肪或糖较多，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫外溢，在消化开始时用小火加热，并时时摇动，也可以加入少量辛醇、液体石蜡或硅油消泡剂，并控制热源强度。食品分析与检验技术165一般消化至呈透明后，继续消化30min即可,有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。6当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢23mL后继续加热消化。7蒸馏装置应该密封，防止漏气，蒸馏过程中不得停火断气，防止发生倒吸；v消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，说明蒸馏前加碱量不足，要再增加氢氧化钠用量；蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提高液面清洗管口，再蒸馏1min而后关掉

11、热源，否则可能造成吸收液倒吸。9硼酸吸收液的温度不应超过40，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中。10混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。食品分析与检验技术17v五、测定食品中蛋白质的方法（一）食品中蛋白质的意义v测定食品蛋白质的含量有利于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源，同时对于提高产品质量、优化食品配方具有重要意义 食品分析与检验技术18v食品蛋白质测定方法测定方法v利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；v利用蛋白质中特定的氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。凯氏定氮法作为国家标准检测蛋白质

12、的方法，是目前最常用的方法，是测定总有机氮最准确和操作简便的方法之一.双缩脲法，染料结合法，紫外线吸收法，酚试剂法等采用红外检测仪对蛋白质进行快速定量分析。食品分析与检验技术19v(二)双缩脲法 当脲被小心加热至150160时，两分子间脱去一个氨分子形成双缩脲，双缩脲在碱性条件下，能与硫酸铜生成紫红色配合物，称为双缩脲反应，由于蛋白质分子中有肽键(CONH)，与双缩脲结构相似，故也能呈现此反应而生成紫红色配合物，在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，据此可用吸收光度法来测定蛋白质含量，该配合物的最大吸收波长为560nm。食品分析与检验技术20v1标准曲线的绘制以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量

13、的样品作为标准蛋白质样品。按蛋白质含量40、50、60、70、80、90、100、110mg分别称取混合均匀的标准蛋白质样于8支50mL纳氏比色管中，然后各加入1mL四氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液 (或)准确稀释至50mL，振摇10min，静置1h，取上层清液离心5min(2000r/min)。取离心分离后的透明液于比色皿中，在560nm波长下以蒸馏水作参比液，调节仪器零点并测定各溶液的吸光度值以蛋白质的含量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。食品分析与检验技术21v2样品的测定准确称取样品适量 (即使得蛋白质含量在40110mg)于50mL纳氏比色管中，加1mL四氯化碳，按上述步骤显色后，

14、在相同条件下测其吸光度值。用测得的吸光度值在标准曲线上可查得蛋白质毫克数，由此求得蛋白质含量。食品分析与检验技术22v3结果计算v式中vX样品蛋白质含量，mg/100g。vm由标准曲线上查得的蛋白质含量，mg；vm1样品质量，g。v4试剂 碱性硫酸铜溶液、氯化碳。v5仪器分光光度计、离心机。1100mmX食品分析与检验技术23v6注意事项（1）蛋白质的种类不同，对发色程度的影响不大。（2）标准曲线做完整之后，无需每次再做标准曲线。（3）含脂肪高的样品应预先用醚脱脂。（4）样品中有不溶性成分存在时，会给比色测定带来困难，此时可预先将蛋白质抽出后再进行测定。（5）当肽链中含有脯氨酸时，若有多量糖类

15、共存，显色不好，测定值偏低。（6）本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种籽及肉类等样品测定食品分析与检验技术24项目二：测定食品中氨基酸态氮v一、案例v二、选用国家标准GB/T5009.39-2003酱油卫生标准的分析方法甲醛值法。食品分析与检验技术25v三、测定方法1分析步骤v（1）吸取酱油5.0mL于100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释在至刻度，吸取混匀液20.0mL于200mL烧杯中，加水60mL，开动磁力搅拌器，用0.050mol/L氢氧化钠滴定至酸度计指示pH为8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液体积。v（2）将烧杯中

16、继续加入10.0mL36%甲醛，混匀后用氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液体积。v（3）做空白实验，取实验用水80mL，其余步骤同上，记录消耗氢氧化钠标准溶液体积。 食品分析与检验技术26v4结果计算v式中vX食品中氨基酸态氮的含量，g/100mL；vV1测定用试样稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；vV2试液空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；vV3试样稀释液取用量，mL；vc氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/L；v0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol。v5试剂36甲醛溶液（不含聚合物）、0.050mol/L氢氧化钠标准滴

17、定溶液。v6实验仪器酸度计、磁力搅拌器、10mL微量滴定管。100100/5014. 0)(321VcVVX食品分析与检验技术27v四、相关知识（一）食品中氨基酸态氮含量测定甲醛值法原理（电位滴定法）v利用氨基酸含有-COOH显示酸性，又含有-NH2显示碱性的两性性质，当加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，就可用氢氧化钠标准溶液滴定-COOH，以间接方法测定氨基酸的量。 v本法摘自GB/T T5009.39-2003酱油卫生标准的分析方法,适用于食品中游离氨基酸含量的测定，是国家用于粮食和其副产品豆饼、麸皮等为原料酿造或配制酱油中氨基酸态氮分析方法。（二）注意

18、事项v1氨基酸态氮是指以氨基酸形式存在的氮元素的含量。对于酱油来说该指标越高，说明酱油中的氨基酸含量越高，鲜味越好。v2固体样品要先进行粉碎，准确称样后用水萃取，然后测定萃取液，萃取在50 水浴中进行；液体样品可以直接测定。食品分析与检验技术28v五、测定食品中氨基酸态氮方法（一）食品中氨基酸态氮的意义v氨基酸态氮是食品检测一项重要指标，可以作为食品分级的依据，如酱油的等级。v食品中氨基酸态氮测定的方法包括甲醛值法，比色法。甲醛值法除用电位滴定法进行操作外，还可以用指示剂法进行测定，用指示剂作为反应终点。食品分析与检验技术29v（二）双指示剂甲醛法v指示剂分为单指示剂甲醛滴定法和双指示剂甲醛滴

19、定法，前者分析结果稍为偏低，后者更为准确，二者实验原理同电位滴定法。v1移取含氨基酸约为2030mg的样品2份，分别置于250mL锥形瓶中，各加50mL蒸馏水，其中1份加入数滴1g/L中性红乙醇指示剂，用0.1mol/LNaOH标准溶液滴定至琥珀色为终点；另1份加入数滴1g/L百里酚酞乙醇指示剂及中性甲醛20mL，摇匀，静置1min，用0.1mol/LNaOH标准溶液滴定至淡蓝色为终点。分别纪录2次所消耗的NaOH标准溶液体积（mL）。食品分析与检验技术30v2结果计算v式中vX氨基酸态氮的质量分数，%；vc 氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；vV1用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液

20、的体积，mL；vV2用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；vm测定用样品溶液相当于样品的质量，g；v0.014氮的毫摩尔质量，g/mmol。v3注意事项（1）此法中样品颜色较深时，可加适量活性炭脱色后再测定。（2）单指示剂甲醛滴定法，只用百里酚酞指示剂。 %100014. 0)(12mcVVX食品分析与检验技术31v（三）比色法简介 在pH4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中，氨基酸态氮与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4二氢化吡啶氨基衍生物，在波长400nm处测定吸光度，与标准系列比较定量。食品分析与检验技术32项目三：测定食品中氨基酸v一、案例

21、v二、选用的国家标准GB/T5009.124-2003食品中氨基酸的测定自动分析仪测定法。 食品分析与检验技术33v三、测定方法1试样处理v试样用匀浆机匀浆后在低温冰箱中冷冻保存，需要时解冻使用。2称样v准确称取匀浆好的试样，试样蛋白质含量在1020mg范围。3水解v在水解管中加入6mol/L盐酸1020mL，含水量高的试样可加入等体积的浓盐酸，加入新蒸馏的苯酚34滴，再将水解管放入冷冻剂中冷冻35min，然后连接真空泵，抽真空后充入高纯氮气，反复三次拧紧螺丝盖将充满氮气封口的水解管放在110士1恒温干燥箱内，水解22h后，取出冷却。过滤水解液，多次冲洗水解管，将水解液移入50mL容量瓶中定容，吸取1mL滤液于5mL容量瓶中，用真空干燥器在4050干燥，残留物用12mL水溶解，再干燥，反复两次，最后蒸干，用1mL pH2.2缓冲溶液溶解，待测。食品分析与检验技术34v4测定 准确吸取0.200mL混合氨基酸标准溶液，用pH2.2的缓冲溶液稀释到5mL，此标准溶液稀释浓度为5.00nmol/