基因表达干扰技术MicrosoftPowerPoint演示文稿文库

1、12 基因表达干扰技术基因表达干扰技术二、核酶与脱氧核酶二、核酶与脱氧核酶三、小干扰三、小干扰rna四、微四、微rna一、反义核酸技术一、反义核酸技术3一、反义核酸技术一、反义核酸技术概念概念:反义核酸反义核酸:是根据碱基互补原理设计的是根据碱基互补原理设计的,针对针对 特定靶序列特定靶序列互补的互补的dna或或rna片段，通过片段，通过与特定靶序列结合，从而抑制特定基因的与特定靶序列结合，从而抑制特定基因的表达。表达。 4反义反义核酸核酸技术技术:是根据是根据碱基互补原理碱基互补原理，用人，用人工合成或生物体内合成的特定互补的工合成或生物体内合成的特定互补的dna或或rna片段抑制或封闭基因

2、表达的技术片段抑制或封闭基因表达的技术 种类：种类：反义反义dna 反义反义rna 来源：来源：人工合成人工合成 生物合成生物合成5（一）反义寡核苷酸（一）反义寡核苷酸( (反义反义dna)dna)（asonason）技术）技术 反义反义dna:是人工合成的与是人工合成的与待封闭基因待封闭基因的某的某一区段互补的正常或化学修饰的一区段互补的正常或化学修饰的dna片段，片段，用来抑制或封闭这一基因的表达。用来抑制或封闭这一基因的表达。61.1.反义寡核苷酸的作用机制反义寡核苷酸的作用机制 (1) (1) 抑制抑制mrnamrna的翻译的翻译 (2) (2) 抑制复制或转录抑制复制或转录 (3)

3、(3) 抑制蛋白质的加工、修饰及功能表达抑制蛋白质的加工、修饰及功能表达7 降解降解 反义核酸反义核酸 靶核酸靶核酸 二聚体二聚体 空间阻空间阻碍碍 碱基互补碱基互补抑制基因表达抑制基因表达89 2. 2.反义寡核苷酸的给药途径反义寡核苷酸的给药途径 （1 1）直接作用于培养细胞）直接作用于培养细胞 （直接进入细胞）（直接进入细胞） （2 2）结合）结合l-l-多聚赖氨酸或脂质体进入细胞多聚赖氨酸或脂质体进入细胞 （通过载体进入细胞）（通过载体进入细胞） （3 3）动物模型则可通过静脉、腹腔、皮下、）动物模型则可通过静脉、腹腔、皮下、 肌肉、瘤体内注射或气雾吸入等途径肌肉、瘤体内注射或气雾吸入

4、等途径 10（二）反义（二）反义rnarna技术技术 反义反义rna 是指能和是指能和mrna完全互补的完全互补的小分子小分子rna片段片段，其与其与mrna结合后可影响结合后可影响mrna的正的正常修饰和翻译，从而调节基因表达。常修饰和翻译，从而调节基因表达。111.1.反义反义rnarna的作用机制的作用机制 (1) (1) 抑制抑制dnadna复制：复制：与引物与引物rnarna结合，抑制复制结合，抑制复制 (2) (2) 阻止目的阻止目的mrnamrna的成熟及向胞浆内转运的成熟及向胞浆内转运 与与mrnamrna互补结合影响加帽、剪接和加尾互补结合影响加帽、剪接和加尾 (3) (3)

5、 抑制抑制mrnamrna翻译翻译 与与5 5端端sd序列、起始密码序列、起始密码aug结合，影响翻译结合，影响翻译 (4) (4) 使使mrnamrna更易被核酸酶识别而降解更易被核酸酶识别而降解12 2. 2.反义反义rnarna的设计的设计 与与asonason相比，反义相比，反义rnarna的设计较为简单的设计较为简单 pcrpcr反义基因反义基因+载体载体重组反义基因重组反义基因细胞细胞反义反义rna13（三）反义核酸技术的应用（三）反义核酸技术的应用1.基因分析基因分析2.可作为探针进行原位杂交，分析基因表达可作为探针进行原位杂交，分析基因表达3.用于病毒病、肿瘤及遗传性疾病的治疗

6、用于病毒病、肿瘤及遗传性疾病的治疗14二、核酶与脱氧核酶二、核酶与脱氧核酶（一）核酶（一）核酶 核酶是一类具有催化作用的核酶是一类具有催化作用的rnarna分子，分子， 能够特异性地剪切底物能够特异性地剪切底物rnarna或突变的或突变的rnarna。 151.1.核酶的分类核酶的分类 （1 1）大分子核酶：）大分子核酶： （2 2）小分子核酶）小分子核酶 ： 16 2.2.核酶的结构核酶的结构（1 1）锤头状核酶：）锤头状核酶： 二级结构有三个二级结构有三个 螺旋环结构区和螺旋环结构区和 一个催化中心一个催化中心 17（2 2）发夹形核酶：）发夹形核酶： 每个结构域由每个结构域由 螺旋螺旋-

7、 -环环- -螺旋组成螺旋组成 18n3.核酶的设计与修饰核酶的设计与修饰 设计：核酶核心与结合臂的设计设计：核酶核心与结合臂的设计 在底物在底物rna中选择最佳的剪切位点中选择最佳的剪切位点 修饰：防止被核酸酶降解修饰：防止被核酸酶降解19n4.核酶转移方法核酶转移方法 核酶需转入细胞内才能发挥功能核酶需转入细胞内才能发挥功能 方法：外源性转移方法：外源性转移 内源性转移内源性转移20n5.核酶的应用核酶的应用 病毒性疾病的治疗病毒性疾病的治疗 乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒 艾滋病毒艾滋病毒 肿瘤的治疗肿瘤的治疗21核酶的作用核酶的作用22（二）脱氧核酶（二）脱氧核酶

8、具有催化作用的具有催化作用的dnadna（人工合成）（人工合成）23 1. 1.脱氧核酶的结构种类及特征脱氧核酶的结构种类及特征 （1 1）10-2310-23型脱氧核酶：型脱氧核酶： 24 （2 2）8-178-17型脱氧核酶：型脱氧核酶： 252.2.脱氧核酶的催化特性脱氧核酶的催化特性 （1 1）rnarna切割活性切割活性 （2 2）dnadna连接酶活性连接酶活性 （3 3）卟啉金属化酶和过氧化酶活性）卟啉金属化酶和过氧化酶活性 （4 4）dnadna切割活性切割活性 （5 5）n-n-糖基化酶活性糖基化酶活性 （6 6）dnadna激酶活性激酶活性 （7 7）dnadna戴帽活性戴

9、帽活性 263.3.脱氧核酶的应用脱氧核酶的应用为治疗为治疗rnarna病毒感染的疾病提供了一条新途径病毒感染的疾病提供了一条新途径 二、核酶与脱氧核酶二、核酶与脱氧核酶27三、小干扰三、小干扰rnarnarna干扰（干扰（rnai）：）：利用特定的利用特定的小分子单链小分子单链 rna与一条与一条mrna的互补区发生碱基的互补区发生碱基 配对，从而配对，从而阻遏阻遏这条这条mrna的表达。的表达。把这条小分子的把这条小分子的rna称为称为小干扰小干扰rna（sirna）28（一）一般研究路线（一）一般研究路线29（二）（二）rnairnai的作用机制的作用机制 1.1.起始阶段起始阶段 2.

10、2.效应阶段效应阶段 3.3.倍增阶段倍增阶段 3031（三）（三）sirnasirna的导入的导入 1.1.脂质体或电穿孔脂质体或电穿孔 2.2.病毒携带病毒携带 3.3.细胞穿透肽细胞穿透肽 （四）（四）rnairnai沉默效果的检测沉默效果的检测 检测检测mrnamrna或蛋白质或蛋白质 32n（五）（五）rnairnai的应用的应用 1.1.基因功能的研究基因功能的研究 2.2.基因剔除基因剔除 3.3.基因治疗基因治疗 4.4.细胞信号转导途径分析细胞信号转导途径分析 5.5.药物开发药物开发33四、微四、微rnarna（mirnamirna） 是一组短小，一般为是一组短小，一般为2

11、024个核苷酸组成，个核苷酸组成，本身不具有开放阅读框架，具有高度保守性、本身不具有开放阅读框架，具有高度保守性、时序性和组织特异性的小分子时序性和组织特异性的小分子rna。34mir-#mir-#（# #代表数字）表示代表数字）表示mirnamirnamir-#mir-#（# #代表数字）表示相应的编码基因代表数字）表示相应的编码基因 （一）（一） mirna的命名的命名35（二）（二）mirnamirna的作用机制的作用机制 1.1.起始阶段：细胞内源性基因起始阶段：细胞内源性基因单链初级转录产物单链初级转录产物 2.2.成熟阶段：成熟阶段：单链初级转录产物单链初级转录产物70核苷酸前体核

12、苷酸前体mirna 胞质胞质21核苷酸的核苷酸的mirna 3. 3.功能阶段：功能阶段：mirna+蛋白质蛋白质核糖核蛋白复合物核糖核蛋白复合物 (pri-mirna)(pre-mirna)抑制抑制mrna翻译翻译调节基因表达调节基因表达3637（三）（三）sirnasirna与与micrornamicrorna的区别的区别 共同点共同点 由由2222个左右的核苷酸组成个左右的核苷酸组成 是是dicerdicer酶的产物酶的产物 需需argonateargonate家族蛋白的存在家族蛋白的存在 与与riscrisc形成复合物起干扰、调节作用形成复合物起干扰、调节作用 可在转录后、翻译水平上干

13、扰靶可在转录后、翻译水平上干扰靶mrna mrna 38sirnasirna与与micrornamicrorna的不同的不同sirnasirna外源性外源性由长由长dsrnadsrna经经dicerdicer酶切割得到酶切割得到双链双链与靶与靶mrnamrna完全互补配对完全互补配对ago2ago2蛋白蛋白降解降解mrnamrna而抑制蛋白质翻译而抑制蛋白质翻译 抑制转座子活性和病毒感染抑制转座子活性和病毒感染micrornamicrorna内源性内源性由由pre-mirnapre-mirna经经dicerdicer酶切割而来酶切割而来单链单链与靶与靶mrnamrna并不完全互补并不完全互补ago1ago1蛋白蛋白阻止阻止mrnamrna的翻译而不降解靶的翻译而不降解靶m