第5章微生物的遗传变异与菌种选育1

1、第5章 微生物的遗传变异与菌种选育5.1 微生物遗传变异的物质基础微生物遗传变异的物质基础5.2 微生物的基因突变微生物的基因突变5.3 微生物的基因重组微生物的基因重组 5.4 微生物的菌种选育微生物的菌种选育 5.5 微生物菌种的保藏和复壮微生物菌种的保藏和复壮 l微生物是现代遗传学、分子生物学和微生物是现代遗传学、分子生物学和其它许多重要的生物学基础研究中最热衷其它许多重要的生物学基础研究中最热衷选用的模式生物。选用的模式生物。研究微生物遗传学的意义l为什么进化的速度以及复杂性变得越来越快？为什么进化的速度以及复杂性变得越来越快？l根据化石记录显示，单细胞生物于根据化石记录显示，单细胞生

2、物于35亿年前亿年前首次出现在地球上，但是之后它们用了大约首次出现在地球上，但是之后它们用了大约25亿年进化成多细胞生物，剩下的亿年进化成多细胞生物，剩下的10亿年却发展亿年却发展成了植物、哺乳动物、昆虫、鸟类等各种各样的成了植物、哺乳动物、昆虫、鸟类等各种各样的地球物种。地球物种。 lrice大学科学家的研究结果可望解决这一问大学科学家的研究结果可望解决这一问题，他们认为生物进化速度的加快是因为细菌和题，他们认为生物进化速度的加快是因为细菌和病毒不断在不同物种之间传递病毒不断在不同物种之间传递dna，如果没有这，如果没有这种作用，只依靠基因突变和两性选择作用是不会种作用，只依靠基因突变和两性

3、选择作用是不会达到如此快速度的。达到如此快速度的。l对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了和和的发展，而且为的发展，而且为提供了丰富的理论基础，促使育种工作从提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。l 在应用微生物加工制造和发酵生产各种食品在应用微生物加工制造和发酵生产各种食品l的过程中，要想有效地大幅度提高产品的产的过程中，要想有效地大幅度提高产品的产l量、质量和花色品种量、质量和花色品种,首先必须选育优良的生产

4、首先必须选育优良的生产l菌种，才能达到目的。优良菌种的选育是在微菌种，才能达到目的。优良菌种的选育是在微l生物遗传变异的基础上进行的。生物遗传变异的基础上进行的。l 遗传和变异是相互关联，同时又相互矛盾对遗传和变异是相互关联，同时又相互矛盾对l立的两个方面，在一定条件下，二者是相互转立的两个方面，在一定条件下，二者是相互转l化的。化的。遗传与变异的概念l遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。l遗传遗传(heredity)：亲代生物的性状在子代得到表现；亲亲代生物的性状在子代得到表现；亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。代生物传递给子代一套实现

5、与其相同形状的遗传信息。特点：具稳定性。特点：具稳定性。遗传型（遗传型（genotype）：又称基因型，指某一生物个体）：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因的总和；所含有的全部基因的总和；-是一种内在可能性或潜是一种内在可能性或潜力。力。 遗传型遗传型 + 环境条件环境条件 表型表型l表型（表型（phenotype）：）：指生物体所具有的一切外表特征指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和和内在特性的总和; l是一种现实存在，是具一定遗传型的生物在一定是一种现实存在，是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状。条件下所表现出的具体性状。代谢代谢发育发育变异变异(variat

6、ion):生物体在外因生物体在外因或内因的作用下，或内因的作用下，遗传物质的遗传物质的结构或数量发生改变。结构或数量发生改变。 特点特点: a.: a.在群体中出现几率极低，（一般为在群体中出现几率极低，（一般为1010-6-61010-10-10） b.b.形状变化的幅度大；形状变化的幅度大； c. c. 变化后形成的新性状是稳定的，可遗传的。变化后形成的新性状是稳定的，可遗传的。饰变（饰变（modification）：指不涉及遗传物质结构改变而只发：指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。特点是：生在转录、转译水平上的表型变化。特点是：a.几乎整个群几乎整个群体中的每

7、一个个体都发生同样的变化；体中的每一个个体都发生同样的变化；b.性状变化的幅度小；性状变化的幅度小；c.因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。引起饰变的因素消因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。失后，表型即可恢复。遗传与变异的概念遗传与变异的概念5.1 微生物遗传变异的物质基础v种质连续理论：18831889年间weissmann(魏斯曼)提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。v基因学说：二十世纪初发现了染色体并提出基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。 染色体由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。20多种氨基酸经过不同排列组合，可以演变出的蛋白

8、质数目几乎可以达到一个天文数字，而核酸的组成却简单得多，一般仅由4种不同的核苷酸组成，它们通过排列组合只能产生较少种类的核酸，因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因，起活性成分是蛋白质。vdna是遗传变异的物质基础的证明：1944年以后，利用微生物为实验对象进行的三个著名实验（肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验）证明核酸是遗传变异物质基础的经典实验证明核酸是遗传变异物质基础的经典实验v5.1.1 肺炎双球菌转化实验肺炎双球菌转化实验（transformation）：1928年,英国医学微生物学家格里菲斯(fgriffith)发现肺炎球菌的转化现象 ，v研究对象：stre

9、ptococcus pneumoniae（肺炎双球菌）vs型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有荚膜vr型菌株：无致病性，菌落表面粗糙，无荚膜图5-1 肺炎双球菌动物转化试验 1928年，进行了以下几组实验：（1）动物实验对小鼠注射活r菌或死s菌 小鼠存活对小鼠注射活s菌小鼠死亡对小鼠注射活r菌和热死s菌 小鼠死亡（2）细菌培养实验热死s菌不生长活r 菌长出r菌热死s菌+活r 菌长出大量r菌和10-6s菌（3）s型菌的无细胞抽提液试验活r菌+s菌无细胞抽提液长出大量r菌和少量s菌v加s菌dnav加s菌dna及dna酶以 外的酶v加s菌的dna和dna酶v加s菌的rnav加s菌的蛋白质v加s菌的荚膜

10、多糖活r菌长出s菌只有r菌1944年o.t.avery(埃弗里)、c.m.macleod(麦克劳德)和m。mccarty(麦卡蒂)从热死s型肺炎球菌 s.pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，在离体条件下进行了转化试验：只有s型细菌的dna才能将肺炎球菌 s.pneumoniae的r型转化为s型。且dna纯度越高，转化效率也越高。说明s型菌株转移给r型菌株的，是遗传因子。5.1.1.2噬菌体的感染实验la. d. hershey(赫西)和m. chase (蔡斯) ， 1952年（1）含32p-dna的一组：放射性85%在沉淀中（2）含35s-蛋白质的一组：放射性75%在上清

11、液中所以，进入细胞的是噬菌体的核酸而不是蛋白质。5.1.1.3烟草花叶病毒的拆开与重组实验v为了证明核酸是遗传物质，弗伦克尔-康拉特 (h. fraenkel-conrat)（1956）用含rna的烟草花叶病毒（tmv）进行了著名的植物病毒重建实验。v将tmv在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与rna核心相分离。分离后的rna在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。v选用烟草花叶病毒(tmv)和霍氏车前花叶病毒（hrv），分别拆分取得各自的rna和蛋白质，将两种rna分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒： （1）rna（tm

12、v） 蛋白质（hrv）（2）rna（hrv） 蛋白质（tmv）v用两种杂合病毒感染寄主：（1）表现tmv的典型症状病分离到正常tmv粒子（2）表现hrv的典型症状病分离到正常hrv粒子。v上述结果说明，在rna病毒中，遗传的物质基础也是核酸。5.1.1.3烟草花叶病毒的拆开与重组实验图5-4 tmv重建实验示意图 dna的组成元素的组成元素脱氧核苷酸脱氧核苷酸规则的双螺旋结构规则的双螺旋结构5.1.2dna结构与复制结构与复制dna的基本单位的基本单位dna的多样性的多样性dna的特异性的特异性碱基对的排列顺序千变万化碱基对的排列顺序千变万化特定的碱基排列顺序特定的碱基排列顺序dna的空间结构

13、的空间结构c、h、o、n、p5.1.2.1 dna的结构的结构脱氧核苷酸的结构与种类脱氧核苷酸的结构与种类脱氧核苷酸脱氧核苷酸脱氧核苷脱氧核苷磷酸磷酸脱氧核糖脱氧核糖含氮碱基含氮碱基嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶腺嘌呤腺嘌呤（a）鸟嘌呤鸟嘌呤（g）胞嘧啶胞嘧啶（c）胸腺嘧啶胸腺嘧啶（t）脱氧核苷酸种类脱氧核苷酸种类腺腺嘌呤嘌呤脱氧核苷酸脱氧核苷酸鸟鸟嘌呤嘌呤脱氧核苷酸脱氧核苷酸胞胞嘧啶嘧啶脱氧核苷酸脱氧核苷酸胸腺胸腺嘧啶嘧啶脱氧核苷酸脱氧核苷酸dnadna的空间结构的空间结构-规则的双螺旋结构规则的双螺旋结构1.dna分子是由两条反向平行的分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则脱氧核苷酸长链盘旋

14、而成的规则双螺旋结构双螺旋结构2.脱氧核糖与磷酸交替连结，排脱氧核糖与磷酸交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；碱基列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在链的内侧。排列在链的内侧。3.两条链上的碱基通过氢键连结两条链上的碱基通过氢键连结起来，形成碱基对。碱基对的组起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定成有特定的规律：即腺嘌呤一定与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤一定同与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤一定同胞嘧啶配对。胞嘧啶配对。dnadna就是脱氧核糖核酸（长链）就是脱氧核糖核酸（长链）腺嘌呤（a） 鸟嘌呤（g）胸腺嘧啶（t） 胞嘧啶（c）atcgaaattttttaaagggggcccccgc基因测序

15、基因测序就是读出就是读出 a-c-g-t-g-g-a-c-ga-c-g-t-g-g-a-c-g.每条多核苷酸链上均有四种碱基的结构每条多核苷酸链上均有四种碱基的结构利用碱基互补配对规律的计算利用碱基互补配对规律的计算5.1.2.1 dna5.1.2.1 dna的结构的结构规律一规律一：dna双链中的两条互补链的碱基相等，任意两个不互补的碱基之和恒等，占碱基总数的50%。即：a+gt+ca+ct+g50%，（a+g）/(t+c)(a+c)/(g+t)(t+c)/(a+g)1。规律二规律二：在dna双链中的一条单链的a+gt+c的值与另一条互补链的t+ca+g的值互为倒数关系。规律三规律三：dna

16、双链中，一条单链的a+tg+c的值与另一条互补链的a+tg+c的值是相等的，也与整个dna分子中的a+tg+c的值相等 。复制的时期复制的时期细胞分裂间期细胞分裂间期复制的场所复制的场所细胞核细胞核复制的模板复制的模板dna母链母链原材料原材料脱氧核苷酸脱氧核苷酸基本条件基本条件 模板、原料、酶、模板、原料、酶、atp复制过程复制过程解旋、碱基配对、聚合解旋、碱基配对、聚合复制特点复制特点边解旋边复制（过程）边解旋边复制（过程）半保留复制（结果）半保留复制（结果）遵循原则遵循原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则5.1.2.2 dna的复制的复制5.1.2.3 rnal核糖核酸（缩写为rna)，

17、存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸,因含核糖而得名,简称rna。rna普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内。rna和蛋白质生物合成有密切的关系。在rna病毒和噬菌体内，rna是遗传信息的载体。rna一般是单链线形分子;也有双链的如呼肠孤病毒rna；环状单链的如类病毒rna；1983年还发现了有支链的rna分子。5.1.2.3 rnalrna由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。rna的碱基主要有4种，即a腺嘌呤，g鸟嘌呤，c胞嘧啶，u尿嘧啶。其中，u（尿嘧啶）取代了d

18、na中的t胸腺嘧啶而成为rna的特征碱基。 5.1.2.3 rnal与dna不同，rna一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多rna也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。rna的碱基配对规则基本和dna相同，不过除了a-u、g-c配对外，g-u也可以配对。5.1.2.3 rnal在细胞中，根据结构功能的不同，rna主要分三类，l即trna（转运rna）, lrrna（核糖体rna）, lmrna（信使rna）。lmrna是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的dna所转录；trna是mrna上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rrna是组成核

19、糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。遗传物质存在方式 （1）细胞水平 从细胞水平看，无论是原核微生物还是真核微生物，遗传物质全部或大部分dna都集中在细胞核或核区中。不同的微生物细胞或是同种微生物的不同类型细胞中，细胞核的数目是不同的。在细菌和酵母菌中，尽管在高速生长阶段出现多核现象，但最终一个细胞只有一个核，部分霉菌和放线菌的菌丝细胞往往是多核的。 在真核微生物的细胞核中，dna与蛋白质结合在一起形成染色体，外包裹一层核膜，从而构成的在光学显微镜下清晰可见的完整细胞核。如霉菌、酵母菌、藻类和原生动物等。而原核微生物的细胞核无核膜，dna在细胞内以核质体的形式存在。如细菌、放线菌和蓝细菌等，也

20、有人把没有细胞结构的病毒称为原核微生物。 遗传物质存在方式 真核微生物的每个细胞核中的染色体数目较多，且其数目随着种类的不同而不同；而原核微生物中，核区只有一个由裸露的dna构成的，光学显微镜下无法看到的、一般呈环状的染色体。除此之外，染色体的套数也有不同。如果在一个细胞中只有一套相同功能的染色本，它就是一个单倍体。在自然界中发现的微生物，多数都是单倍体，高等动植物的性细胞都是单倍体；反之，包含着两套相同功能染色体的细胞，就称双倍体。如高等动植物的体细胞，少数微生物（如啤酒酵母）的营养细胞及由两个单倍体的性细胞接合或体细胞结合后所形成的合子等都是双倍体。 遗传物质存在方式 （2）分子在细胞核中

21、，微生物的遗传物质是核酸，除部分病毒（大多数为植物病毒）的遗传物质是rna外，大多数微生物的遗传物质是dna，即在dna大分子上存在着决定某些遗传性状的特定区段基因，它的物质基础是一个具有特定核苷酸顺序的核酸区段。一个基因是由若干个核苷酸碱基组成的三联密码子所构成的。 生物体内的无数蛋白质是生物体各种生理功能的执行者，但是蛋白质并不能自我复制，它是由dna分子结构上的遗传信息来合成的。 遗传物质存在方式 其过程是首先通过转录作用将dna上的遗传信息转录到mrna上去，形成一条与dna碱基互补的mrna链，然后再通过转译作用由mrna上的三联密码顺序去决定蛋白质上的氨基酸的排列顺序。这一过程就是

22、转录与翻译。dna上的特定的核苷酸排列如同遗传密码，负载了所有的遗传信息。 基因实际上是一个具有遗传功能的核酸片段，密码子则是遗传信息的信息单位，而构成核酸的基本单位则是核苷酸。在绝大多数生物的dna中，都只有四种核苷酸，它们之间唯一区别就是具有四种不同的碱基。 遗传物质存在方式水平5.2 微生物的基因突变基因突变指生物体内的遗传物质发生了稳定的可遗传的变化。它包括基因突变和染色体畸变。在微生物中，基因突变是最常见、最重要的。 5.2.15.2.1基因突变的类型基因突变的类型 （1）营养缺陷型 指微生物经基因突变引起的代谢障碍而必须添加某种营养物质才能正常生长的突变型。这种突变型在科研和生产中

23、具有重要的应用价值。 5.2.15.2.1基因突变的类型基因突变的类型 （2）条件致死突变型 指微生物经基因突变后，在某一条件下呈现致死效应，而在另一种条件下却不表现致死效应的突变型。如温度敏感突变型。 （3）形态突变型 指由于突变而引起的细胞形态变化或菌落形态的改变的非选择变异。如孢子有无、孢子颜色、鞭毛有无、荚膜有无、菌落的大小、外形的光滑、粗糙等。 （4）抗性突变型 由于基因突变而使原始菌株产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性的变异类型。根据其抵抗的对象又分抗药性、抗紫外线、抗噬菌体等突变类型。这些突变类型在遗传学研究中非常有价值，常被用作选择性标记菌种。 （3）形态突变型(菌落变异

24、)l细菌的菌落主要有光滑(smooth,s)型和粗糙(rough,r)型两种。s型菌落表面光滑、湿润、边缘整齐。经人工培养多次传代后菌落表面边为粗糙、干燥、边缘不整齐，称sr变异。粗糙型菌落粗糙型菌落光滑型菌落光滑型菌落5.2.15.2.1基因突变的类型基因突变的类型 （5）产量突变型 通过基因突变而获得有用的代谢产物在产量上高于原始菌株的突变株，也称高产突变株，这在发酵食品生产及抗生素生产中十分重要。但由于产量性状是由许多遗传因子决定的，因此产量突变型的突变机制是很复杂的，产量的提高也是逐步积累的。产量突变型实际上有两种类型：一类是某代谢产物比原始菌株有明显提高的，可称为“正突变”；另一类是

25、产量比其亲本有所降低，即称为“负突变”。 （6）其他突变型 如毒力、糖发酵能力、代谢产物的种类和数量以及对某种药物的依赖等的突变型。 5.2.2 5.2.2 突变的特点突变的特点1.1.不对应性不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。系。 （变量试验、涂布试验、平板影印培养试验）（变量试验、涂布试验、平板影印培养试验） 2.2.自发性自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。生。 3.3.稀有性稀有性：突变率低且稳定。突变率低且稳定。4.4.独立性独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。：各

26、种突变独立发生，不会互相影响。5.5.可诱发性可诱发性：诱变剂可提高突变率。：诱变剂可提高突变率。6.6.稳定性稳定性：变异性状稳定可遗传。：变异性状稳定可遗传。7.7.可逆性可逆性：原始的野生基因到变异株的突变称为正向突变，：原始的野生基因到变异株的突变称为正向突变，相反的过程则称为回复突变或回变。相反的过程则称为回复突变或回变。5.2.3 基因突变的机制基因突变的机制l5.2.3.1自发突变的机制l自发突变是指生物体在无人工干预下自然发生的低频率突变。随诱变机制的研究，对自发突变的原因已有所认识，下面讨论几种自发突变的可能机制。l1.背景辐射和环境因素的诱变 不少“自发突变”实质上是由一些

27、原因不详的低剂量诱变因素长期的综合效应导致。例如充满宇宙空间的各种短波辐射、高温的诱变效应以及自然界中普遍存在的一些低浓度的诱变物质的作用等。5.2.3.15.2.3.1自身突变的机制自身突变的机制l2. 微生物自身有害代谢产物的诱变 过氧化氢是普遍存在于微生物体内的一种代谢产物，它对脉孢菌具有诱变作用。这种作用可因同时加入过氧化氢酶而降低，如果同时再加入过氧化氢酶抑制剂，则又可提高突变率。这就说明，过氧化氢可能是自发突变中的一种内源诱变剂。在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株，可能也是同样的原因。l3. 由dna复制过程中碱基配对错误引起 据统计，dna链每次复制中，每个碱基对错误配对

28、的频率是10-710-11，而一个基因平均约含1000 bp，故自发突变频率约为10-6。因此，若对细菌做一般液体培养时，因其细胞浓度常可达到108个/ml，故经常会在其中产生自发突变株。.自身突变的机制自身突变的机制l背景辐射和环境因素的诱变l微生物自身有害代谢产物的诱变l由dna复制过程中碱基配对错误引起l互变异构效应l环状突出效应 5.2.3.15.2.3.1自身突变的机制自身突变的机制l4.互变异构效应互变异构效应l碱基t、g的第六位上是酮基，会以酮式或烯醇式两种互变异构的状态出现lc、a的第六位上是氨基，会以氨基式或亚氨基式两种互变异构的状态出现l平衡一般趋向于酮式或氨基式，在dna

29、双链结构中一般总是以at和gc碱基配对的形式出现l在偶然情况下，在dna复制到达这一位置的瞬间，在t以稀有的烯醇式出现时，其相对位置上就出现gl同样，如果c以稀有的亚氨基形式出现在dna复制到达这一位置的瞬间，则在新合成dna单链中与c相对应的位置上就将是a。这可能就是发生相应的自发突变的原因。l要预言在某一时间、某一基因发生自发突变是不可能的。在运用数学方法对这些偶然事件做大量统计分析后，可以发现并掌握其中的规律。5.2.3.15.2.3.1自身突变的机制自身突变的机制5.5.环出效应：l即环状突出效应。有人提出，在dna的复制过程中，如果其中某一单链上偶然产生一个小环，则会因其上的基因越过

30、复制而发生遗传缺失，从而造成自发突变。下图就是环出效应的设想机制。在上链中，标记b处发生“环出”，故只有a及c能获得复制， 从而发生自发突变。而在下链中，复制仍正常进行.5.2.3.2 诱发突变的机制诱发突变的机制l诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的任何理化因子，诱变剂的种类很多，作用方式多样。即使是同一种诱变剂，也常有不同的作用方式。5.2.3 基因突变的机制1.碱基置换（碱基置换（substitution）l定义：对dna来说，碱基的置换属于一种染色体的微小损伤（microlesion），一般也称点突变（point mutation）。它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。l分类：l

31、 转换（transition），即dna链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换；l 颠换（transversion），即一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换。l对某一具体诱变剂来说，可同时引起转换与颠换，也可只具其中的一种功能。根据化学诱变剂是直接还是间接地引起置换，可把置换的机制分成以下两类来讨论。直接引起置换的诱变剂直接引起置换的诱变剂l一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，n-甲基-n硝基-n-亚硝基胍，n-甲基-n-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，

32、从而引起dna复制时碱基配对的转换，并进一步使微生物发生变异。在这些诱变剂中，除羟胺只引起gca：t外，其余都是可使gc a:t发生互变的。能引起颠换的诱变剂很少，只是部分烷化剂才有。2.移码突变移码突变移码突变（frame-shift mutation）指诱变剂使dna分子中的一个或少数几个核苷酸的增添（插入）或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株（frame shift mutant）。与染色体畸变相比，移码突变也只能算是dna分子的微小损伤。 能诱发移码突变的几种代表性化合物引起移码突变的诱变剂：主要是吖啶类染料，如吖

33、啶黄、吖啶橙等等。这类化合物都是平面型的三环分子，它们的结构与一个嘌呤嘧啶对十分相似。丫啶类化合物的诱变机制丫啶类化合物的诱变机制l至今还不很清楚。有人认为，由于它们是一种平面型三环分子，结构与一个嘌呤嘧啶对十分相似，故能嵌入两个相邻dna碱基对之间，造成双螺旋的部分解开（两个碱基对原来相距0.34nm，当嵌入一个丫啶分子时，就变成0.68nm），从而在dna复制过程中，会使链上增添或缺失一个碱基，结果就引起了移码突变。丫啶类化合物诱发的移码突变及其回复突变图示：3.染色体畸变（chromosomal aberration）l某些理化因子，如某些理化因子，如x x射线等的辐射及烷化剂、亚硝射线

34、等的辐射及烷化剂、亚硝酸等，除了能引起点突变外，还会引起酸等，除了能引起点突变外，还会引起dnadna的大损的大损伤（伤（macrolesionmacrolesion）染色体畸变，它包括：染色体畸变，它包括：l染色体结构上的变化：染色体结构上的变化：l缺失（缺失（deletiondeletion）l重复（重复（duplicationduplication）l易位（易位（translocationtranslocation）l倒位（倒位（inversioninversion）l染色体数目的变化染色体数目的变化染色体结构上的变化染色体结构上的变化v染色体内畸变只涉及一条染色体上的变化，如发生染色体

35、的部分缺失或重复时，其结果可造成基因的减少或增加；又如发生倒位或易位时，则可造成基因排列顺序的改变，但数目却不改变。倒位是指断裂下来的dna片段旋转180后，重新插入到原来染色体的位置上；易位则指断裂下来的一小段染色体再顺向或逆向地插入到同一条染色体的其它部位上。v染色体间畸变，则指非同源染色体间的易位。染色体畸变染色体畸变紫外线（紫外线（u.v.，ultraviolet ray）对）对dna的损伤的损伤l嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多。嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物，其中了解较清楚的是胸腺嘧啶二聚体的形成和消除。紫外线的主要作用是使同链dna的相邻胸腺嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚

36、体，它的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而引起突变或死亡。在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少，但一旦形成，就会妨碍双链的解开，因而影响dna的复制和转录，并使细胞死亡。紫外线对dna的损伤及其修复l已知的已知的dna损伤类型很多，机体对其修复的方式也各异。发现较损伤类型很多，机体对其修复的方式也各异。发现较早和研究得较深入的是紫外线（早和研究得较深入的是紫外线（u.v.，ultraviolet ray）的作用。）的作用。l嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多。嘧啶的光化产物主要是嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多。嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物。

37、其中了解较清楚的是胸腺嘧啶二聚体的形成和二聚体和水合物。其中了解较清楚的是胸腺嘧啶二聚体的形成和消除。消除。l紫外线的主要作用是使紫外线的主要作用是使dna的相邻嘧啶的相邻嘧啶形成共价结合的形成共价结合的胸胸腺嘧啶二聚体腺嘧啶二聚体。二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。在变或死亡。在互补双链间互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少。但一旦形形成嘧啶二聚体的机会较少。但一旦形成，就会妨碍双链的解开，因而影响成，就会妨碍双链的解开，因

38、而影响dna的复制和转录，并使细的复制和转录，并使细胞死亡。胞死亡。光复活作用（photoreactivation）l定义：经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。l经紫外线照射后形成的带有胸腺嘧啶二聚体的dna分子，在黑暗下会被一种光激活酶（photoreactivating enzyme）即光裂合酶结合，当形成的复合物暴露在可见光（300500nm）下时，此酶会因获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体。与此同时，光激活酶也从复合物中释放出来，以便重新执行功能。每一e.coli细胞中约含有25个光激活酶分子。l由于一般的微生物中都存在着光

39、复活作用，所以进行紫外线诱变育种时，只能在红光下照射及处理照射后的菌液。图:光复活作用暗修复作用（dark repair）l又称切除修复（excision repair）。是活细胞内一种用于修复被紫外线等诱变剂（包括烷化剂、x射线和射线等）损伤后的dna的机制。这种修复作用与光无关。有四种酶参与在胸腺嘧啶二聚体的5一侧切开一个3-oh和5-p的单链缺口；从5-p至3-oh方向切除二聚体，并扩大缺口；以dna的另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3-oh端起逐个延长，重新合成一段缺失的dna链；通过的作用，把新合成的寡核苷酸的3-oh末端与原链的5-p末端相连接，从而完成了修复作用。暗修复作用（

40、dark repair）1、由、由核酸内切酶核酸内切酶切开二聚体切开二聚体的的5末端，形成末端，形成3-oh和和5-p的单链缺口的单链缺口2、核酸外切酶核酸外切酶从从5-p到到3-oh方向切除二聚体，并扩大缺口。方向切除二聚体，并扩大缺口。3、dna聚合酶聚合酶以另一条互补以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的链为模板，从原有链上暴露的3-oh端起合成缺失片段。端起合成缺失片段。4、连接酶连接酶将新合成的将新合成的3-oh与原有的与原有的5-p相连接。相连接。设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室等，紫外灯：波长为253、7nm, 功率是15w处理时的照射距离：20cm 30cm样品：要直接暴露在紫外

41、灯下，厚度不能超过3mm照射时，要用磁力搅拌器搅拌。处理剂量：常用照射时间或死亡率作为相对剂量。紫外诱变方法:由于微生物接受的照射剂量与灯的功率、照射距离、照射时间、菌液浓度、菌液厚度、细胞本身特性等因素有关，所以单纯用时间表示照射剂量并不完全可靠。一定的死亡率必定对应一定的照射剂量，所以，在实际应用中，用死亡率表示照射剂量更可靠。 通常先绘制照射时间与死亡率的关系曲线，然后选择合适的剂量。 生产上经常采用的剂量：死亡率为70%80%左右。重组修复：必须在dna复制的情况下进行，所以又叫复制后修复。细胞在不切除二聚体的情况下，以带有二聚体的这条链为模板合成互补单链，但在每个二聚体附近留有一空隙

42、。通过染色体交换，空隙部位就不在面对着胸腺嘧啶二聚体，而是面对着正常的单链，在这种条件下，dna聚合酶和连接酶起作用将空隙部位进行修复，重组修复中的dna损伤并没有去除，但随着微生物的传代繁殖，损伤的比例逐渐降低。l“sos”“sos”修复修复l“sos”为国际通用的呼救信号，为“save our soul”的缩写。“sos”修复是指细胞处于危急状态，即dna分子受到大范围损伤，而复制又受到抵制的情况，受到损伤的dna发出信号，诱导“sos”修复酶对dna损伤进行修复。5.3 微生物的基因重组微生物的基因重组l 基因重组又称为遗传重组，它是指把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分

43、子的重新组合后，形成新遗传型个体的过程。l 重组是分子水平上的概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交，而一般所说的杂交是细胞水平上的概念。l 杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交一种形式。真核微生物中的有性杂交，准性生殖以及原核微生物中的转化、转导、接合和溶原转变等都是基因重组在细胞水平上的反映。5.3.1原核微生物的基因重组5.3.1.1转化（transtormation）w转化过程：转化过程：w 从供体菌提取出转化因子双链从供体菌提取出转化因子双链dnadna片段；片段；w 双链双链dna dna 片段与感受态受体菌的细胞表面特定位点结合；片段与感受态受体菌的细胞表面特定位点结合；

44、w 在结合位点上，双链在结合位点上，双链dna dna 中的一条单链逐步降解，同时另中的一条单链逐步降解，同时另一条链逐步进入受体细胞。一条链逐步进入受体细胞。w 进入受体细胞的进入受体细胞的dna dna 单链与受体菌染色体组上同源区段配单链与受体菌染色体组上同源区段配对，而受体菌染色体组的相应单链片段被切除，并被进入受体对，而受体菌染色体组的相应单链片段被切除，并被进入受体细胞的细胞的dna dna 单链所取代，于是形成了杂种单链所取代，于是形成了杂种dna dna 区段；区段；w 受体菌染色体进行复制，其中杂种区段被分离成两个，一受体菌染色体进行复制，其中杂种区段被分离成两个，一个恢复，

45、一个形成一个转化子。个恢复，一个形成一个转化子。 l 受体菌直接吸收来自供体菌的dna 片段，通过交换组合把它整合到自己的基因组中，从而获得了供体菌的部分遗传性状的现象，称为转化。转化后的受体菌，称为转化子。供体菌的dna 片段称为转化因子。l 只有处于感受态的细菌才能接受转化因子，进行转化作用。 5.3.1.1转化5.3.1.2转导 (transduction)转导是以噬菌体为媒介，把一个菌株的遗传物质导入另一个菌株，并使这个菌株获得另一个菌株遗传性状。转导又分为普遍性转导和特异性转导。 普遍性转导(generalized transduction)是指转导型噬菌体能传递供体菌株任何基因。如

46、大肠杆菌p1噬菌体、伤寒沙门氏菌的p22噬菌体等都能进行普遍性转导。它的转导频率为10-510-8。能进行普遍转导的噬菌体，含有一个使供体菌株染色体断裂的酶。 5.3.1.2转导（transduction ） 当噬菌体dna被噬菌体蛋白外壳包裹时，正常情况下，是将噬菌体本身的dna包裹进蛋白衣壳内，但也有异常情况出现，供体染色体dna (通常和噬菌体dna长度相似)偶然错误地被包进噬菌体外壳，而噬菌体本身的dna却没有完全包进去，装有供体染色体片段的噬菌体称为转导颗粒。转导颗粒可以感染受体菌株，并把供体dna注入受体细胞内，与受体细胞的dna进行基因重组，形成部分二倍体。通过重组，供体基因整合

47、到受体细胞的染色体上，从而使受体细胞获得供体菌的遗传性状，产生变异，形成稳定的转导子。 5.3.1.2转导（transduction ） 特异性转导(specialized transduction)是指温和噬菌体侵染而形成的某一溶源细菌群被诱导裂解时，其中极少数个体的dna可能与噬菌体的dna发生若干特定基因转换，从而被整合到噬菌体的基因组上，当该噬菌体周到次感染受体细胞时，就使受体细胞获得了这一特定遗传现象。它的转导频率为10-6。特异性转导是在大肠杆菌k12的温和型噬菌体中被首次发现的。 5.3.1.3接合（conjugation ）l 通过供体细菌和受体细菌完整细胞间的直接接触而传递大

48、段dna 的过程，称为接合（有时也称杂交）。 l 在细菌中，接合现象研究最清楚的是大肠杆菌。发现能够进行接合现象的大肠杆菌有雄性与雌性之分，而决定它们性别的是由是否存在 f 因子所决定。l f 因子又称致育因子，是一种质粒，分子量为 5107 道尔顿l 雌性细菌不含f 因子，称为f - 菌株，l 雄性细菌含有游离存在的f 因子，称为f + 菌株，l当雄性细菌细胞中所含的f 因子被整合在细胞核的dna 上，不呈游离状态存在称为hfr 菌株（高频重组菌株）；l有时被整合在细胞核dna 上的f 因子，从dna上面脱落下来，呈游离存在，但在脱落时，f 因子有时能带一小段细胞核 dna。我们将这种含有游

49、离存在的但又带有一小段细胞核dna 的f 因子的细菌称为 f菌株。 雄性菌株与雌性菌株接合时，将产生三种不同的结果 f+ 菌株与f-菌株接合的结果是产生两个f+，其接合过程为：f+ 菌株的f因子的一条dna单链在特定的位置上发生断裂，断裂的单链逐渐解开，同时留下另一条环状单链为模板，通过模板的旋转，一方面解开的一条单链通过性纤毛而推入f-菌株中，另一方面，又在供体细胞内，重新组合成一条新的环状单链，以取代解开的单链，此即为滚环模型。在f-菌株细胞中，外来的供体dna单链上也合成一条互补的新dna链，并随之恢复成一条环状的双链f因子，这样，f-就变成了f+ 菌株。 f菌株与f- 接合产生二个f菌

50、株。 f+f- f+f hfr菌株(高频重组菌株)与f-菌株接合的情况比较复杂。接合结果也不完全一样。在大多数情况下，受体细菌仍是f-菌株，只有在极少数情况下，由于遗传物质转移的完整，受体细胞才能成为hfr菌株。其原因如下：当hfr菌株与f-菌株发生接合时，hfr染色体在f因子处发生断裂，由环状变成线状。紧接着，由于f因子位于线状染色体之后，处于末端，所以必然要等hfr的整条染色体全部转移完后，f因子才能进入到f-细胞。 而由于一些因素的影响，在转移过程中，hfr染色体常常发生断裂，因此hfr菌株的许多基因可以进入f-菌株，越是前端的基因，进入的机会越多，在f菌株中出现重组子的时间就越早，频率

51、也高。而对于f因子，其进入f-菌株的机会很少，引起性别变化的可能性也非常小。这样hfr与f-菌株接合的结果重组频率虽高，但却很少出现f+菌株。总之，通过hfr菌株与f-菌株接合，在大多数情况下，受体细菌仍然是f-菌株，只有在极少数情况下，由于遗传物质转移完整，受体细胞才能成为hfr菌株。 hfr+f-hfr+f- hfr+f-hfr+hfr 5.3.1.4溶源性转变 宿主菌在感染温和噬菌体后，由于噬菌体dna整合到核dna后，导致宿主菌某些新的遗传性状表达，即所谓溶源性转变。这是一种与转导相似但又有本质不同的现象。溶源转变与转导在本质上的不同，首先是它的温和噬菌体不携带有任何供体菌的基因，其次

52、这种噬菌体是正常的完整的，而不是异常情况下产生的缺陷型噬菌体。 溶源转变的典型例子是不产毒素的白喉棒状杆菌（lorynebatcerium diphthariac）菌株被噬菌体侵染而发生溶源化时，会变成产毒素的致病菌株。其他如沙门氏菌、红霉菌、链霉菌等也具有溶源转变的能力。5.3.2 噬菌体的基因重组噬菌体的基因重组l 噬菌体原来指细菌病毒，近年来发现真菌、藻类都有噬菌体。病毒属于原核生物，是化学成份最简单的生物，它没有一般的细胞结构，它的染色体和细菌一样并不和蛋白质结合在一起。它具有寄生专一性，只能在寄主细胞内繁殖。它可以离开寄主细胞而存活，可是不能繁殖。由于病毒的简单的体制和它与寄主细胞的

53、特殊关系，它已成为分子遗传学研究中最普遍采用的材料之一。病毒的研究对认识遗传物质的本质有着重要的作用，在遗传工程的研究中它也是一种重要的工具。 噬菌体就它的化学本质来讲，有rna噬菌体、dna噬菌体、单链噬菌体、双链噬菌体等，就它和寄主的关系来讲，可以分为烈性噬菌体和温和性噬菌体两大类 l5.3.2.1 烈性噬菌体 20世纪40年代在大肠杆菌t2噬菌体中首次发现了噬菌体的基因重组。t2噬菌体有许多突变型，最早发现的有快速溶菌(r)、寄主范围(h)、小形噬菌斑（m）等突变型。寄主范围(h)可以感染野生型细菌和抗t2细菌 (用b2表示)，h+只能感染野生型大肠杆菌b品系；r为快速溶菌突变型，能产生

54、大噬菌斑，r+为迟缓溶菌，生成小的噬菌斑。当h+r(寄主范围正常，但具速溶性状)和hr+(无速溶性状，但寄主范围扩大)两种噬菌体同时感染大肠杆菌b品系，然后把子代噬菌体接种在同时长有大肠杆菌b和b2两种菌组成的混合菌平板上，结果出现四种不同的噬菌斑(图517)。在四种噬菌斑中，透明而小(hr+)和半透明而大(h+r)是亲本组合，半透明而小(h+r+)和透明而大(hr)是重组类型。 l5.3.2.2 温和性噬菌体 l温和性噬菌体跟f因子一样，宛如附加的细菌基因群，既能以自主的自我复制颗粒存在，也可以插入细菌染色体与其一起复制。噬菌体是最著名的温和性噬菌体。 l当侵染大肠杆菌时，发生两种反应：一种

55、是裂解性反应，和烈性噬菌体侵染敏感细菌所进行的反应相同。在寄主体内，侵染的噬菌体dna立即复制，合成头部和尾部，装配成成熟的噬菌体颗粒，裂解寄主细胞，释放出几百个成熟的噬菌体。另一种是溶源反应。侵染的噬菌体进入寄主细胞后，其dna可以整合到寄主细胞染色体上，成为细菌染色体的一部分，以原噬菌体形式存在于细胞中，使细菌溶源化，这种状态的温和噬菌体又称为原噬菌体。受噬菌体侵染的大肠杆菌的裂解只是一小部分，其裂解的确切频率部分依赖于噬菌体和寄主的基因型，部分依赖于侵染的环境条件，其余大部分细菌则进入溶源反应。原噬菌体能够自发的诱变成成熟的噬菌体颗粒而裂解寄主细胞，紫外线是一种有效的诱发因素。 l 在微

56、生物的有性繁殖过程中，不同的性细胞间的接合，并随之发生染色体的重组，从而产生新遗传型后代的现象，称有性杂交。l 凡是能产生有性孢子的酵母菌和霉菌，都能进行有性杂交。l 有性杂交在生产实践中被广泛用于优良品种的培育。例如用于酒精发酵的酵母菌和用于面包发酵的酵母菌同属一种啤酒酵母（saccharomyces cerevisiae）的两个不同菌株，面包酵母的特点是对麦芽糖及葡萄糖的发酵力强，产生 co2 多，生长快；而酒精酵母的特点是产酒率高而对麦芽糖、葡萄糖的发酵力弱，所以酿酒厂生产酒精后的酵母，不能供面包厂作引子用。通过两者的杂交，就得到了既能生产酒精，又能将其残余菌体用作面包厂和家用发面酵母的

57、优良菌种。5.3.3.15.3.3.1有性杂交有性杂交5.3.3真核微生物的基因重组真核微生物的基因重组5.3.3.2准性生殖l是一种类似于有性生殖但比它更为原始的一种生殖方式。是由两个非异配型核的细胞接合后，形成异核体细胞，两核能发生低频率的接合与交换，产生具有新性状的个体。l1菌丝联结 发生在一些形态上没有区别的，但在遗传性状上可以有差别的两个同种亲本的体细胞（单倍体）间。 l2形成异核体 两个单倍体细胞经联结后，使原有的两个单倍体核集中到同一个细胞中，形成双相的异核体。异核体能够独立生活。l l3核融合 在异核体中的双核融合，产生双倍体杂合子核。核融合后产生杂合子核的频率也是极低的，如构

58、巢曲霉和米曲霉为 10-510 -7 。l4体细胞重组和单倍体化 双倍体的杂合子极不稳定，在进行有丝分裂时，极少数核中的染色体会发生染色体交换和单倍体化，从而形成极个别具有新遗传性状的单倍体杂合子。5.4 微生物的菌种选育 菌种选育，就是利用微生物遗传物质变异的特性，采用各种手段，改变菌种的遗传性状，经筛选获得新的适合生产的菌株，以稳定和提高产品质量或得到新的产品。 良好的菌种是微生物发酵工业的基础。在应用微生物生产各类食品时，首先是挑选符合生产要求的菌种，其次是根据菌种的遗传特点，改良菌株的生产性能，使产品产量、质量不断提高。如发现菌种的性能下降时，还要设法使它复壮。最后还要有合适的工艺条件

59、和合理先进的设备与之配合，这样菌种的优良性能才能充分发挥。 5.4 5.4 微生物的菌种选育微生物的菌种选育l在微生物工业应用中， 微生物菌种工作主要包括以下四方面：l 菌种的分离筛选：挑选符合生产要求的菌种，这是选种工作的任务。l 菌种培育： 改良已有菌种的生产性能，使产品的质和量不断提高，或使它更适应于工艺的要求，这是育种工作的任务。l 菌种的保藏： 一切生产菌种都要使它避免死亡和生产性能的下降，这是菌种保藏工作的任务。l 退化菌种的复壮： 如果发现菌种的生产性能下降，就要设法使它恢复，这便是菌种复壮工作的任务。5.4.1 从自然界中分离筛选菌种的方法步骤5.4.1.1 采样 以采集土壤为

60、主，也可以从植物腐败物及某些水域中采样。从何处采样，这要根据选菌的目的、微生物的分布状况及菌种的特征与外界环境关系等，进行综合地、具体地分析来决定。 由于土壤是微生物生活的“大本营”，其中包括各种各样的微生物，但微生物的数量和种类常随土质的不同而不同。一般在有机质较多的肥沃土壤中，微生物的数量最多，中性偏碱的土壤以细菌和放线菌为主，酸性红土壤及森林土壤中霉菌较多，果园、菜园和野果生长区等富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，浅层土比深层土中的微生物多，一般离表层515cm深处的微生物数量最多。 5.4.1 从自然界中分离筛选菌种的方法步骤 采样应充分考虑采样的季节性和时间因素，以温度